可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双功能融合受体、 其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所 致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗 效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、 化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法 均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管 的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果 没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过l 2mm，转移则无法实现。血管内皮 生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高 血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激 活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨 噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细 胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长,并提高血管通 透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有 利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管,促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管 生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌 新药Avastin (抗VEGF人源化抗体)已于20Q4年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的
治疗。此外，用可溶性受体阻断VEGF和VEGFR的传导途径也被证明是一种行之有 效的方法。VEGF家族包括VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E及PIGF(胎盘 生长因子)，它们之间的氨基酸序列高度同源，都与同型的酪氨酸激酶受体结合。 血管内皮生长因子受体(VEGFR)属于酪氨酸激酶受体超家族，它们有相似的结 构，均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。目前发现的VEGFR主要有3种 VEGFRl(Flt-1) ， VEGFR2(KDR)， VEGFR3。与VEGFR1结合的主要是VEGF、 VEGF-B， 与VEGFR2结合的主要是VEGF、 VEGF-C、 VEGF-D、 VEGF-E，与VEGFR3结合的主要 是VEGF-C、 VEGF-D。 VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤血管内皮细胞表面，VEGFR1 主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移，VEGF对内皮细胞的增殖、分化由VEGFR2 介导。VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中，在动脉、静脉、毛细血管内皮中基 本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号系统发挥作 用，从而导致肿瘤淋巴管的增生和淋巴结的转移[NeufeldG等，FASEBJ， 1999， 13: 9—22]。 Regeneron制药公司将VEGFRl膜外区与抗体Fc进行融合，制备了 VEGFR-Fc融合蛋白，它能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和 VEGF-B，从而抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻断新生血管的形成，实验结果 表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更强的抗肿瘤作用[Wulff C等，J Clin Endocrinol Metab. 2001， 86 (7) : 3377-86. Holash J等，PNAS 2002 ，17: 11393 - 11398]。但是，无论是Avastin还是VEGFR1-Fc都是通过阻断VEGF或/和 VEGF-B所诱导的生物学功能，即抑制肿瘤的血管生成来发挥抗肿瘤作用。它们 均不能与VEGF-C或VEGF-D相结合，而VEGF-C和VEGF-D可诱导肿瘤内淋巴管生成， 进而促进肿瘤淋巴结转移，所以它们不能抑制肿瘤淋巴结转移。
因此，研究出既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和VEGF-B， 还能与VEGF-C或VEGF-D相结合，从而不仅抑制VEGF和VEGF-B的生物活性，阻断 新生血管的形成，还能阻断VEGF-C和VEGF-D对肿瘤内淋巴管生成的诱导，防止 肿瘤淋巴结转移的高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容
本发明公开了
1. 一种可溶性双功能VEGFR融合受体，为包含VEGFR1和VEGFR3在内的融合蛋 白，既能与VEGF和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合。
2. 上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRIg，其轻链的氨基酸序 列为SEQ ID N0:8所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID N0:10所示的。
3. 上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的突变体，为VEGFRIgM， 其轻链的氨基酸序列为SEQ ID N0:14所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10 所示。
4. 上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRFc，其特征在于有两 个相同的多肽链通过二硫键结合，其中多肽链的氨基酸序列为SEQ ID N0:12所 示。
5. —种分离的核酸分子，编码上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受 体。
6. —种分离的核酸分子，编码上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg，其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:7，编码重链的核苷酸序列 为SEQ ID NO:9。
7. —种分离的核酸分子，编码上述3所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg的突变体VEGFRIgM,其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:13,编 码重链的核苷酸序列为SEQ ID N0:9。
8. —种分离的核酸分子，编码上述4所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRFc中的多肽链，具有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。9. 一种载体，含有上述5、 6、 7、 8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列 操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl， pcDNA3. 1 ( + )， pc薩3. 1/ZE0(+) ， pDHFR之一。
10. 上述9所述的载体，为pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0(+)。
11. 一种宿主细胞，含有上述9所述的载体，为真核细胞。
12. 上述ll所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。
13. 上述12所述的宿主细胞，为CH0细胞。
14. 一种制备上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体的方法，该方法 包括
a) 在表达条件下，培养上述11-13任一所述的宿主细胞，表达双功能融合 受体，
b) 分离或纯化所述的双功能融合受体。
15. —种组合物，含有上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体和药学 上可接受的载体。
16. 上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体在制备抗肿瘤药物中的 用途。
17. 上述15所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
18. 上述16、 17任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
任何编码VEGFR1和VEGFR3的合适的DNA都适合于本发明，这样的结构包 括从RT — PCR激活的淋巴细胞mRNA中分离得到的VEGFR1，从根据 embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成的VEGFR 3 ，或从其他cDNA文库中 获得的。
本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDRl (如图1)， pCDNA3. 1， pDHFF之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的融合蛋白的表达，
COS ，CH0，NS0， sf9及sf21等均可适用于本发明。
可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a， BL21(DE3)，TG1 之一。
本发明中公开的V E G F R双功能融合受体的制备方法为在表达条件下， 培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合受体，分离或纯化所述的双功能融 合受体。
利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE 电泳上为单一条带。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所 利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗 脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
在本发明的一个实施例中，本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融合受 体蛋白VEGFRIg是通过以下方法得到的VEGFR 1基因是通过RT—PCR激活的淋 巴细胞mRNA中分离得到的，VEGFR3基因根据embl | AR860556 | AR860556中序列 全基因合成，VEGFR 1基因信号肽和I g 2-3区与轻链恒定区(k constant region) 基因连接，并且被克隆到pDRl载体的HinD工ll和EcoRI酶切位点之间，VEGFR3 基因信号肽和I g卜2区与重链恒定区(I gGl constant region)基因连接， 同样被亚克隆到另一pDR载体的HinDIll和EcoRI酶切位点之间。上述质粒一 起用脂质体法转染CHO-Kl细胞，并用含600u g/ml G418和250p g/ml Zeocin 的选择培养基筛选稳定表达可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的细胞克 隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化可溶性双功能 VEGFR融合受体蛋白VEGFRIg。在本发明的另一个实施例中，公开了上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋
