专利名称：：病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P<sub>D</sub>及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体涉及病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。及其制备方法和用途。
背景技术：
：病毒样颗粒(Virus-likeParticles,VLPs)是一种在形态结构上与病毒类似的球形颗粒状物质，但不含病毒基因组。依据来源可分为源于病毒VLPs和人工VLPs。前者主要通过基因工程制备，后者由人工化学合成而来。VLPs的表面组分可进行灵活多样的修饰改造以满足不同需求；在适宜条件下，VLPs可以包裹核酸、药物或其它小分子物质，作为分子靶向运载工具；VLPs还具有独特的免疫学特性，不仅能通过影响抗原递呈细胞发挥佐剂效应，还可以作为其它佐剂、肽疫苗和核酸疫苗的整合平台设计多种形式的疫苗，因此在分子载体和疫苗设计中具有良好的应用前景。研究发现，人类乳头状病毒16型(HumanPapillomavirustype-16，HPV16)的主要衣壳蛋白(Ll)具有自身装配成VLPs的特性，而且HPV16L1VLPs还能将外源核酸分子包装成具有天然病毒样结构的伪病毒(PseudoVirus)，可作为基因或药物的运载工具。系统性红斑狼疾(systemicl叩userythematosus,SLE)是一种以产生多种自身抗体为特点，临床表现多样，可侵犯多系统、多器官的自身免疫性疾病。其病因不明，可能与遗传、性激素、环境、感染、药物、机体免疫异常等多种因素相关。目前主要应用糖皮质激素和免疫抑制剂进行联合治疗，但毒副作用产生抑制，增加了患者发生感染的危险性，且部分患者治疗无效或效果差，属于难治性狼瘉。近年来，随着对SLE发病机制进一步的深入研究，针对发病机制中某一环节或影响发病及疾病进展的关键分子的选择性靶向治疗已成为治疗的新方向，以生物技术为基础的多种生物制剂的研发及应用已经成为自身免疫性疾病治疗研究的热点。B淋巴细胞在多种自身免疫疾病发病及进展中发挥重要的作用，它不仅可作为产生抗体的浆细胞的前体，还可作为潜在的抗原递呈细胞，辅助T细胞的活化；另外，B淋巴细胞还可通过分泌细胞因子，包括IL-4、IL-6、IL-10和IFN-Y，发挥免疫调控作用，从而成为近年来SLE靶向治疗方法研究的重点。当前针对B细胞的SLE靶向治疗策略有干扰DNA特异性B细胞的活化、重组免疫毒素杀伤病理性B细胞等，但是这些方案存在着体内易降解，血清半衰期短，治疗效果不能稳定和持久，其它细胞吞噬后可能造成非特异性损伤，以及可能诱发机体的免疫应答等不足。因此，研制具有良好有效性、安全性和耐受性的生物制剂成为本领域一项紧迫和重要的工作。但迄今为止，尚未见有关SLE治疗性伪病毒疫苗及其制备方法方面的研究报道。在SLE患者体内能检测到许多抗核抗体，其中抗ds-DNA抗体不^f义具有诊断学价值，而且是触发SLE的主要致病性抗体。作为抗ds-DNA抗体来源的DNA特异性B细胞，在SLE发病中扮演着关键角色。DNA特异性B细胞表面的抗原受体(Bcellrecptor，BCR)在独特型上与抗ds-DNA抗体是一致的，它们能结合共同的抗原。GaynorB等人以抗ds-DM抗体为亲和配基，从噬菌体随机肽库中筛选得到了多个表位肽，可模拟DNA分子与抗ds-DNA抗体结合，其中一个序列为DWEYSVWLSN的IO肽(在本发明中命名为P。肽)，与ds-DNA抗体有高亲和力(Peptideinhibitionofglomerulardepositionofananti-DMantibody.Gay匿B，etal.ProcNat1AcadSci，94(5):1955-1960,1997)。因此，P。肽可用来引导融合蛋白或基因载体对DNA特异性B细胞进《亍杀伤或干预。
发明内容有鉴于此，本发明的第一目的在于提供病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。，具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本发明的第二目的在于提供病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。的编码基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本发明的第三目的在于提供病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-Pd的制各方法，包括以下步骤a.HPV16Ll-Pn基因的构建以野生型HPV16LI基因为模板，采用重叠延伸PCR法在HPV16LI基因的798/799位碱基之间插入编码P。肽的碱基序列，引物设计如下外侧正向引物F如SEQIDNo.3所示，外侧反向引物R如SEQIDNo.4所示，诱变引物Fm如SEQIDNo.5所示，诱变引物Rm如SEQIDNo.6所示；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，纯化约1600bp的目的片段，将所得目的片段克隆入pCRII-T0P0栽体，再转化入DH5a大肠杆菌感受态细胞，用含氨节青霉素的LB平板筛选阳性克隆菌，提取质粒，采用酶切和PCR法鉴定阳性克隆质粒并测序，获得1602bp的HPV16L1-Pd基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；b.HPV16Ll-P。基因的克隆以步骤a所得阳性克隆质粒为模板，PCR法扩增HPV16L1-P。基因，引物设计如下上游引物I如SEQIDNo.7所示，下游引物I如SEQIDNo.8所示；PCR产物按照步骤a所述方法再次进行鉴定，纯化，克隆，转化，筛选，鉴定，测序等一系'列过程，确认克隆HPV16LI-P。基因的顺序正确性；c.重组载体pFastBacDualHPV16LI-P。的构建将步骤b所得阳性克隆质粒用Ehel和Xhol进4亍双酶切，得到HPV16L1-PD基因片段，再克隆入杆状病毒转移载体pFastBacDual,获得重组载体pFastBacDualHPV16L1-PD;d.