专利名称：聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及去B^重组人胰岛素(重组人DesB30胰岛素)制备方法及 采用化学修饰的方法使该胰岛素的合适部位结合聚乙二醇。具体涉及DesB30人胰岛素的 P. Pastoris表达系统载体构建、重组质粒转化、发酵、纯化、酶切以及聚乙二醇化人DesB30 胰岛素的制备方法。
技术背景胰岛素是胰岛13细胞所分泌的一种激素，胰岛素通过与体内细胞膜 上受体的相互作用，调节血糖维持在正常水平。Kjeldsen(A卯l Microbiol Biotechnol， 2000,54(3) :277 286)在S. cerevisiae中表达人胰岛素原时，最终不能有效地分泌 胰岛素原或胰岛素，但若在在编码胰岛素原cDNA的分子中去除B3°苏氨酸(T)，并使之与 S. cerevisiae的前导肽a因子相连，然后将人胰岛素原的C肽用短C肽代替或直接将 B29赖氨酸(K)与A 1甘氨酸(G)相连，能有效提高单链胰岛素原类似物的分泌表达水平。 Annibali(US Patent, 7091032. 2006-08-15)用巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)分泌表达出 短C肽人胰岛素原B(l-30)-Yl-Y2-A(l-21)，其中Yl、 Y2可以是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。 本发明选用P. pastoris作为基因表达系统，是因为与以往的基因表达系统相比，它具有高 表达特性，被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。在P.pasoris中表达的蛋 白既可存在于胞内，又可分泌至胞外。P. pasoris自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。 分泌表达的短C肽人胰岛素原类似物的纯化和酶切的工艺相对简单，具有实际价值，本发 明建立了仅用胰蛋白酶单一酶切除去短C肽AEDAK的方法和条件，建立的纯化工艺回收率 高，为工业化制备和研究重组胰岛素具有重要意义 长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数，在糖尿病患者体内 重建胰岛素基础分泌。频繁地注射胰岛素，给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，临床上 需要注射间隔时间更长的超长效胰岛素。化学修饰是获得长效胰岛素的途径之一，经过化 学修饰，可使胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长，抗原性降低。化学修饰剂的结 构必须稳定、无毒性、无抗原性并具有合适大小的分子量。诺沃挪第克公司(中国专利， 200480021733. 8，
公开日2006年9月6日)发明了一种新型胰岛素衍生物，该胰岛素衍生 物是在母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的a -氨基处或者在母体胰岛素B链上存在的 Lys残基的e -氨基处连接了侧链的天然存在的胰岛素或其类似物，该胰岛素衍生物在生 理pH值下可溶。聚乙二醇(PEG)是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒 性。用PEG活性酯修饰蛋白质或多肽药物，可在蛋白质或多肽分子上形成保护层，增大相对 分子质量并增加药物的水溶性。相对分子质量的增大会降低肾小球的清除速率，增加药物 在体内循环的半衰期，从而获得长效。耐科塔医药公司(中国专利，200710085552. 7，公开 日2007年10月3日)发明了具有活性的亲水聚合物修饰的胰岛素衍生物。郁正艳等(中 国专利，200410089050. 8，
公开日2005年8月10日)发明了一种单甲氧基聚乙二醇-胰岛 素复合物，胰岛素和单甲氧基聚乙二醇通过前者的游离氨基和后者的具有活性的丙醛基团 连接在一起，分子量介于10. 8 25. 8KD。印春华等(中国专利，200610118923. 2，