白VEGFRFc的制备方法，为将上述获得的VEGFR3基因信号肽和I g 1_2区与 VEGFR 1基因I g 2-3区用overlapPCR的方法连接，再将获得的融合基因的3' 端与人抗体Fc基因(SEQ ID N0:5)相连，并且被克隆到pDRl载体的HindI工I 和EcoRI酶切位点之间。上述质粒用脂质体法转染CH0-Kl细胞，并用含600 u g/ml G418的选择培养基筛选稳定表达可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRFc 的细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化可溶 性双功能VEGFR融合受体蛋白VEGFRFc。
发明的申请人对上述的可溶性双功能VECFR融合受体进亲和力检测、抑制 HUVEC细胞增殖、体内抑瘤和抑制肿瘤转移等实验，实验结果表明，本发明公开 的可溶性双功能VEGFR融合受体可以与VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D结合， 同时具有可溶性VEGFR1和VEGFR3的功能，可以结合VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C、 VEGF-D四种血管内皮生长因子，阻断其信号传导通路。 一方面，它能够能阻断 血管内皮细胞的活化，增值，分化和迁移，既阻断肿瘤中新生血管的形成、减 少肿瘤的供血和供氧，限制肿瘤的生长，又能降低血管通透性，减少肿瘤通过 血管发生转移的机会。另一方面，它能够阻断淋巴内皮细胞的激活，阻断肿瘤 中新生淋巴管的形成，阻止肿瘤细胞顺淋巴管转移的功能。这样，就几乎全部 阻断VEGF/VEGFR传导途径，阻断肿瘤中内皮细胞分裂增殖、抑制新生血管的形 成、降低血管通透性、减少肿瘤的供血和供氧，同时也可阻断肿瘤内淋巴管生 成，抑制肿瘤的淋巴管转移，产生更强的抗肿瘤治疗疗效。此外，这个双功能 融合受体VEGFR1/VEGFR3-Fc将具有比VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更大的分子量， 因而其半衰期将明显延长，实验表明，在相等剂量下，双功能融合受体具有比联合应用VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更好的抗肿瘤治疗效果。
本发明公开上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋白，可以和药学上可以接 受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证 本发明公开的融合受体蛋白氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白 质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对 于液体制剂，通常可以在2。 C-8。 C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂， 在30° C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、 冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述可溶性双功能VECFR 融合受体蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶 液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型 表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80);poloxamer(如poloxamer 188); Triton;十二烷基硫酸钠(SDS);月桂硫酸钠；十四垸基、亚油基或十八 垸基肌氨酸；Pluronics; MONAQUATTm等，其加入量应使双功能VECFR融合受 体蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性 糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、 聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域 的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、 甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含双功能VECFR融合受体蛋白的组合物，在对包括人在内的 动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以 作为抗肿瘤药物使用。
本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤 组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、 心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、 唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基 底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统 肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再 一一列举。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴 随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包 括己存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止 转移。
本发明中双功能VECFR融合受体蛋白及其组合物在对包括人在内的动物给
药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异， 可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静
脉注射的剂量是1 1800mg/天。
本发明公开的双功能VECFR融合受体蛋白及其组合物还可以和其他的抗肿 瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作 用于DNA化学结构的药物垸化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂 类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC); (2)影响核酸合成 的药物二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核 苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、 FT—207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成 酶抑制剂如6 —巯基嘌呤(6—MP)和6—TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基 脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3) 作用于核酸转录的药物选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合 酶，从而抑制RNA合成的药物如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、 阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药 门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔 芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等； 抗雄激素氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂诺雷德、依那通等；3、生物反应调 节剂主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素一2 ;胸腺肽类; 4、单克隆抗体美罗华(MabThera) ; Cetuximab (C225);赫赛汀(Trastuzumab) Bevacizumab (Avastin) ;5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物； 细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双功能VECFR融合 受体蛋白及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。


图l pDRl表达载体结构示意图，hCMV表示人巨细胞病毒Major Immediate早期
启动子；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信号；SV40 ori表示
SV40病毒早期复制起点；DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pUC origin为质粒复
制起点；AMP为氨苄青霉素抗性基因；
图2.VEGFRIg-L基因结构示意图3. VEGFRIg-H基因结构示意图4 VEGFRIg双功能融合受体结构示意图5 . VEGFRFc基因结构示意图;
图6 VEGFRFc双功能融合受体结构示意图7.双功能融合受体与VEGF-A结合力实验；
图8.双功能融合受体与VEGF-C结合力实验；图9.双功能融合受体与VEGF-A的竞争抑制曲线；
图IO.双功能融合受体与VEGF-C的竞争抑制曲线；
图ll.双功能融合受体抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖活性实验
图12.双功能融合受体抑制VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖活性实验
图13.双功能融合受体体内血药浓度时间曲线
图14.可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长曲线
具体实施例方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的 限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方 法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞 的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在 许多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J. ， Fritsch， E. F. and Maniais， T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring Harbor Laboratory Press. 实施例1.人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产 品)提取总RNA，根据文献(Cell， 1980,22: 197-207)和文献(Nucleic Acids Research, 1982， 10: 4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻 链恒定区基因，并用引物FC有义GAAGCTTAATAATGGCCCGGGCGAGCCCAAATC TTGTGAC和FC反义CGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增抗体Fc区。PCR反应均 采用热启动，反应条件94。C分钟；94aC 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30个循环；72。C10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T 载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2分别 显示了重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4 分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ IDN0:5和SEQ IDN0:6 分别显示了 Fc区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作 pGEM-T/CH、 pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。 实施例2:可溶性双功能VEGFR融合受体的构建