含有HPV16LI-Pn基因的重组杆状病毒的制备按照BaculoGold转染试剂盒说明操作，将步骤c构建的重组载体pFastBacDualHPV16Ll-P。与杆状病毒线性DNA即BaculoGoldDNA共转染昆虫细胞Sf9,经胞内同源重组获得含有HPV16L1-P。基因的重组杆状病毒；转染Sf9细胞于温度27。C培养3天，收集培养上清作为病毒原液；e.昆虫细胞内表达和HPV16Ll-P。的纯化将步骤d所得病毒原液感染Sf9细胞，置温度27。C培养3天，收集受染细胞；将受染细胞沉淀重悬于磷酸盐緩沖液即PBS中，超声破壁，低速离心收集上清，转移至盛有质量百分浓度为40。/。的蔗糖溶液的离心管中，超速离心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速离心，收集管中浮密度为l.34g/ml的白色蛋白条带，即得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-Pd。本发明的第四目的在于提供病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。作为基因或药物靶向载体的应用。本发明的第五目的在于提供病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。作为疫苗递送工具的应用。进一步，所述病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。作为SLE疫苗递送工具的应用。本发明的第六目的在于提供SLE治疗性伪病毒疫苗，该疫苗是以病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。包裹B细胞特异性启动子IgK控制下的白喉毒素A链即DT-A基因表达型质粒DNA分子，自组装而成的模拟天然病毒样结构的伪病毒。本发明的第七目的在于提供采用病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。制备SLE治疗性伪病毒疫苗的方法，包括以下步骤a.病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制备与前述病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制备方法相同；b.重组载体pcDNA3IgKDT-A的制备pTHA45载体含有IgKDT-A基因片段，以ApaI及BglII双酶切pTHA45载体，切胶回收纯化IgKDT-A基因片段，再与经同样双酶切消化的pcDNA3载体进行连接，制得重组载体pcDNA3IgKDT-A;c.SLE治疗性伪病毒疫苗的制备取步骤a所得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-Pd，加入变性剂使蛋白变性，再加入步骤b所得重组载体pcDNA3IgKDT-A，于PBS中透析过夜，使变性蛋白逐渐复性，在复性过程中HPV16Ll-Pn包裹重组载体pcDNA3IgKDT-A,自组装形成模拟天然病毒样结构的伪病毒疫苗。本发明的有益效果在于本发明的HPV16Ll-P。是对HPV16Ll进4亍改造，将P。肽插入HPV16Ll中获得的病毒衣壳嵌合蛋白。该蛋白采用基因工程技术进行制备，以重叠延伸PCR法对HPV16Ll基因作定点诱变，获得HPV16Ll-P。基因，克隆入载体pCRII-TOPO,再进一步定向插入转移载体pFastBacDual中，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞Sf9内表达外源蛋白。RT-PCR、SDS-PAGE与Westernblot鉴定证实HPV16Ll-P。基因在Sf9细胞内可特异性转录并表达HPV16L1-P。；Southernblot鉴定显示HPV16Ll-P。与DNA具有理想的结合能力；透射电镜鉴定显示HPV16L1-Pd具有自身装配成VLPs的特性，并能将外源核酸分子包装成具有天然病毒样结构的伪病毒。本发明的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。利用暴露在VLPs表面的P。肽，在体内能够高效识别DM特异性B细胞，从而成功靶向转染到DNA特异性B细胞内，实现基因表达或药物作用的靶向性，可作为基因或药物的运载工具以及疫苗递送工具。采用本发明的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。可制备SLE治疗性伪病毒疫苗即模拟天然病毒样结构的核酸-VLPs复合疫苗，该疫苗及其制备方法具有如下优点(1)选择病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。为基因载体，HPV16Ll基因比较简单，不舍自我复制单元或潜致癌序列，较其它病毒载体更安全；HPV16L1VLPs的免疫原性弱，仅触发宿主弱的体液免疫和细胞免疫应答，特别是产生的中和性抗体滴度很低，可反复使用；HPV16Ll-PDVLPs可特异性感染DNA特异性B细胞，靶向性强；(2)选择B细胞特异性启动子IgK控制下的DT-A基因表达型质粒DNA分子为VLPs包裹的核酸分子，通过B细胞特异性启动子控制毒素基因表达，仅杀伤致病性B细胞克隆，杀伤特异性有保障；(3)制得的伪病毒表面具有多价P。肽，除与DNA特异性B细胞结合外，还能与体内游离的抗ds-DM抗体结合，有利于降低病理性自身抗体的滴度；(4)制备过程简单，不受严格的P3生物安全条件限制，产品具有更好的敏感性和特异性；(5)本发明疫苗完全源于人工设计、构建，方便进一步的修饰改造。以MRL/lpr狼疮小鼠为动物模型，通过尾静脉回输的方式评价本发明的SLE治疗性伪病毒疫苗的治疗效果，结果发现治疗组小鼠治疗后的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及抗ds-DNA抗体均下降，与治疗前相比有显著性差异，而对照组治疗前后无显著性差异，并且治疗组小鼠的平均生存期比对照组明显延长，表明本发明的SLE治疗性伪病毒疫苗可显著改善MRL/lpr小鼠的免疫状况和肾脏功能，提高小鼠的平均生存期，具有良好的临床应用前景，可为患者尤其是那些传统免疫抑制治疗效果不佳的患者提供新型的靶向生物制剂，也为SLE等自身免疫性疾病的药物研发提供新的设计思路。