公开日: 2007年5月30日)发明了一种单修饰的聚乙二醇化胰岛素(PheBl-PEG-胰岛素)，聚乙二 醇与胰岛素以碳氮键相连，分子量范围6. 55 10. 8KD。本发明选用单甲氧基聚乙二醇通过琥珀酰亚胺基活性基团与重组人DesB30胰岛素的LysB29或LysB29和GlyA1的游离氨基形成 酰氨键，制备而成的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素性质稳定，保留了胰岛素降血糖生物 活性。经糖尿病动物模型证明本发明的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素可维持48-72小 时的降血糖作用，可作为一种治疗I型和II型糖尿病的长效胰岛素药物。
发明内容
1、目的基因获得 选择DesB30人胰岛素(HIDesB30)的氨基酸序列，在A链与B链间加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰岛素原(HMPIDesB30)的氨基酸序列。根据酵母偏爱密码子，在 5'端引入毕赤酵母表达载体的分泌信号肽a因子的Stel3识别位点和XhoI位点，3'端引 入Notl位点和终止子，合成全基因。
2、毕赤酵母表达载体构建 上述基因合成后，用Xhol， Notl双酶切后，与Xhol， Notl双酶切后的pPIC9用T4 连接酶进行连接，转化DH5 a菌，涂布LB-Ampicillin平板，培养LB-Ampicillin平板上长 出的菌落，提质粒，用XhoI，NotI双酶切鉴定。再用Sail和Sacl双酶切pPIC9重组质粒获 得小片段，与Sail和Sacl双酶切后的pPIC9K大片段用T4连接酶进行连接，转化DH5 a菌， 涂布LB-Ampicillin平板，培养LB-Ampicillin平板上长出的菌落，提质粒，用Xhol， Notl 双酶切鉴定。 3 、酵母表达工程菌的获得 用Sail单酶切线性化质粒pPIC9K-HMPIDesB30，回收，电转酵母GS115，将电转后 的GS115涂MD平板，各菌落进行培养和表达，经电泳检测和G418高拷贝筛选，获得高效表 达工程菌。 4、重组酵母工程菌发酵和纯化 毕赤酵母工程菌经发酵罐发酵培养72h后菌液0D6。。达到300以上后，培养液过滤， 上样大孔吸附树脂，再用阳离子交换层析获得纯度大于95X的重组人DesB30胰岛素原。
5、酶切获得重组人DesB30胰岛素 胰蛋白酶单酶切重组人DesB30胰岛素原，酶切效率大于90%。
6、重组人DesB30胰岛素聚乙二醇修饰 胰岛素分子中有三个裸露的氨基，即GlyA、pKa " 8. 0) 、 PheB1 (pKa < 7. 0 =的 a-氨基和Lys^(pKa"9.5)的e_氨基，都可作为胰岛素的化学修饰位点。由于人胰岛素 的B29位不直接参与与受体结合，mPEG与人胰岛素LysB29共价结合不会影响蛋白的生物活 性[Murray-Rust Jet al BioEssays， 1992， 14 (5) :325-331.]。在pH值> 9. 5时LysB29上 e-氨基的单修饰占主要[Hinds K et al Bioconjug Chem. 2000， 11 (2) : 195-201.]。通过 控制反应缓冲的pH值通过调节胰岛素与修饰剂的摩尔比及修饰后的纯化得到比较均一的 LysB29单修饰产物以及GlyA1和LysB29双修饰产物。本发明的单分子聚乙二醇化及两分子聚 乙二醇化重组人DesB30胰岛素的制备方法如下 (1)将1份DesB30人胰岛素溶于Na2PH04溶液(pH值为10. 0)(份数以摩尔计)；
(2)将3. 0份mPEG-SPA (5k)溶于Na2PH04溶液(pH值为10. 0)(份数以摩尔计)；
(3)胰岛素溶液与mPEG-SPA(5k)溶液混合，室温搅拌20 30min，稀释后调pH值至3终止反应； (4)反相HPLC回收修饰产物。 所说的磷酸盐缓冲液的pH值为8. 5 11. O，优选的pH值为10. 0。所说的mPEG-SPA和胰岛素的用量摩尔比为2. 0 5. O，mPEG-SPA和胰岛素的用量
摩尔比过低，胰岛素不能充分被修饰，过高，则其他位点被更多修饰。 所说反应温度为室温，反应温度过低会使反应速度慢，但过高则会使蛋白质变性。