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产 品)提取总 RNA， 以引物 VEGFR11 有义
TGCTTCTCACAGGATCTAGTTCAGGTTCAAAATTAAAAGATCCTG ，VEGFR12反义
司合成)，做RT — PCR获得VEGFR1基因I g 1-3区，装入PGEM-T载体 (PGEM-T/VEGFR1)， VEGFR3基因根据embl | AR860556 | AR860556中序列请上海 生物工程技术服务有限公司全基因合成，VEGFR l基因信号肽(以引物VEGFRll 有义 TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGAC;VEGFRll 反义 A CGAAAGGTCTACCTCCGGAACTAGATCCTGTGAGAAG以PGEM-T/VEGFR 1为模板扩增)和I g 2-3 区(以引物 VEGFR12有义TCCGGAGGTAGACCTTTCG; VEGFR 12 反
PGEM-T/VEGFR1为模板扩增)与人抗体轻链恒定区(k constant region)基因(以 引物LC有义ACTGTGGCTGCACCATCTGT; LC反义GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG 以pGEM-T/CL为模板)以overlapPCR连接(序列见SEQIDNO: 1 )，并且被克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，挑选阳性克隆，测序正确，以HinDIII 和EcoRI酶切(Promega公司产品)，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得lkb的酶 切片断与同酶切的质粒pDRl(图7)用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品) 进行连接，构建成真核表达载体pDR(VEGFRIg-L)。图2为VEGFRIg-L的基因结 构图。SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8分别显示了 VEGFRIg-L的核苷酸和氨基酸 序列。
VEGFR3基因信号肽和I g 1-2区(以引物VEGFR31有义
TGGACGGCCTGGTGAGTGACTACTCCATGACCCCCCCGACCTTGAACATC ; VEGFR31反义 AGCTAGCGCCTGTGATGTGCACCAGGAAG,以PGEM-T/VEGFR1为模板扩增)，经琼脂糖 凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选 阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HindIII和NheI双酶消化，回收700bp酶 切片断与与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HinDI11和EcoRI 酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收2.3kb片段，与同酶切的质粒pDRl(图9)用 T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体 pDR(VEGFRIg-H)。图3为VEGFRIg- H的基因结构图。SEQ ID N0:9和SEQ ID NO: 10 分别显示了 VEGFRIg- H的核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3 X 105 CHO-Kl细胞，细胞培养至90%-95% 融合时进行转染取质粒10ug(质粒pDR(VEGFRIg-H)4ug，质粒pDR (VEGFRIg-L) 6 u g)禾口 20 u 1 Upofectamine2000 Reagent [Invitrogen公司产 品]分别溶于500u 1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混 合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到 板中，C02孵箱培养4小时后补加2ml含l(B血清的匿EM完全培养基，置于C02 孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600[jg/ml G418和250|jg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达 克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4。C过夜，用2%BSA-PBS于37°C 封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgGl， k) ， 37°C孵 育2小时，加入服P-小鼠抗人IgG (CH3)进行结合反应，37°C孵育1小时，加 入TMB于37°C作用5分钟，最后用H2S04终止反应，测OD，值。将筛选得到的高 表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离 纯化VEGFRIg融合受体，经测序，和SEQ ID N0:8、 SEQ ID NO:IO序列一致， 将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图4为VEGFRIg融 合受体结构图。
上述获得的VEGFR3基因信号肽和I g 1-2区与VEGFR 1基因I g 2-3区用 overlapPCR的方法连接，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1. 3kb并且被克隆到 pGEM-T载体体(Promega公司产品)中，挑选阳性克隆，测序正确，以HinDIll 和Smal双酶切(Promega公司产品)，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1. 3kb 的酶切片断N端连接PGEM-T/Fc ( I gGl Fc) (Sequence 9)，挑选阳性克隆，， 以HinDIll和EcoRI双酶切(Promega公司产品)，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收 获得2kb的酶切片段与同酶切的质粒pDRl用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司 产品)进行连接，构建成真核表达载体pDR (VEGFRFc)。图5为VEGFRFc的基因 结构图。SEQ ID NO: 11禾卩SEQ ID NO: 12分别显示了 VEGFRFc的核苷酸和氨基 酸序列。于3.5cm组织培养皿中接种3 X 105 CH0-Kl细胞，细胞培养至90 % -95 %融合时进行转染取pDR (VEGFRFc)质粒10 y g和20 u 1 Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500ul无血清 DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使 DNA-脂质体复合物形成，其间用3rnl无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血 清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，C02孵箱培养4小时后 补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基，置于COj瞎箱中继续培养。转染进行24h 后细胞换含600|jg/ml G418的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用 ELISA检测筛选高表达克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4°C过夜， 用2%BSA-PBS于37°C封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgGl，K)， 37。C孵育2小时，加入服P-小鼠抗人IgG (CH3)进行结合反应，37。C 孵育1小时，加入TMB于37。C作用5分钟，最后用H2S04终止反应，测OD祝)值。 将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE 公司产品)分离纯化VEGFRFc融合受体，经测序，与SEQ ID N0:12序列一致， 将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图6为VEGFRFc融 合受体结构图。
以 pDR(VEGFRIg-L)为模板，以引物 VEGFR1LCM 有义tccgt aGAGGACCTGattgaccaaagcaattccc 禾Q VEGFR1LCM 反 义 GGTCAATCAGGTCCTCTACGGAAGCTCTCTTATTT为点突变引物，以引物VEGFR1LC有义 Gadget tgccgccgtccatggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtc tgcttctcacaggatctagttccggaggtagacctttcgt;Lc antisense:
GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG为首尾引物，用overlap的方法进行点突变，扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司 产品)中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HinDIII和EcoRI酶切， 经琼脂糖凝胶电泳纯化回收lkb片段，与同酶切的质粒pDRl(图1)用T4 DNA 连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体 pDR(VEGFRIg-LM) 。 SEQ工D N0:13和SEQ ID NO: 14分别显示了 VEGFRIg-LM的 核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3 X 105 CH0-K1细胞，细胞培养至90%-95% 融合时进行转染取质粒10ug(质粒pDR(VEGFRIg-H)4ug，质粒pDR (VEGFRIg-LM)6u g)禾口 20 ti 1 Lipofectamine2000 Reagent [Invitrogen公司产 品]分别溶于500yl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混 合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM 培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到 板中，C02孵箱培养4小时后补加2ml含10。/。血清的DMEM完全培养基，置于C02 孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600|jg/ml G418和250|jg/ml Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达 克隆小鼠抗人IgG (CH2)包被于ELISA板，4°C过夜，用2%BSA-PBS于37°C 封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgGl， k) ， 37°C孵 育2小时，加入HRP-小鼠抗人IgG (CH3)进行结合反应，37。C孵育l小时，加 入TMB于37°C作用5分钟，最后用H2S04终止反应，测OD柳值。将筛选得到的高 表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离 纯化VEGFRIgM融合受体，经测序，与SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 10序列一致， 将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。实验例