本发明的其他优点、目标，和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为HPV16L1-P。基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图2为重组克隆载体pCRIIHPV16Ll-P。的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图3为病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。的SDS-PAGE与Western-blot鉴定图;图4为病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。和SLE治疗性伪病毒疫苗的透射电镜图5为两组小鼠治疗后的生存率比较图。具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。(一)病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。的制备1.HPV16L1-P。基因的构建根据重叠延伸PCR法(Overlap-extensionPCR，0E-PCR)定点-誇变的原理，设计并合成4条引物外侧正向引物F如SEQIDNo.3所示，下划线部分为BglII限制性酶切位点；外侧反向引物R如SEQIDNo.4所示；-誇变引物Fm如SEQIDNo.5所示，下划线部分为突变位点；诱变引物Rm如SEQIDNo.6所示，下划线部分为突变位点；取人宫颈癌细胞抹Caski,加入Tripure试剂，按照试剂说明提取细胞总RNA;逆转录以提取的总RNA为模板，以Oligo(dT)"为引物进行逆转录，获得野生型HPV16LIDM,具体方法为取浓度为100jig/ml的总RNA5pl、浓度为100吗/ml的引物1nl、双蒸水补充体积至10jil，7(TC水浴5分钟，立即水浴5分钟，再加入10x逆转录酶緩冲液2pi、画LV逆转录酶20U、浓度为10mmol/L的dNTP混合溶液2(xl、RNA酶抑制蛋白20U、双蒸水补充体积至2042。C水浴l小时，95。C变性5分钟；第一轮PCR:以野生型HPV16LlDNA为模板，以外侧正向引物F和诱变引物Rm为上下游引物，进行第一轮PCR扩增，获得含突变位点及其上游序列的DNA片段FRm;第二轮PCR:以野生型HPV16LIDNA为模板，以诱变引物Fm和外侧反向引物R为上下游引物，进行第二轮PCR扩增，获得含突变位点及其下游序列的DNA片段FmR;第三轮PCR:以第一、二轮PCR获得的2条部分重叠的DNA片段FRm、FmR为模板，以外侧正向引物F和外侧反向引物R为上下游引物，进行第三轮PCR扩增，获得由DNA片段FRm和FmR拼接而成的全长含突变位点的DNA片段FR,即HPV16Ll-P。基因；以上三轮PCR的反应体系和反应条件相同，反应体系为10xPCR反应緩冲液5pi、浓度为10mmol/L的dNTP混合溶液1pl、浓度为10pol/L的上、下游引物各O.4(il、模板2pl、TaqDNA聚合酶2U、浓度为50mmol/L的MgCl2溶液lpl、双蒸水补充体积至50pi;反应条件为94。C预变性5分钟，然后94。C变性l分钟、45匸退火30秒、72匸延伸2分钟，共30个循环，最后72°C延伸4分钟；第三轮PCR产物采用质量百分浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图1所示，其中1泳道为PCR分子量标准，2泳道为PCR产物，从图可知，在约1600bp的位置出现一条特异性DNA条带，与理论预测值相符；将鉴定为正确的第三轮PCR产物采用凝胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术有限公司)进行纯化，按照试剂盒说明操作，选择约1600bp的目的DNA片段进行切胶回收纯化，获得HPV16L1-P。基因；将HPV16Ll-P。基因，加入TaqDNA聚合酶和dATP溶液，以温度72。C、30分钟进行PCR，使HPV16Ll-P。基因3'末端加上"a"碱基，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，切胶回收纯化目的DNA片段，将所得目的DNA片段与pCRII-T0P0载体(sigma公司)进行连接，连接方法为浓度为100吗/ml的目的DNA片段5pl、浓度为100吗/ml的载体3pl、浓度为100|_ig/ml的T4DNA连接酶0.5pl、10x緩沖液1pl、双蒸水补充体积至IOpl，置温度16。C孵育8小时，定向构建重组克隆载体pCRIIHPV16L1-Pd;将重组克隆载体pCRIIHPV16L1-P。转化入CaCh法制备的DH5oc大肠杆菌感受态细胞，转化方法为将浓度为100pg/ml的重组克隆载体2pl加入到细胞密度为1x107ml的感受态细胞200pl中，冰浴30分钟，42。C水浴热休克90秒，立即冰浴2分钟，再加入液体LB培养基，于温度37。C，150r/min振摇1小时，制得转化细胞；取转化细胞涂布于含氨节青霉素的LB平板上，于温度为37。C正置1小时，倒置过夜，从LB平板上随机挑取3个白色菌落，接种于液体LB培养基中，于温度37。C、150r/min振摇过夜，采用质粒提取试剂盒(omega公司)小量提取质粒，用酶切和PCR方法鉴定阳性克隆质粒，酶切法为浓度为100吗/ml的质粒10pl、浓度为100jig/ml的BglII限制性内切酶1nl、10x緩沖液3pl、双蒸水补充体积至30pl，置温度37。