所说的反应时间为20 30min，低于20min，大量胰岛素不能被修饰，超过 30minmPEG-SPA水解，修饰不能继续进行。
本发明具有以下的创新和实用性。 (1)采用P. Pastoris分泌表达短C肽AEDAK的人胰岛素原类似物HMPIDesB3°。表 达产物未产生糖基化，未出现二聚体和多聚体。这种分泌表达的短C肽DesB30人胰岛素原 的纯化和酶切的工艺相对简单。 (2)本发明克服传统的酵母分泌表达产物超滤浓縮工艺无法除去大量色素的缺 点，选用大孔吸附树脂代替超滤建立了 P. Pasotoris酵母分泌表达纯化工艺。建立的纯化 工艺回收率高。 (3)建立了仅用胰蛋白酶单一酶切除去短C肽的方法和条件，为工业化制备和研 究重组人DesB30胰岛素具有实用价值。 (4)单分子聚乙二醇化及双分子聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素保持了胰岛素 原有的生物活性，延长了降血糖作用时间，代谢平稳，使胰岛素的生物利用度提高；
(5)mPEG与胰岛素连接的酰氨键比较稳定，单分子聚乙二醇化及双分子聚乙二醇 化重组人DesB30胰岛保留了重组胰岛素的降血糖生物活性。 (6)单分子聚乙二醇化及双分子聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素，通过控制pH、 反应时间及修饰剂比例可实现胰岛素的定位修饰。 (7)聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素可作为一种治疗糖尿病的长效胰岛素制剂。
图1为实施例2-3中毕赤酵母表达质粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30
构建示意图。 图2为实施例5中重组人DesB30胰岛素原蛋白的纯化过程高效液相色谱图，检测 波长214nm，目的蛋白吸收峰保时间在14min左右。(a)发酵液上清；(b)60X (v/v)乙醇大 孔吸附树脂洗脱液；(c) 25mMol/LTris-HCl pH 9SP柱洗脱液；(d) ZnCl2沉淀目的蛋白溶解 于含5mMol/L EDTA的25mMol/L Tris-HCl。 图3为实施例5中胰蛋白酶酶切获得重组人DesB30胰岛素的高效液相色谱图，检 测波长214nm。 (a)酶切前HMPIDesB30 ; (b)HMPIDesB30与胰蛋白酶按质量比5000 : 1，4°C 酶切过夜，酶切后吸收峰后移，酶切效率大于90%。 图4为酶切后回收产物重组人DesB30胰岛素分子量质谱结果酶切产物的理论分 子量为5694. 5，质谱测定分子量为5705. 43，测定值在误差允许的范围内与理论值一致。
图5为实施例9中重组人DesB30胰岛素单分子聚乙二醇修饰后的高效液相色谱 图，检测波长214nm，峰1为单分子聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素。
7
图6为实施例8中重组人DesB30胰岛素双分子聚乙二醇修饰后的高效液相色谱 图，检测波长214nm，峰2为双分子聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素。 图7为实施例7中重组人DesB30胰岛素LysB29单分子聚乙二醇修饰并纯化后，质 谱测定结果与DesB30-PEGl分子量一致。 图8为实施例8中重组人DesB30胰岛素LysB29和GlyA1双分子聚乙二醇修饰并纯 化后，质谱测定结果与DesB30-PEG2分子量一致。 图9为实施例9中二种PEG修饰DesB30胰岛素降血糖持续时间的比较。
图10为实施例10中DesB30-PEG2的代谢特征。
具体实施例方式