实验例1:可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验-ELISA法
实验步骤分别将VEGF、 VEGF-C (腿D公司产品)用O. 05mmol/L碳酸钠.碳 酸氢钠缓冲液(pH 9. 6)稀释成2ug/ml， 100 ul /孔，4。C包被过夜。3%脱脂 奶室温封闭2h后，加入不同浓度的可溶性VEGFR融合受体VEGFRlFc、 VEGFR3Fc、 VEGFRFc、 VEGFRIg、 VEGFRIgM， 100u 1 /孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育 2 h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的服P标记的小鼠抗人IgG单抗 (DAKO公司产品)，50 ul/ L，室温孵育45 min。 PBS充分洗涤后，OPD避光显 色，加入2 mol/L H2S04终止反应后，置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国 BIO-TEK公司)中测定492 n m吸光度(A492)值。
实验结果如图7，图8所示。
实验结果表明可溶性VEGFR融合受体VEGFRIgM、 VEGFRIg可同时结合 VEGF-A、 VEGF-C，且结合力与VEGFRlFc和VEGFR3Fc相似，VEGFRFc与两者的结合 较弱。而VEGFRlFc仅能与VEGF-A结合，VEGFR3Fc仅能与VEGF-C结合。 实验例2:可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验
实验步骤不同量的可溶性VEGFR融合受体与50ng的VEGFRlFc(分别为AP标记 的VEGFR 1 Fc (见文章Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ . Takayama， -K， Cancer-Res. 2000 Apr 15; 60(8): 2169-77 )、 VEGFR 3 Fc(见文章Inhibition of l卿hangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF rec印tor-3 TAIJA MAKINEN NATURE MEDICINE 2001 4 7 199-205)混合并在室温湿育l个小时。将混合物转移到用VEGF165 (200ng/孔)或VEGF-C (200ng/ 孔)(R&D公司产品)包被的96孔微量滴定权并在室温继续温育2小时，然后将滴 定板洗5次，加入AP的底物以对结合的VEGFRFc— AP分子定量.然后计算IC 5 0，即，50%抑制VEGFR融合受体与VEGF结合所需要的VEGFR融合受体浓度。如 图9，图10所示，结果表明，可溶性VEGFR融合受体VEGFRIgM、 VEGFRIg既能竞争 性抑制VEGF-A与VEGFRlFc的结合，又能竞争性抑制VEGF-C与VEGFR3Fc的结合， VEGFRFc对两者也有一定的竞争抑制作用，而VEGFRlFc和VEGFR3Fc仅能抑制其相 应融合受体的结合
实验例3:可溶性双功能VEGFR融合受体抑制HUVEC细胞增殖实验
实验步骤取生长状态良好的HUVEC细胞，调整细胞浓度为2.5X104/ml，接 种于96孔细胞培养板，200ul/孔，于37。C、 5% C02孵箱中培养24 h后换无血清 培养基，继续培养72 h，加入不同浓度梯度的VEGFR融合受体，分别以 VEGFRlFc， VEGFR3Fc,无关抗体Rituximab为对照，每个浓度取3个平行孔，37°C 孵育l h，加入终浓度为25 ng/ml的VEGF-A或100 ng/ml的VEGF-C继续培养24 h 后，加入10ul[3 H]. TdR(18. 5 kBq/孔)，37。C孵箱中孵育7 h，细胞收集器收 集细胞于玻璃纤维滤膜上，采用[3H]液闪计数仪进行测定。如图ll，图12所示， 结果表明可溶性融合受体VEGFRIg、 VEGFRIgM可同时抑制VEGF-A、 VEGF-C引起的 HUVEC细胞增殖，VEGFRFc对两者也有一定的竞争抑制作用，而VEGFRlFc和 VEGFR3Fc只能分别抑制VEGF-A、 VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖的活性。 实验例4: VEGF受体融合蛋白药代动力学检测
实验步骤四周龄C57BL/6雌性小鼠(体重15-19g)皮下注射(s.c.) 60 u g (0.4ug / u 1*150 u 1)/mice①VEGFRlFc、②VEGFR3Fc、③VEGFRIg、④VEGFRIgM， PBS,分别于注射后lhr， 6 hr， 24hr， 48hr， 4d， 7d， 10d， 13d， 16d， 20d后取血，每只小鼠取血约100P1 (内眦静脉取血)加O. 1%的肝素混匀， 离心4000rpm*20min。取上清，弃沉淀。ELISA检测血浆中抗体的浓度(以小 鼠抗人CH3单克隆抗体包被96孔板，加血浆后，以服P标记的小鼠抗人CH2单克隆 抗体检测)。检测结果如图13所示，VEGFRIgM的体内半衰期较长，远远高于 VEGFRlFc。其24小时浓度达到最高，在6-48小时维持较高的浓度(6. 3-8. 5ug /ml)并持续到13天后仍有0.01ug /ml。
实验例5:可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长实验
实验步骤为检测可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑瘤活性，首先用LM3细胞 (人肝癌细胞)，接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心) 右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合受体 25mg/kg(VEGFRIgM、 VEGFRIg)及对照VEGFRlFc， VEGFR3Fc和PBS，然后隔天皮下 注射持续4周.6周后，每3天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积，结果如图14所示。 结果表明VEGFRIgM受体融合蛋组肿瘤大小显著小于VEGFRIg组及对照 VEGFRlFc，VEGFR3Fc和PBS组(P<0.01)，
实验例6:可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤转移实验
实验步骤用LM3细胞(人肝癌细胞)，接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军 医大学实验动物中心)右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合 受体25mg/kg(VEGFRIgM、 VEGFRIg)及对照VEGFRlFc， VEGFR3Fc和PBS，然后隔天皮 下注射持续4周.6周后处死小鼠，检测淋巴结转移数目及转移淋巴结的大小。 实验结果见表l
表l可溶性双功能融合受体抑制肿瘤淋巴转移活性(x士s， n=10)表转移的淋巴结计数及重量比较组别转移淋巴结数目/ 只(6只/组)转移淋巴结平均重 量(克)
PBS e6.0±1.01.3±0.4
阴性对照 Rituximab5,8±1.21.3±0.3
VEGFRlFc4.3±0.61.2 ±0.4
VEGFR3Fc b1.2 ±0.21.3±0.3
VEGFRIgM "0.5±0.21.0±0.2
VEGFRIg c0.3±0.11.1±0.3
注a， VEGFRIgM组与VEGFRlFc组，P=0.007; b， VEGFR3Fc组与VEGFRlFc 组，P=0.007; c， VEGFRIg组与VEGFRlFc组，P=0.008; d， VEGFRIg与 VEGFRIgM组，P=0.009; e，与阴性对照组，p>0.3。(非配对t检验) 上述结果表明，VEGFR融合受体可明显抑制肿瘤的淋巴结转移。 从以上实验结果可以看出，本发明公开的上述可溶性双功能VEGFR融合受体 达到了本发明的目的。SEQUENCE LISTING 〈110〉上海中信国健药业有限公司 上海国健生物技术研究院 〈120>可溶性V E G F R双功能融合受体、其制备方法及用途 <130〉 Wulff C等，J Clin Endocrinol Metab. 2001， 86(7) :3377-86 〈磨 14
<170> Patentln version 3.4 〈210〉 1 〈211〉 990 <212> 腦A
<213〉 Gammal chain constant region DNA sequence <400〉 1
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60
ggcacagcggccctgggctgcctggtc犯ggactacttccccg朋ccggtgscggtgtcg120
tggaactc已ggcgccctgaccsgcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180
ggactctactccctcagcagcgtggtg已ccgtgccctccagcagcttgggC3CCC3印CC240
tacatctgca3CgtgMtC3caagcccagcaacaccaaggtgg3C3卿gagttgagccc300
a犯tcttgtgcacatgcccaccgtgcccagcacctgaactCCtgggggg￡L360
ccgtcagtcttcctcttcccccca^33ccc■ggacaccctcatgatctcccggacccct420
g3ggtcacatgcgtggtggtggax;gtg兆ccacgaagaccctgaggtcaa gttcsactgg480
tacgtggacggcgtgg鄉tgwtaatgcca^gaca^gcCgCggg3gg3gC3gt3C犯C540
agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcacc鄉actggctg犯tggCMg600
gagtacaagtgcaaggtctxctcccagcccccatcgagaa aaccatctcc660
￡L￡L￡LgCC￡LeiELgggCELgCCCCg￡Lg8L8LCC￡lCaggtgtacaccctgcccccatcCCggg8L卿g720
stgacceLagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc780
gccgtggagtggg卿g,tgggcagccggag犯caact3ca^g3ccacgcctcccgtg840
ctggactccgacggctccttcttcctctatagc犯gctcaccgtggacaagsgc鄉tgg900
cagcaggggaacgtcttctxatgctccgtgctctgcacaaccactacacg960
cageieLgagcctctccctgtccccgggt犯a990
<210> 2
〈211〉 318
〈212> DNA
<213〉 Kappa chain constant region DNA sequence
<400〉 2
actgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagceigttgei肌1X"tggEi60
actgcctctgttgtgtgcctgctga^t肌cttctatcccag卿ggccaaagtacagtgg120
鄉gtggstaacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtc已cagagcaggacagc180
a3gg3cagc￡icctsc已gcctcagcagcaccctgacgctgagca幼gc3gsctacgagaaa240
cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgt300
ttcaacagggg卿gtgt318
〈210〉 3 〈211〉 693 <212〉 DNA<213〉 ■〉
ggcccgggcg gsactcctgg atctcccgga gtcaagttca gaggagcagt tggctg犯tg gagaaaacca ccatctcggg tatcccagcg accacgcctc gacaagagca CEicaaccact 〈210〉 4 <211〉 330 <212> PRT <213> Gammal chain 〈400〉 4 Ala Ser Thr
Gammal chain 3
agcccaaatc ggggsccgtc cccctgaggt actggtacgt
gca鄉agta tctccaaagc
3gg卿tg3C
acatcgccgt ccgtgctgga ggtggcagca 3cacgc3gaa
Fc region DNA sequence
ttgtgacaaa actcacacat agtcttcctc ttccccccaa ctgcgtg gtggtggacg ggacggcgtg gaggtgcEita gtaccgtgtg gtcagcgtcc caagtgcaag gtctccaaca caaagggcag ccccgagaac caagaaccag gtcagcctga ggagtgggag 3g認tgggc ctccgacggc tccttcttcc ggggaacgtc ttctcatgct gagcctctcc ctg
gcccaccgtg cccagcacct 60
33cccaagga csccctcatg 120
tgagccacga agaccctgag 180
atgccaagac aaagccgcgg 240
tcaccgtcct gcaccaggac 300
aagccctccc agcccccatc 360
cacaggtgta caccctgccc 420
cctgcctggt caaaggcttc 480
agccggagaa caactacaag 540
tctatagcaa gctcaccgtg 600
ccgtgatgca tgaggctctg 660
693
1
Ser Thr
Phe Pro
Gly Val 50 Leu Ser 65
Tyr lie
Ser
Glu
35
His
Gly
20
Pro
Gly 5
Gly
constant region amino acid sequence Pro Ser Val
Thr Ala Ala
Val Thr Val
Thr Phe Pro
Ser Val Val
Cys Asn
Arg Val Glu
Pro Ala
Lys Pro 130 Val Val 145
Tyr Val Glu Gin His Gin
Pro 115 Lys
Val
Asp
Tyr
Asp 195
Pro 100 Glu
Val 85 Lys
Thr
70
Asn
Ser
Ala
55
Val
His
Ser
40
Val
Phe
Leu
25
Trp
Pro 10 Gly
Leu Ala Pro Ser
Cys Leu Val
Asn Ser Gly
Leu Gin Ser
Pro Ser Ser
Cys Leu Leu Gly
Asp Thr Leu Asp Gly
Val
Asn 180 Trp
Val 165 Ser
Ser 150 Glu
Met 135 His
Lys
Asp
Gly 120 lie
Pro
lys 105 Pro
Ser
90
Thr
Ser
75
Asn
Ser 60 Leu
Ala
45
Gly
Lys
30
Leu
Ser
15
Asp
Lys Tyr
Thr Ser
Leu Tyr Ser
Gly Thr Gin Thr Lys Val His Thr Cys
Ser Val Phe
Ser Arg Thr
Glu Asp Pro
Val His Asn
Thr
Tyr Leu Asn Gly
Arg
Lys 200
Val 185 Glu
Ala 170 Val
Glu 155 Lys
Pro 140
Val
Thr
Leu 125 Glu
Pro 110 Phe
Asp
95
Pro
Thr
80
Lys
Cys
Pro Pro
Val Thr Cys
Lys Phe Asn Lys
Ser Val Leu
Tyr Lys Cys
Lys 205
Pro
Thr 190
Val
Arg 175 Val
Trp 160 Glu
Leu
Ser AsnLys Ala 210 Gin Pro 225
Met Thr
Pro Ser
Asn Tyr
Leu Tyr 290 Val Phe 305
Gin Lys
L>eu Pro
Arg Glu
Lys Asn
Asp lie 260 Lys Thr 275
Ser Lys Ser Cys Ser Leu
Ala
Pro
Gin 245 Ala
Thr
Leu
Ser
Ser 325
Pro
Gin 230 Val
Val
Pro
Thr
Val 310 Leu
lie 215
Val
Ser
Glu
Pro
Val 295 Met
Ser
Arg Val 1
Leu Lys
Pro Arg
Gly Asn
50 Tyr Ser 65
His Lys Val Thr
Ala
Ser
Glu
35
Ser
Leu
Val
Lys
Gly
20
Ala
Gin
Ser
Tyr
Ser 100
5
Thr
Lys
Glu
Ser
Ala
85
Phe
Ala
Val
Ser
Thr
70
Cys
Asn
Ser
Gin
Val 55
ILeu
Glu
Glu
Tyr
Leu
Trp
Val 280 Asp
His
Pro
Lys
Thr
Thr
Glu 265 Leu
Lys
Glu
Gly
Thr
Leu
Cys 250 Ser
Asp
Ser
Ala
Lys 330
lie
Pro 235 Leu
Asn
Ser
Arg
Leu 315
Ser 220 Pro
Val
Gly
Asp
Trp 300 His
Lys
Ser
!Lys
Gin
Gly 285 Gin
Asn
Ala
Arg
Gly
Pro 270 Ser
Gin
His
〈210〉 5 <211> 106 〈212〉 PRT
<213〉 K邵pa chain constant 〈400〉 5
Ala Pro Ser Val
Val
Trp
40
Thr
Thr
Val
Gly
Val
25
Lys
Glu
Leu
Thr
Glu 105
Phe 10 Cys
Val
Gin
Ser
His 90
Cys
Leu Leu Asn Asn 30
Asp Asn Ala Leu 45
Asp Ser Lys Asp 60
Lys Ala Asp Tyr 75
Gin Gly Leu Ser
<210> 6
〈211〉 231
〈212〉 PRT
〈213〉 Gammal chain
〈400〉 6
Gly Pro Gly Cys Asp 1 5 Glu Leu Leu Gly Gly 20
Asp Thr Leu Met lie
Fc Lys Pro Ser
Lys Gly
Glu Glu 240 Phe Tyr 255
Glu Asn
Phe Phe
Gly Asn
Tyr Thr 320
region amino acid sequence Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp
Glu Gin 15
Phe Tyr
Gin Ser
Ser Thr
Glu Lys
80 Ser Pro 95
region amino acid sequence
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
Ala Pro 15
Pro Lys Val Val35
Asp Val Ser His Glu 50
Gly Val Glu Val His 65
Asn Ser Thr Tyr Arg 85
Trp Leu Asn Gly Lys 100
Pro Ala Pro lie Glu 115
Glu Pro Gin Val Tyr 130
Asn Gin Val Ser Leu 145
lie Ala Val Glu Trp 165
Thr Thr Pro Pro Val 180
Lys Leu Thr Val Asp 195
Cys Ser Val Met His 210
Leu Ser !>eu Ser Pro 225
〈210> 7 〈211> 936 〈212〉 腿 〈213〉 VEGFRIg-L DNA sequence <400〉 7
tccgg已ggtagacctttcgtagtga犯tccccga已attatacacatgact60
g犯gg犯ggg3gctcgtcattccctgccgg gttacgtcacctaacatcactgttacttta120
3a3a^gtttccacttgacactttgatccctgatggaaa已cgcataatctg180
aagggcttc3tgcaacgtacggcttctgacctgtgaagca240
3C3gtc3atgggcatttgtatatctcacacatcg3c3a^ccaatacaatc300
atagatgtccaccacgccca gtcaaattacttELg3ggCC3360
ctcaattgtactgctaccactcccttgaacacgagagttcaa3tgacctggagttaccct420
ataagsgagcttccgta3ggcgacgaattgacca^gc^ttxccatgcc480
aacatattctacagtgttcttactattgac540
8LCt"tgtCg"tgt犯ggagtggaaatctgttaacacctcagtgcatatatat600
gcccgggcactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccstctgat660
gagcagttgsaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgsataacttctatcccaga720
ta^gtggaaggtggataacgccctccaatcgggt^ctcccagg卿gt780
gtcacagagcggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgsgc840
^agc3g3ctcaaagtctacgcctgcg犯gtcacccatcagggcctgagc900
Asp
Asn
70
Val
Glu
Lys
Thr
Thr 150 Glu
Leu
Lys
Glu
Gly 230
Pro
55
Ala
Val
Tyr
Thr
Leu 135 Cys
Ser
Asp
Ser
Ala 215 Lys
40 Glu
Lys
Ser
Lys
lie 120 Pro
Leu
Asn
Ser
Arg 200 Leu
Val Lys
Thr Lys
Val Leu
90 Cys Lys 105
Ser Lys
Pro Ser
Val Lys
Gly Gin 170 Asp Gly 185
Trp Gin
Phe
Pro
75
Thr
Val
Ala
Arg
Gly 155 Pro
Ser Gin His Asn His
Asn
60
Arg
Val
Ser
Lys
Glu 140 Phe
Glu
Phe
Gly
Tyr 220
45 Trp
Glu
Leu
Asn
Gly 125 Glu
Tyr
Asn
Phe
Asn 205 Thr
Tyr
Glu
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Lys 110 Gin
Met
Pro
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Leu 190 Val
Gin
Val
Gin
Gin
95
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Pro