C孵育4小时，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，其中1泳道为DNA分子量标准，2泳道为酶切产物，从图可见两条DNA带，其中一条约1600bp，与理论预测值基本一致；PCR法为以经酶切鉴定为阳性克隆的质粒为才莫板，以步骤1.1所述外侧正向引物F和外侧反向引物R为上下游引物，以步骤1.2所述PCR反应体系和条件进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，获得约1600bp的条带，与步骤1.2所得第三轮PCR产物的电泳条带一致；取阳性克隆质粒，委托上海生工生物工程技术公司测定插入片段的序列，获得1602bp的DNA序列，如SEQIDNo.1所示，与HPV16L1-P。基因的理论预测值一致；2.HPV16L1-P。基因的克隆根据HPV16L1-P。基因序列，结合杆状病毒转移载体pFastBacDual上的内切酶位点，设计如下引物上游引物I如SEQIDNo.7所示，下划线部分为EheI酶切位点；下游引物I如SEQIDNo.8所示，下划线部分为XhoI酶切位点；以步骤1所得阳性克隆质粒为才莫板，采用上下游引物I,以步骤1所述PCR反应体系和条件进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，切胶回收纯化目的DNA片段，再按照步骤1所述方法进行克隆、筛选阳性克隆质粒并进行序列测定，确认克隆HPV16Ll-P。基因的顺序正确性；3.重组载体pFastBacDualHPV16Ll-P。的构建将步骤2经测序鉴定的阳性克隆质粒用Ehel和Xhol进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切产物，切胶回收纯化约1600bp的目的DNA片段；将所得目的DNA片^爻与按相同方法经Ehel和Xhol双酶切消化后的杆状病毒转移载体pFastBacDual(sigma/>司)进行连接，定向构建重组栽体pFastBacDualHPV16L1-PD;将所得重组载体pFastBacDualHPV16Ll-P。转化入CaCl2法制备的DH5a大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆质粒并经测序鉴定，结果表明实验获得的质粒为含有HPV16L1-P。基因的重组质粒；4.含有HPV16L1-P。基因的重组杆状病毒的制备将Sf9细胞置质量百分浓度为10°/的FCS培养基中，于温度27。C条件卞维系生长，待细胞于培养亚中长至50-70°/单层时，按照BaculoGoldTM转染试剂盒(sigma公司)说明操作，将步骤3构建的重组载体pFastBacDualHPV16LI-PD与杆状病毒线性DNA(BaculoGoldDNA)共转染，使之在Sf9细胞内同源重组获得含HPV16LI-P。基因的重组杆状病毒；转染Sf9细胞于温度27。C培养3天，细胞病变率达90°/。以上，可见细胞核增大，胞质混浊、细胞变圆等重组杆状病毒感染特征，收集培养上清作为病毒原液；5.昆虫细胞内表达和HPV16L1-Pd的純化将步骤4所得病毒原液以感染复数(M0I)为5感染对数生长期的Sf9细胞，置温度27。C培养，3天后细胞可出现明显病变，收集受染细胞；将受染细胞沉淀重悬于预冷的浓度为O.1mol/L、pH值为7.4的PBS中，超声破壁，低速离心收集上清，转移至盛有质量百分浓度为40。/。的蔗糖溶液的离心管中，超速离心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速离心，收集管中浮密度为l.34g/ml的白色蛋白条带，即得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16LI-PD，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。(二)病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。的鉴定1.RT-PCR鉴定HPV16L1-P。基因的胞内转录情况取收集的受染Sf9细胞，提取总RNA,再釆用RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)进行RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，结果在约1600bp处有一明显条带，与理论上的产物长度相吻合；切胶回收纯化PCR产物并进行DNA序列分析，证实HPV16Ll-P。基因在Sf9细胞内特异性转录。2.SDS-PAGE与Westernblot鉴定HPV16L1-P。的表达量及特异性取制得的HPV16L1-Pd，使用质量百分浓度为5%的浓缩胶、质量百分浓度为12.5y。的分离胶进行SDS-PAGE,凝胶电泳完毕后，将胶切开，一半进行考马斯亮蓝染色分析；另一半转印PVDF膜，洗膜封闭后加入一抗鼠抗人HPV16L1-PD，置温度37。C孵育1小时，洗膜后加入羊抗鼠二抗，置温度37。C孵育1小时，洗膜后显色，进4亍Westernblot分4斤。SDS-PAGE结果如图3A所示，图中M泳道为蛋白质分子量标准，l-4泳道为HPV16L1-PD,可见感染重组杆状病毒的Sf9细胞有一分子量为63kD的特异性蛋白表达，即HPV16L1-P。特异性表达；考马斯亮蓝法测得500ml受染Sf9细胞中含有HPV16LI-PdO.5mg，其中1-3泳道的HPV16L1-P。浓度分别测定为209、263、82jig/ml，4泳道未测定HPV16Ll-P。的浓度。Westernblot结果如图3B所示，其中1-4泳道为HPV16L1-P。(与图3A相同)，可见在与SDS-PAGE相对应的63kD有一条带，表明感染重组杆状病毒的Sf9细胞表达了与抗HPV16L1-P。抗体特异性结合的蛋白，即HPV16L1-PD。3.Southernblot鉴定HPV16L1-Pd与DM的结合力将制得的HPV16Ll-P。通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性裂解、转膜、复性后与地高辛标记的DNA探针进行杂交，洗膜后显色，观察。结果显示在特异位置出现显色条带，表明HPV16L1-P。与DNA具有理想的结合能力。4.透射电镜鉴定HPV16Ll-P。的自发装配能力将制得的HPV16L1-P。