通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例l:目的基因的获得 选择DesB30人胰岛素(HIDesB30)的氨基酸序列，在A链与B链间加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰岛素原(HMPIDesB30)的氨基酸序列。根据酵母偏爱密码子，在 5'端引入毕赤酵母表达载体的分泌信号肽a因子的Stel3识别位点和XhoI位点，3'端引 入Notl位点和终止子，合成全基因。单链核苷酸序列如下 5' CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCCCAC TTG GTT GM GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACTCCA MG GCT GAG GAT GCT MG GGT ATC GTT GM CAA TGT TGT ACT TCC ATC TGTTCC TTG TAC CAATTG GAAAAC TAC TGTAAC TGATAA GCGG CCGC 3' 毕赤酵母表达质粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30构建(重组质粒的
设计和构建见示意图1) 实施例2 :pPIC9-HMPIDesB30构建 上述基因合成后，用XhoI，NotI双酶切后，与XhoI，NotI双酶切后的pPIC9在16°C 下用T4连接酶反应过夜。用CaCl2法转到DH5 a中，并均匀涂布LB-Ampicillin平板，37°C ， 20h，挑取长出的菌落，经培养后提质粒，用Xhol， Notl双酶切鉴定，选出嵌合上HMPIDesB30 片段的菌(命名为pPIC9-HMPIDesB30)，培养并提取质粒。 实施例3 :pPIC9K-HMPIDesB30构建用Sail和Sacl双酶切pPIC9-HMPIDesB30获得 小片段，与Sail和Sacl双酶切后的pPIC9K大片段在16。C下用T4连接酶反应过夜。用CaCl2 法转到DH5 a中，并均匀涂布LB-Ampici 11 in平板，37 °C ， 20h，挑取长出的菌落，提质粒，用 Xhol， Notl双酶切鉴定，选出嵌合上HMPIDesB30片段的菌(命名为pPIC9K-HMPIDesB30)，测序。 实施例4 :HMPIDesB30的诱导表达及酵母表达工程菌的获得 将pPIC9K-HMPIDesB30质粒用Sail线性化后电转入毕赤酵母宿主菌GS115，电转 后立即向电转杯中加lmL lmol/L预冷的山梨醇悬浮菌体，取200iiL菌液涂布含有G418浓 度差(0. 5， 1， 2， 3， 4)的MD板，30。C烘箱培养5-7天，长出的菌落数分别为75， 30， 11， 6， 3 个，说明多拷贝筛选成功。从含G4184mg/mL MD平板上选出一个高表达菌株，经过72h诱导， 采用HPLC法检定，获得一株表达量相对较高的菌定为工程菌。
实施例5 :重组人DesB30胰岛素的纯化(纯化结果见示意图2)
步骤1 :大孔吸附树脂层析 发酵液经高速冷冻离心机(23，000g，4°C )连续流离心后，收集上清。为防止微 小颗粒堵塞填料，发酵上清液用0. 45 m滤纸过滤。平衡缓冲用乙酸调去离子水pH值至 3-4，上样后用25%乙醇(乙酸调pH值至3-4)清洗杂质，表达产物由60%乙醇(乙酸调pH 至3-4)洗脱。平衡速率30mL/min ;上样速率10mL/min洗脱速率20mL/min。
步骤2 :阳离子交换层析选用5mMol/L乙酸-乙酸钠作为平衡缓冲，25mMol/L Tris-HCl pH 9. 0洗脱。平 衡速率25mL/min，上样速率13mL/min，洗脱速率13mL/min。
步骤3 :ZnCl2沉淀 向SP柱的洗脱液中加入lmMol/LZnCl2，4t:静置过夜。高速冷冻离心弃沉淀，再向 上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4。C静置过夜，离心后将沉淀溶解于含10-20mMol/L EDTA 的25mMol/L Tris—HCl (pH9. 0)中。
步骤4:胰蛋白酶酶切 酶切缓冲25mMol/LTris-HCl (pH9. 0)，按酶/蛋白质量比1 : 5000加入经TPCK 处理过的胰蛋白酶，混匀，4t:酶切过夜。用lmol/L HCl调整pH至3.0以下终止反应。反 相回收酶切产物获得重组人DesB30胰岛素样品后冻干。(酶切效率见示意图3，4)
实施例6 :重组人DesB30胰岛素LysB29单分子聚乙二醇修饰(DesB30-PEGl)