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Phe Lys
Asp
Tyr
80
Asp
Leu
Arg
Lys
Asp 160 Lys
Ser
Ser
Sertcgcccgtca ca3agsgctt caacagggga gagtgt 〈210〉 8 <211〉 312 〈212〉 PRT
<213> VEGFRI g_L Amino acid sequence 簡> 8 Ser Gly Gly
936
1
lie
Ser
lie
lie
65
Thr
Thr
Leu
Leu
Lys 145 Asn
Lys
Val
Ala
Ser 225 Glu
Ser
Leu
Val
His
Pro
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Leu
Asn 130 Arg
lie
Gly
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Gin
Ser
Tyr 290
Met
Asn
35
Asp
Asn
Asn
Thr
Arg 115 Thr
Ala
Phe
Leu
Thr 195 Pro
Thr
Lys
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Thr
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lie
Gly
Ala
Gly
lie 100 Gly
Arg
Ser
Tyr
Tyr 180 Ser
Ser
Ala
Val
Ser 260 Thr
Cys
Pro 5
Glu
Thr
Lys
Thr
His
85
lie
His
Val
Val
Ser 165 Thr
Val
Val
Ser
Gin 245 Val
Leu
Glu
Phe
Gly
Val
Arg
Tyr
70
Leu
Asp
Thr
Gin
Arg 150 Val
Cys
His
Phe
Val 230 Trp
Thr
Thr
Val
Val
Arg
Thr
lie
55
Lys
Tyr
Val
Leu
Met 135 Arg
Leu
Arg
lie
lie 215 Val
Lys
Glu
Leu
Thr 295
Glu
Glu
Leu
40
lie
Glu
Lys
Gin
Val 120 Thr
Arg
Thr
Val
Tyr 200 Phe
Cys
Val
Gin
Ser 280 His
Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie
10 15 Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr 25 30 Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu 45
Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe lie 60
lie Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
75 80 Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin
90 95 lie Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys 105 110 Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro 125
Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn 140
lie Asp Gin Ser Asn Ser His Ala 155 160 lie Asp Lys Met Gin Asn Lys Asp
170 175 Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser 185 190 Asp Lys Ala Gly Pro Gly Thr Val 205
Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys 220
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 235 240 Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn
250 255 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 265 270 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 285
Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 300
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys305 310
<210〉 9
<211> 1602
<212〉 腿
<213> VEGFRIg-H DNA sequence:
<400> 9
3gtgactactccatgacccccccgaccttg犯catcacggcgtcatcgac60
accggtgacagcctgtccatctcctgcaggggacagcaccccctcgagtgggcttggcca120
ggagctcaggaggcgccagccaccggagac肌ggac3gcg鄉3C3Cgggggtggtgcga180
gcacagacgccaggccctactgcaaggtgttgctgctgca cgaggtacat240
gCC犯Cg3C3C3ggC3gCt3cgtctgctactacasgtacatcaaggcacgcatcgagggc300
acc3Cggccgccagctcctacgtgttcgtgagcagccatt360
cctgacacgctcttggtcaagCC3tgtgggtgccctgtctggtgtccatc420
cccggcctcaStgtC3CgCtgcgctcgcaaagctcggtgctgtggcc柳cgggcaggsg■
gtggtgtgggatgaccggcggggcatgctcgtgtccsicgcCELCtgCtgCSLcgatgccctg540
tacctgcagtgCg3g￡LCC￡lCctgggg卿ccaggacttcctttccaaccccttcctggtg600
cacEitcacaggcgctagcacca^gggccc3tcggtcttccccctggcaccctcctccaag660
agcacctctgggggC3C3gCggccctgggctgcctggtcaaggsctacttccccgaaccg720
gtgscggtgtcgtgg犯ctcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtc780
ctacagtcctCgLggSLCtctaCtCCCtCSLgCagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttg840
ggcacccag3cctacatctgcsacgtg犯tgC^C3CC犯ggtgg3C卿900
卿gttgagcccaaatcttgcacacatgcccaccgtgccc960
ctcctggggggsccgtcagtcttcctcttcCCCCC33肌Cccaaggacaccctcatgatc1020
tcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtgg3Cgtg3gCC3Cg犯g3ccctgaggtc1080
ggtacgtggacggcgtggetggtgcataatggccgcgggag1140
a_C￡LgC3cgtaccgtgtggtcagcgtcctceiccgtcctgcaCC3gg3Ctgg1200
ctg犯tggcagtg③ggtcccctcccagcccccatcgag1260
aaaaccat ct鄉gc叫ccccgagaaccaccctgccccca1320
tcccggg鄉agatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa aggcttctat1380
cccagcgacatcgccgtggaaatgggcagccggagaacaa1440
acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctstagcaagctcaccgtggac1500
ggC3gC鄉ggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatg3ggctctgcac1560
犯ccsctac3cgc卿卿gcctctccctgtccccgggta1602
<210〉 10 〈211〉 534 <212〉 PRT
〈213> VEGFRI g-H Amino acid sequence 〈400〉 10
Ser Asp Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn lie Thr Glu Glu Ser
15 10 15
His Val lie Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser lie Ser Cys Arg Gly Gin
20 25 30
His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gin Glu Ala Pro Ala Thr
35 40 45
Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu GlyThr
65
Ala
Arg
Phe
Lys
Val 145 Val
His
Phe
Gly
Gly 225 Val
Phe
Val
Val
Lys 305 Leu
Thr
Val
Val
Ser 385 Leu
50 Asp
Asn
lie
Glu
Asp 130 Thr
Val
Asp
Leu
Pro 210 Thr
Thr
Pro
Thr
Asn 290 Ser
Leu
Leu
Ser
Glu 370 Thr
Asn
Ala
Asp
Glu
Gin 115 Ala
Leu
Trp
Ala
Ser 195 Ser
Ala
Val
Ala
Val 275 His
Cys
Gly
Met
His 355 Val
Tyr
Gly
Arg
Thr
Gly 100
Pro
Met
Arg
Asp
Leu 180 Asn
Val
Ala
Ser
Val 260 Pro
Lys
Asp
Gly
lie 340 Glu
His
Arg
Lys
Pro
Gly
85
Thr
Phe
Trp
Ser
Asp 165 Tyr
Pro
Phe
L>eu
Trp 245 Leu
Ser
Pro
Lys
Pro 325 Ser
Asp
Asn
Val
Glu 405
Tyr 70
Ser
Thr
lie
Val
Gin 150 Arg
Leu
Phe
Pro
Gly 230 Asn
Gin
Ser
Ser
Thr 310
Ser
Arg
Pro
Ala
Val 390 Tyr
55 Cys
Tyr
Ala
Asn
Pro 135
Ser
Arg
Gin
Leu
Leu 215 Cys
Ser
Ser
Ser
Asn 295 His
Val
Thr
Glu
Lys 375 Ser
Lys
Lys
Val
Ala
Lys 120 Cys
Ser
Gly
Cys
Val 200 Ala
Leu
Gly
Ser
Leu 280 Thr
Thr
Phe
Pro
Val 360 Thr
Val
Cys
Val
Cys
Ser 105 Pro
Leu
Val
Met
Glu 185 His
Pro
Val
Ala
Gly 265 Gly
Lys
Cys
Leu
Glu 345 Lys
Lys
Leu
Lys
Leu
Tyr 90
Ser
Asp
Val
Leu
Leu 170 Thr
lie
Ser
Lys
Leu 250 Leu
Thr
Val
Pro
Phe 330 Val
Phe
Pro
Thr
Val 410
L>eu
75
Tyr
Tyr
Thr
Ser
Trp 155
Val
Thr
Thr
Ser
Asp 235 Thr
Tyr
Gin
Asp
Pro 315 Pro
Thr
Asn
Arg
Val 395 Ser
60 Leu
Lys
Val
Leu
lie 140 Pro
Ser