滴于200目铜网上，用质量百分浓度为1%的水溶性醋酸铀进行负染，在80kV透射电镜下观察HPV16L1-P。的形态，结果如图4A所示，HPV16L1-P。呈圆形颗粒样结构，直径约为50nm，表明在缺乏其它病毒蛋白情况下，HPV16Ll-P。可自发形成VLPs。(三)SLE治疗性伪病毒疫苗的制备1.病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。的制备按照(一)所述方法进行制备；2.重组载体pcDNA3IgKDT-A的制备pTHA45载体(sigma公司)含IgKDT-A基因片段，该载体经ApaI及BglII双酶切后，插入的IgKDT-A基因片段经琼脂糖凝胶电泳分离、回收、纯化，再与经同样双酶切消化的pcDNA3载体(sigma^^司)在T4连^妄酶作用下进行连接，以IgKDT-A基因片段取代穿梭型质粒pcDNA3中CMV启动子得到pcDNA3IgKDT-A重组载体；3.SLE治疗性伪病毒疫苗的制备将步骤1所得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。用浓度为0.1mol/L、pH值为7.4的PBS进行溶解，制成浓度为lmg/ml的蛋白溶液，再加入2-巯基乙醇至最终体积百分浓度为5%，置温度4。C反应16小时进行蛋白变性，然后在变性的蛋白溶液中加入步骤2所得重组载体pcDNA3IgKDT-A2mg,混勻后转移至透析袋中，在浓度为O.1mol/L、pH值为7.4的PBS中于温度4。C透析过夜，使变性蛋白逐渐复性，在复性过程中HPV16Ll-P。包裹重组载体pcDNA3IgKDT-A,自组装形成SLE治疗性伪病毒疫苗。(四)SLE治疗性伪病毒疫苗的鉴定采用透射电镜观察所得SLE治疗性伪病毒疫苗的结构，透射电镜图如闺4所示，图中A为HPV16L1-P。原液，B为变性后的HPV16LI-P。，C为SLE治疗性伪病毒疫苗，从图可知，HPV16L1-PD呈圆形颗粒样结构，其在变性剂的作用下解离成细小的分子结构，但能在PBS中逐渐复性，又恢复原来的颗粒样结构。(五)SLE治疗性伪病毒疫苗治疗MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的实验研究一、实-睑方法1.动物分组及治疗将3月龄、体重20-30g的MRL/lpr狼瘉小鼠12只(由中国科学院上海实验动物中心提供)随机分成两组实验组和对照组，每组6只；实验组于尾静脉回输本发明的SLE治疗性伪病毒疫苗，每周l次，每次IOOpl，连续回输3次；对照组同法处理，但以等体积的浓度为O.1mol/L、pH值为7.4的PBS代替SLE治疗性伪病毒疫苗；分别于治疗前和治疗后，于小鼠眶后静脉丛采血，分离血清备用。2.尿蛋白的测定分别于治疗前和治疗后，采用代谢笼准确测量小鼠24小时尿量，用考马斯亮蓝法测定尿蛋白量。3.血清尿素氮、肌酐的测定取小鼠血清100pl，用自动生化仪测定尿素氮、肌酐。4.抗ds-DNA抗体滴度的测定采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，具体方法为在酶标板中加入浓度为IOO吗/ml的鲑鱼精DNA溶液，100pl/孔，于室温下包被10小时，用浓度为O.1mol/L、pH值为7.4的PBS洗涤3次，加入质量百分浓度为ll的牛血清白蛋白(BSA)溶液，200^1/孔，于室温下封闭2小时，PBS洗涤3次，加入按l:100稀释的小鼠血清，100pl/孔，置温度37。C孵育2小时，PBS洗涤3次，加入浓度为IOOnl/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗，100pl/孔，置温度37。C孵育1小时，PBS洗涤3次，加底物溶液显色，用酶标仪在波长492nm处测定吸光度。5.小鼠生存率的测定观察两组小鼠在治疗后1月到4月的生存情况。二、实验结果1.尿蛋白的测定两组小鼠治疗前后24小时尿蛋白量见表1，实验组小鼠治疗后的尿蛋白量比治疗前明显降低(P<0.05),而对照组小鼠治疗前后的尿蛋白量没有明显差异(P〉0.05)。表l.两组小鼠治疗前后24小时尿蛋白量(mg/24h，^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>2.血清尿素氮、肌酐的测定两组小鼠治疗前后血清尿素氮、肌酐量见表2，实验组小鼠治疗后的血清尿素氮、肌酐量比治疗前明显降低(P<0.05)，而对照组小鼠治疗前后的血清尿素氮、肌酐量没有明显差异(P〉0.05)。表2.两组小鼠治疗前后血清尿素氮、肌酐量(pmol/L，<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.抗ds-DNA抗体滴度的测定两组小鼠治疗前后抗ds-DNA抗体滴度见表3,实—睑组小鼠治疗后的抗ds-DNA抗体滴度比治疗前明显降低(P〈0.05)，而对照组小鼠治疗前后的抗ds-DM抗体滴度没有明显差异(P〉0.05)。表3.两组小鼠治疗前后抗ds-DNA抗体滴度(OD值，^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>4.小鼠生存率的测定两组小鼠治疗后的生存率比较图见图5,如图5所示，治疗后第l个月，两组小鼠的生存率没有明显差异(P〉0.05)，但第2个月后两组小鼠的生存率差异明显(P<0.05)，实验组小鼠的生存率明显高于对照组。三、实验结论本发明的新型SLE治疗性伪病毒疫苗可显著改善MRL/lpr小鼠的免疫状况和肾脏功能，提高小鼠平均生存期。尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。及其制备方法和用途<160>8<210>1<211>1602<212>腿<213>人工序列<220〉<221>CDS<222>(l)...(1602)<220><223>人工序列的描述对HPV16Ll基因定点诱变得到的HPV16Ll-P。