Trp
Gly
Lys 220 Tyr
Ser
Ser
Thr
Lys 300 Cys
Pro
Cys
Trp
Glu 380 Leu
Asn
His
Tyr
Phe
Leu 125 Pro
Asp
Thr
Gly
Ala 205 Ser
Phe
Gly
Leu
Tyr 285
Arg
Pro
Lys
Val
Tyr 365 Glu
His
Lys
Glu
lie
Val 110
Val
Gly
Gly
Pro
Asp 190 Ser
Thr
Pro
Val
Ser 270 lie
Val
Ala
Pro
Val 350 Val
Gin
Gin
Ala
Val
Lys
95
Arg
Asn
Leu
Gin
Leu 175 Gin
Thr
Ser
Glu
His 255 Ser
Cys
Glu
Pro
Lys 335 Val
Asp
Tyr
Asp
Leu 415
His
80
Ala
Asp
Arg
Asn
Glu 160 Leu
Asp
Lys
Gly
Pro 240 Thr
Val
Asn
Pro
Glu 320 Asp
Asp
Gly
Asn
Trp 400 ProAla Pro
Pro Gin
Gin Val 450 Ala Val 465
Thr Pro
lie
Val 435 Ser
Glu 420 Tyr
Thr Leu
Leu Thr Cys
Glu Trp Glu
Pro Val
Leu Thr Val
Ser Val
Met 515 Ser
Asp 500 His
Pro
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 425 430 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
440 445 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 455 柳 Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 475 480 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
490 495 Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
505 510 Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 520 525
Leu 485 Lys
Glu
Gly
Ser 470 Asp
Ser
Ala
Lys
Ser Leu 530 〈210〉 11 〈211> 1926 <212〉 DNA
〈213〉 VEGFRFc DNA sequence 〈400〉 11 agtgactact accggtgsca ggagctcagg gactgcgagg gccaacgaca accacggccg cctgacacgc cccggcctca gtggtgtggg tacctgcagt cacatcacag 3ta_c3C3tga actgttactt tggg織gta acctgtgaag accaatacaa catactcttg tggagttacc aattcccatg 犯aggacttt gtgcatatat tgcccaccgt aaacccaagg gtgagccEicg
ccatgacccccccgaccttgaacatcacggcgtcatcgac60
gcctgtccatctcctgcaggggacagceiccccctcgagtgggcttggcca120
鄉cgccagccaccggagac犯gg3C3gCg鄉3C3Cgggggtggtgcga180
gca^gscgccaggccctactgca鄉tgttgctgctgcacgaggteicat240
caggcagctacgtctgctactC6LaggCaCgcatcgagggc300
ccagctcctacgtgttcgtgagagwtttgagcagccattcatc犯caag360
tcttggtcaagccstgtgggtgccctgtctggtgtxcatx420
已tgtcacgctgcgctcgcaaagctcggtgctgtggcc卿CgggC鄉3g480
atgaccggcggggcatgctcgtgtccacgccactgctgcacgatgccctg540
gcgagaccacctgggg卿ccaggacttcctttccaaccccttcctggtg600
gctccgg鄉tagacctttcgtag卿tgtccccgaaatt660
ctg卿g鄉ggagctcgtcattccctgccgggUscgtc720
t^a犯3gtttccacttgacactttgatccCtgatgg3￡L33cgcat犯tc780
gaaagggcttcatcatatcaagggcttctg840
caacagtcaatgggcatttgt3taagac犯actatctcacacatcgacaa900
tcatagatgtcca^at犯gc3C3CC3CgCCcagtcaaattacttag3ggc960
tcctcaattgtactgctaccactcccttgaacacga^gttc犯3tg已cc1020
a犯t犯gagagcttccgtaaggcg冗gaattgaccet犯gc1080
ctacagtgttcttactattg1140
atacttgtcgtgt鄉gagtggaccatcattca^atctgt1200
aggcccgggcg3gCCC犯3tcttgtgacaa1260
gcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttcccccca1320
acaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggac1380
6L6Lg8LCCCtg3ggtc肌gttctgg已cggcgt卿ggtgcat1440caaagccgcgtaca^cagc3cgtaccgtgtggtcagcgtc1500
ctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc犯ggagtggtctccaac1560
aaagccctcccagcccccatcgagaa^cca^tctcc犯3gccaaagggcagccccgsgaa1620
ccacaggtgtacaccctgcccccatctcgggagg卿tg3ggtcagcctg1680
acctgcctggtc^sggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtggg已gagcaatggg1740
cagccgg卿acaactacaagaccacgcctcccgtgctgg已ctccgacggctccttcttc1800
ctctatagcaagctcaccgtgg3C3卿gC鄉tggcsgc鄉gg犯cgtcttctcatgc1860
tccgtgatgcatgaggctctgc3ca^ccactacacgcagaag已gcctctxcctgtccccg1920
ggtaaa1926
〈210〉 12
〈211〉 642
〈212〉 PRT
〈213〉 VEGFRFc Amino acid sequence
Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn lie Thr Glu Glu Ser
5 10 15
Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser lie Ser Cys Arg Gly Gin 20 25 30
Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gin Glu Ala Pro Ala Thr
40 45 Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly
55 60 Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His 70 75 80
Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr lie Lys Ala
85 90 95
Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp 100 105 110
Pro Phe lie Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg
120 125 Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser lie Pro Gly Leu Asn
135 140 Arg Ser Gin Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gin Glu 150 155 160
Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu
165 170 175
Leu Tyr Leu Gin Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gin Asp 180 185 190
Asn Pro Phe Leu Val His lie Thr Gly Ser Gly Gly Arg
200 205 Glu Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie lie His Met Thr
215 220 Glu Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn lieThr Val
Lys Arg
Thr Tyr
His Leu 2卯 lie Asp 305
His Thr
Val Gin
Val Arg
Ser Veil 370 Thr Cys 385
Val His
Lys Thr
Pro Ser
Ser Arg 450 Asp Pro 465
Asn Ala
Val Val
Glu Tyr
Lys Thr 530 Thr Leu 545
Thr Cys Glu Ser Leu Asp
Thr
lie
Lys 275 Tyr
Val
Leu
Met
Arg 355 Leu
Arg
lie
His
Val 435 Thr
Glu
Lys
Ser
Lys 515 lie
Pro
Leu
Asn
Ser
Leu
lie 260 Glu
Lys
Gin
Val
Thr 340 Arg
Thr
Val
Tyr
Thr 420 Phe
Pro
Val
Thr
Val 500 Cys
Ser
Pro
Val
Gly 580 Asp
Lys 245 Trp
lie
Thr
lie
Leu 325 Trp
lie
lie
Arg
Asp 405 Cys
Leu
Glu
Lys
Lys 485 Leu
Lys
Lys
Ser
Lys 565 Gin
Gly
Lys
Asp
Gly
Asn
Ser 310 Asn
Ser
Asp
Asp
Ser 390 Lys
Pro
Phe
Val
Phe 470 Pro
Thr
Val
Ala
Arg 550 Gly
Pro
Ser
Phe
Ser
ILeu
Tyr 295 Thr
Cys
Tyr
Gin
Lys 375 Gly
Ala
Pro
Pro
Thr 455 Asn
Arg
Val
Ser
Lys 535 Glu
Pro
Arg
Leu 280 Leu
Pro
Thr
Pro
Ser 360 Met
Pro
Gly
Cys
Pro 440 Cys
Trp
Glu
Leu
Asn 520 Gly
Glu
Leu
Lys 265 Thr
Thr
Arg
Ala
Asp 345 Asn
Gin
Ser
Pro
Pro 425 Lys
Val
Tyr
Glu
His 505 Lys
Gin
Met
Asp 250 Gly
Cys
His
Pro
Thr 330 Glu
Ser
Asn
Phe
Gly 410 Ala
Pro
Val
Val
Gin 490 Gin
Ala
Pro
Thr
Phe Tyr Pro Ser 570
Glu Asn Asn Tyr 585
Phe Phe Leu Tyr
Thr
Phe
Giu
Arg
Val 315 Thr
Lys
His
Lys
Lys 395 Glu
Pro
Lys
Val
Asp 475 Tyr
Asp
Leu
Arg
Lys 555 Asp
Lys
Ser
Leu
lie
Ala
Gin 300 Lys
Pro
Asn
Ala
Asp 380 Ser
Pro
Glu
Asp
Asp 460 Gly
Asn
Trp
Pro
Glu 540 Asn
lie
Thr
Lys
lie Pro Asp Gly 255
lie Ser Asn Ala 270
Thr Val Asn Gly 285
Thr Asn Thr lie
Leu Leu Arg Gly 320
Leu Asn Thr Arg 335
Lys Arg Ala Ser 350
Asn lie Phe Tyr 365
Lys Gly Leu Tyr
Val
Lys
Leu
Thr 445 Val
Val
Ser
Leu
Ala 525 Pro
Asn
Ser
Leu 430 Leu
Ser
Glu
Thr
Asn 510 Pro
Gin
Thr
Cys 415 Gly
Met
His
Val
Tyr 495 Gly
lie
Val
Ser 400 Asp
Gly
lie
Glu
His 480 Arg
Lys
Glu
Tyr
Gin Val Ser Leu 560
Ala Val Glu Trp 575
Thr Pro Pro Val 590
Leu Thr Val Asp595 600 605
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
610 615 620
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 625 630 635 640
Gly Lys <210> 13 〈211> 936 <212> 飄
<213〉 VEGFRIg-LM DNA sequence <400> 13
tCCgg3ggt3gacctttcgtagtgaaatccccgaaattat60
g犯gg犯gggagctcgtcattccctgccgggttacgtcacctaacatcactgttacttta120
cacttgacactttgatccctg3tgg犯a^cgcatsatctg180
MgggCttC3tcatatcaaatgcaacgtacggcttctgacctgtga^gcs240
3C3gtC犯tgggC3tttgt3t^ga^ca^ctatctcacac8tCg3C犯3Ccaatacaatc300
alagatgtcc3CC3CgCCC3gtcaaattactta^gaggccatactcttgtc360
ctcaattgtactgctaccactcccttg朋c3cgag3gttc犯3tg3CCtgg3gttaccct420
ttCCgt￡lg￡lggacctgattgttcccatgcc480
aacatattctacagtgttcttactattgaca^犯tgcagaaggactttat540
acttgtcgtgta鄉agtggElCCELtC8LttCaaatctgttaacEicctcgig1:600
gcccgggcactgtggctgcaccatctgtcttcatxttcccgccatctgat660
gagcagttgatgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccaga720
g3ggcca犯gggtggat獄gccctxcaatcgggtaactccc已gg卿gt780
gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagc840
a犯gcagsctcaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagc900
tcgcccgtceiC￡L￡L￡Lg3gCttgsgtgt936
〈210〉 14 〈211〉 312 〈212> PRT
<213> VEGFRIg-UI柳ino acid sequence <400〉 14
Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu lie Pro Glu lie
15 10 15
lie His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val lie Pro Cys Arg Val Thr
20 25 30
Ser Pro Asn lie Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
35 40 45
lie Pro Asp Gly Lys Arg lie lie Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe lie
50 55 60
lie Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu lie Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 65 70 75 80
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gin
85 90 95
Thr Asn Thr lie lie Asp Val Gin lie Ser Thr Pro Arg Pro Val LysLeu Leu
Leu Asn 130 Lys Arg 145
Asn lie
Lys Gly
Val Asn
Ala Ala 210 Ser Gly 225
Glu Ala
Ser Gin
Leu Ser
Val Tyr 290 Lys Ser 305
Arg 115 Thr
Ala
Phe
Leu
Thr 195 Pro
Thr
Lys
Glu
Ser 275 Ala
Phe
100 Gly
Arg
Ser
Tyr
Tyr 180 Ser
Ser
Ala
Val
Ser 260 Thr
Cys
Asn
His
Val
Val
Ser 165 Thr
Val
Val
Ser
Gin 245 Val
Leu
Glu
Arg
Thr
Gin
Glu 150 Val
Cys
His
Phe
Val 230 Trp
Thr
Thr
Val
Gly 310
Leu
Met 135 Asp
Leu
Arg
lie
lie 215
Val
Lys
Glu
Leu
Thr 295 Glu
Val 120 Thr
Leu
Thr
Val
Tyr 200 Phe
Cys
Val
Gin
Ser 280 His
Cys
105 Leu
Trp
lie
lie
Arg 185 Asp
Pro
Leu
Asp
Asp 265 Lys
Gin
Asn
Ser
Asp
Asp 170
Ser
Lys
Pro
Ceu
Asn 250 Ser
Ala
Gly
Cys
Tyr
Gin 155 Lys
Gly
Ala
Ser
Asn 235 Ala
Lys
Asp
Leu
Thr
Pro 140
Ser
Met
Pro
Gly
Asp 220 Asn
L>eu
Asp
Tyr
Ser 300
Ala 125 Asp
110 Thr
Glu
Thr Lys
Pro Asn
Asn Ser His Ala 160
Gin Asn Lys Asp 175
Ser Phe L>ys Ser 190
Pro Gly Thr Val 205
Glu Gin Leu Lys
Phe Tyr Pro Arg 240
Gin Ser Gly Asn 255
Ser Thr Tyr Ser 270
Glu Lys His Lys 285
Ser Pro Val Thr
权利要求
1.一种可溶性双功能VEGFR融合受体，为包含VEGFR1和VEGFR3在内的融合蛋白，既能与VEGF和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合。
2. 权利要求1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRIg，其轻链的氨基 酸序列为SEQ ID N0:8所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID N0:10所示。
3. 权利要求2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的突变体，为 VEGFRIgM，其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 14所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 10所示。
4. 权利要求1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体，为VEGFRFc，其特征在于为 两条相同的多肽链通过二硫键结合，其中多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO: 12 所示。
5. —种分离的核酸分子，编码权利要求1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融 合受体。
6. —种分离的核酸分子，编码权利要求2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg，其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:7，编码重链的核苷酸序列 为SEQ ID NO:9。
7. —种分离的核酸分子，编码权利要求3所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRIg的突变体VEGFRIgM,其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID N0:13，编 码重链的核苷酸序列为SEQ ID N0:9。
8. —祌分离的核酸分子，编码权利要求4所述的可溶性双功能VEGFR融合受体 VEGFRFc中的多肽链，具有SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列。
9. 一种载体，含有权利要求5、 6、 7、 8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDRl， pcDNA3. 1 (O ， pc認A3. VZE0(+) ， pDHFR之---。
10. 权利要求9所述的载体，为pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0(+)。
11. 一种宿主细胞，含有权利要求9所述的载体，为真核细胞。
12. 权利要求11所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。
13. 权利要求12所述的宿主细胞，为CH0细胞。
14. 一种制备权利要求1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体的方法，该 方法包括a) 在表达条件下，培养权利要求11-13任一所述的宿主细胞，表达双功能融合受体，b) 分离或纯化所述的双功能融合受体。
15. —种组合物，含有权利要求1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体和 药学上可接受的载体。
16. 权利要求1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体在制备抗肿瘤药物中 的用途。
17. 权利要求15所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
18. 权利要求16、 17任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
全文摘要
本发明公开了一种可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。更具体地，本发明公开了可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFRFc、VEGFRIg和VEGFRIg的突变体VEGFRIg及这些双功能融合受体的制备方法，这些双功能融合受体即能与VEGF和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合，可用于制备抗肿瘤药物。
文档编号C07K19/00GK101575379SQ20081004335
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者盛 侯, 庚 寇, 张大鹏, 李博华, 皓 王, 郭亚军, 钱卫珠 申请人:上海中信国健药业有限公司;上海国健生物技术研究院