基因<400>1tgtcgtactaccateMetSerTyrTyrHis15ccgaaaacctgtattThrGluAsnLeuTyr20ccactgtctacttgcAlaThrValTyrLeu35atgaatatgttgcacAspGluTyrValAla50gactacUgcagttgArgLeuLeuAlaValaccateaccateacgattacgatateccaacga48HisHisHisHisHisAspTyrAsplieProThr1015ttcagggcgcctetctttggctgcetagtgagg96PheGinGlyAlaSerLeuTrpLeuProSerGlu2530etcctgteccagtatetaaggttgtaagcaegg144ProProValProValSerLysValValSerThr4045gcacaaacatatattateatgcaggaacatcca192ArgThrAsnlieTyrTyrHisAlaGlyThrSer5560gacatecctattttcetaUaaaaaacetaaca240GlyHisProTyrPheProlieLysLysProAsn65707580ataacaaagtattagttcetaaagUtcaggattacaatacagggtat288AsnAsnLysValLeuValProLysValSerGlyLeuGinTyrArgVal859095ttagaatacatttacctgaccccaataagtttggttttcctgacacct336PheArglieHisLeuProAspProAsnLysPheGlyPheProAspThr100105110cattttataatecagatacacageggctggtttgggcctgtgtaggtg384SerPheTyrAsnProAspThrGinArgLeuValTrpAlaCysValGly115120125ttgaggtaggtcgtggtcagecattaggtgtgggcattagtggccate432ValGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlylieSerGlyHis130135140ctttattaaataaattggatgacacagaaaatgetagtgcttatgcag480ProLeuLeuAsnLysLeuAspAspThrGluAsnAlaSerAlaTyrAla145150155160caaatgcaggtgtggataatagagaatgtatatetatggattacaaac528AlaAsnAlaGlyValAspAsnArgGluCyslieSerMetAspTyrLys165170175aaacacaattgtgtttaattggttgcaaaccacetataggggaacact576GinThrGinLeuCysLeulieGlyCysLysProProlieGlyGluHis180185190ggggcaaaggatccccatgtaccaatgttgcagtaaatecaggtgatt624TrpGlyLysGlySerProCysThrAsnValAlaValAsnProGlyAsp195200205gtccaccattagagttaataaacacagttattcaggatggtgatatgg672CysProProLeuGluLeulieAsnThrVallieGinAspGlyAspMet210215220ttgatactggetttggtgetatggactttaetacattacaggetaaca720<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>aaaatactaactttaaggagtacctacgacatggggaggaatatgatt1200LysAsnThrAsnPheLysGluTyrLeuArgHisGlyGluGluTyrAsp385390395400tacagtttatttttcaactgtgcaaaataaccttaactgcagacgtta1248LeuGinPheliePheGinLeuCysLyslieThrLeuThrAlaAspVal405410415tgacatacatacattctatgaattccactattttggaggactggaatt1296MetThrTyrlieHisSerMetAsnSerThrlieLeuGluAspTrpAsn420425430ttggtctacaaccccccccaggaggcacactagaagatacttaUggt1344PheGlyLeuGinProProProGlyGlyThrLeuGluAspThrTyrArg435440445ttgtaacatcccaggcaattgcttgtcaaagacatacacetccagcac1392PheValThrSerGinAlalieAlaCysGinArgHisThrProProAla450455460ctaaagaagatecccttaaaaaatacactttttgggaagtaaatttaa1440ProLysGluAspProLeuLysLysTyrThrPheTrpGluValAsnLeu465470475480aggaaaagttttctgcagacctagateagtUcctttaggacgcaaat1488LysGluLysPheSerAlaAspLeuAspGinPheProLeuGlyArgLys485490495ttttactacaagcaggattgaaggccaaaccaaaatttacattaggaa1536PheLeuLeuGinAlaGlyLeuLysAlaLysProLysPheThrLeuGly.500505510aacgaaaagctacacccaccacctcatctacctctacaactgctaaac1584LysArgLysAlaThrProThrThrSerSerThrSerThrThrAlaLys515520525gcaaaaaacgtaagetgt1602ArgLysLysArglysLeu530<210>2<211>534<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述病毒衣壳嵌合蛋白HPV16LI-PD<400〉2MetSerTyrTyrHisHisHisHisHisHisAspTyrAsplieProThr151015ThrGluAsnLeuTyrPheGinGlyAlaSerLeuTrpLeuProSerGlu202530AlaThrValTyrLeuProProValProValSerLysValValSerThr354045AspGluTyrValAlaArgThrAsnlieTyrTyrHisAlaGlyThrSer505560ArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPheProlieLysLysProAsn65707580AsnAsnLysValLeuValProLysValSerGlyLeuGinTyrArgVal859095PheArglieHisLeuProAspProAsnLysPheGlyPheProAspThr100105110SerPheTy.rAsnProAspThrGinArglxuValTrpAlaCysValGly115120125ValGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlylieSerGlyHis130135140ProLeuLeuAsnLysLeuAspAspThrGluAsnAlaSerAlaTyrAla145150155160AlaAsnAlaGlyValAspAsnArgGluCyslieSerMetAspTyrLys165170175GinThrGinLeuCysLeulieGlyCysLysProProlieGlyGluHis180185190TrpGlyLysGlySerProCysThrAsnValAlaValAsnProGlyAsp195200205CysProProLeuGluLeulieAsnThrVallieGinAspGlyAspMet210215220ValAspThrGlyPheGlyAlaMetAspPheThrThrLeuGinAlaAsn225230235240LysSerGluValProLeuAsplieCysThrSerlieCysLysTyrPro245250255AspTyrlieLysMetValSerGluProTyrGlyAspSerLeuPhePhe260265270TyrLeuArgArgGluGinMetPheValArgHisLeuPheAsnArgAla275280285GlyAlaAspTrpGluTyrSerValGlyGluAsnValProAspAspLeu290295300TyrlieLysGlySerGlySerThrAlaAsnLeuAlaSerSerAsnTyr305310315320PheProThrProSerGlySerMetValThrSerAspAlaGinliePhe325330335AsnLysProTyrTrpLeuGinArgAlaGinGlyHisAsnAsnGlylie340345350CysTrpGlyAsnGinLeuPheValThrValValAspThrThrArgSer355360365ThrAsnMetSerLeuCysAlaAlalieSerThrSerGluThrThrTyr370375380LysAsnThrAsnPheLysGluTyrLeuArgHisGlyGluGluTyrAsp385390395400LeuGinPheliePheGinLeuCysLyslieThrLeuThrAlaAspVal405410415MetThrTyrlieHisSerMetAsnSerThrlieLeuGluAspTrpAsn420425430PheGlyLeuGinProProProGlyGlyThrLeuGluAspThrTyrArg435440445PheValThrSerGinAlalieAlaCysGinArgHisThrProProAla450455460ProLysGluAspProLeuLysLysTyrThrPheTrpGluValAsnLeu465470475480LysGluLysPheSerAlaAspLeuAspGinPheProLeuGlyArgLys485490495PheLeuLeuGinAlaGlyLeuLysAlaLysProLysPheThrLeuGly500505510LysArgLysAlaThrProThrThrSerSerThrSerThrThrAlaLys515520525ArgLysLysArgLysLeu530<210>3.<211〉30<212〉DM<213>人工序列<220><223>人工序列的描述外侧正向引物F<400>3agatctgccaccatgtctctttggctgcct30<210>4<211>30<212>DNA〈213〉人工序列<220〉<223>人工序列的描述外侧反向引物R<400〉4atgtcgtactaccatcaccatcaccatcac30<210>5<211〉28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述诱变引物Fm<400〉5aagctttttacagcttacgttttttgcg28<210>6<211>28<212〉腿<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述i秀变引物Rm<權〉6aactgctaaacgcaaaaaacgtaagctg28<210〉7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述上游引物I<400>7ggggcgcctctctttggctgcctagtgag29<210>8<211>29.<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述下游引物I<400>8ggctcgagttacagcttacgttttttgcg29权利要求1.病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-PD，具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。的编码基因，具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。3.权利要求1所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16LI-P。的制备方法，包括以下步骤a.HPV16Ll-P。基因的构建以野生型HPV16LI基因为模板，采用重叠延伸PCR法在HPV16LI基因的798/799位碱基之间插入编码P。肽的4tt序列，引物设计如下外侧正向引物F如SEQIDNo.3所示，外侧反向引物R如SEQIDNo.4所示，诱变引物Fm如SEQIDNo.5所示，诱变引物Rm如SEQIDNo.6所示；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，纯化约1600bp的目的片段，将所得目的片段克隆入pCRII-TOPO载体，再转化入DH5cx大肠杆菌感受态细胞，用含氨节青霉素的LB平板筛选阳性克隆菌，提取质粒，采用酶切和PCR法鉴定阳性克隆质粒并测序，获得1602bp的HPV16L1-Pd基因，具有如SEQIDNo.1所示的核香酸序列；b.HPV16Ll-P。基因的克隆以步骤a所得阳性克隆质粒为模板，PCR法扩增HPV16L1-Pd基因，引物设计如下上游引物I如SEQIDNo.7所示，下游引物I如SEQIDNo.8所示；PCR产物按照步骤a所述方法再次进行鉴定，纯化，克隆，转化，筛选，鉴定，测序等一系列过程，确认克隆HPV16Ll-P。基因的顺序正确性；c.重组载体pFastBacDualHPV16LI-P。的构建将步骤b所得阳性克隆质粒用Ehel和Xhol进行双酶切，得到HPV16L1-PD基因片段，再克隆入杆状病毒转移载体pFastBacDual，获得重组载体pFastBacDualHPV16L1—PD;d.含有HPV16L1-P。基因的重组杆状病毒的制备按照BaculoGold转染试剂盒说明操作，将步骤c构建的重组载体pFastBacDualHPV16L1-P。与杆状病毒线性DM即BaculoGoldDNA共转染昆虫细胞Sf9，经胞内同源重组获得含有HPV16L1-P。基因的重组杆状病毒；转染Sf9细胞于温度27。C培养3天，收集培养上清作为病毒原液；e.昆虫细胞内表达和HPV16Ll-P。的纯化将步骤d所得病毒原液感染Sf9细胞，置温度27。C培养3天，收集受染细胞；将受染细胞沉淀重悬于磷酸盐緩冲液即PBS中，超声破壁，低速离心收集上清，转移至盛有质量百分浓度为40。/。的蔗糖溶液的离心管中，超速离心收集沉淀，再以CsCl密度梯度超速离心，收集管中浮密度为l.34g/ml的白色蛋白条带，即得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-Pd。4.权利要求1所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16Ll-P。作为基因或药物靶向载体的应用。5.权利要求l所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。作为疫苗递送工具的应用。6.根据权利要求5所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。作为疫苗递送工具的应用，其特征在于所述HPV16Ll-P。作为系统性红斑狼疮疫苗递送工具的应用。7.系统性红斑狼疮的治疗性伪病毒疫苗，其特征在于所述疫苗是以权利要求l所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。包裹B细胞特异性启动子IgK控制下的白喉毒素A链即DT-A基因表达型质粒DNA分子，自组装而成的模拟天然病毒样结构的伪病毒。8.采用权利要求1所述的病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。制备系统性红斑狼疮的治疗性伪病毒疫苗的方法，包括以下步骤a.病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P。的制备按照权利要求3所述方法进行制备；b.重组载体pcDNA3IgKDT-A的制备pTHA45.载体含有IgKDT-A基因片^爻，以ApaI及BglII双酶切pTHA45载体，切胶回收纯化IgKDT-A基因片段，再与经同样双酶切消化的pcDNA3载体进行连接，获得重组载体pcDNA3IgKDT-A;c.系统性红斑狼疮的治疗性伪病毒疫苗的制备取步骤a所得病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-PD,加入变性剂使蛋白变性，再加入步骤b所得重组载体pcDNA3IgKDT-A，于PBS中透析过夜，使变性蛋白逐渐复性，在复性过程中HPV16Ll-P。包裹重组载体pcDNA3IgKDT-A,自组装形成模拟天然病毒样结构的伪病毒疫苗。全文摘要本发明属于基因工程领域，公开了病毒衣壳嵌合蛋白HPV16L1-P<sub>D</sub>及其制备方法和用途；HPV16L1-P<sub>D</sub>具有如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；HPV16L1-P<sub>D</sub>的制备方法包括HPV16L1-P<sub>D</sub>基因的构建，HPV16L1-P<sub>D</sub>基因的克隆，重组载体pFastBacDualHPV16L1-P<sub>D</sub>的构建，含有HPV16L1-P<sub>D</sub>基因的重组杆状病毒的制备，昆虫细胞内表达和HPV16L1-P<sub>D</sub>的纯化等多个步骤；HPV16L1-P<sub>D</sub>可作为基因或药物靶向载体以及疫苗递送工具，可用于制备系统性红斑狼疮的治疗性伪病毒疫苗。文档编号C07K14/025GK101314615SQ20081006988公开日2008年12月3日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者吴玉章,曌杨,王惠明申请人:中国人民解放军第三军医大学