(1)将1份DesB30人胰岛素溶于DMF和Na2PH04混合溶液(pH值为9. 5 10. 5) (份数以摩尔计)； (2)将2份mPEG-SPA (5K)溶于DMF (份数以摩尔计)； (3)胰岛素溶液与mPEG-SPA溶液冰上混合，室温搅拌20 30min， DDW稀释10倍 加稀HC1至pH值为3终止反应；(修饰结果见示意图5、7) [OOes] (4)反相HPLC回收修饰产物(图4峰1)。 实施例7 :重组人DesB30胰岛素LysB29和GlyA1双分子聚乙二醇修饰 (DesB30-PEG2) (1)将1份DesB30人胰岛素溶于DMF和Na2PH04混合溶液(pH值为9. 5 10. 5) (份数以摩尔计)； (2)将4份mPEG-SPA(5K)溶于DMF(份数以摩尔计)； (3)胰岛素溶液与mPEG-SPA溶液冰上混合，冷却至室温搅拌20 30min， DDW稀 释10倍加稀HC1至pH值为3终止反应；(修饰结果见示意图6、8)
(4)反相HPLC回收修饰产物(图5峰2)。
实施例8 :STZ致小鼠糖尿病模型的建立 按200mg/kg剂量腹腔注射STZ (用0. lmol/L柠檬酸钠缓冲液pH 4. 4现用现配成 20mg/mL的溶液)进行损伤。注射后提供充足的食物和水，观察是否有多饮、多食、多尿及体 重减轻的现象。注射STZ 72h后，测定体重和空腹(6h)血糖值，体重明显减轻，并且血糖值 > 16. 7mmol/L确定为模型 实施例9 :几种修饰胰岛素药效持续时间的比较 将成模小鼠，随机分为4组A阴性对照组(不注射任何药物)，B阳性对照组 (Detemir)组，C DesB30-PEGl组，D DesB30-PEG2组。B、 C、 D、组按0. 5me/kg给药，给药后4、8U2、24、36、48h断尾测空腹(6h)血糖值，采血时若血糖值高于成模时血糖值则终止取
样。药效持续时间长短排序DesB30-PEG2 > DesB30-PEGl > Detemir
空腹血糖值 体重
胰岛素-成模前成模后4h8h12h24 h36 h48 h成模前成模后
不注射 (阴性对照)3.7±0.419.4±2.120.8±2.323.3±1.725.5土1.226.2±0.526.3±0.722.2士2.418-5±2-7"
Detemir (阳性对照)3.7±0.220.肚3.0"16.4土2甲88113.0±2.3*17.9±3 0*22.0±2.222.5±2.219.8±2.0**
DesB30-PEG23.8±0.218.9±2.3**8.5±2-5*8.7±2.4*8.2±2.4*17.7±2.4*23.9土3.821.2±2.317.3士2.1"
DesB30-PEG13.8±0.219.3±3.0**13.5±2.7*14.2±2.116.4±2.522.3±1.823,3±1.919.7士1.9" 血糖浓度与时间关系见附图9 实施例10 :DesB30-PEG2的代谢特征实验将成模小鼠，随机分为2组ADesB30-PEG2，B Detemir组。空腹4h后按0. 5mg/kg 给药。给药后1、2、3、4、6h断尾测血糖值。DesB30-PEG2未出现代谢的波峰与波谷，代谢特 征与Detemir类似。(见附图10)
_成模时 1 h_^_^_￡^_6h
Detemir 19.0±1.8 16.3±1.9 13.2±2.0 10.2±2.1 8.9±1.9 9.5±2.0
DesB30-PEG2 19.6±2.0 17.3±2.0 14.6±2.1 11.7±2.2 9.4±2.0 9.4±1.9
权利要求
聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素包括(1)重组人DesB30胰岛素的制备方法。(2)重组人DesB30胰岛素的LysB29或者GlyA1和LysB29的聚乙二醇修饰。
2. 根据权利要求l所述的中重组人DesB30胰岛素由基因工程重组表达载体经转化、发 酵、纯化、酶切而制得。
3. 权利要求1或2所述的重组表达载体的宿主细胞为P. Pastoris酵母。
4. 权利要求1或2所述的重组人DesB30胰岛素的制备方法，其特征在于纯化和酶切具 体步骤如下(1) 发酵液经离心和O. 45iim滤纸过滤后上样非极性大孔吸附树脂。用乙酸调pH值至 3-4，上样后用25%乙醇(乙酸调pH值至3-4)清洗杂质，表达产物由60%乙醇(乙酸调pH 至3-4)洗脱；(2) 强阳离子柱层析。选用5mMol/L乙酸-乙酸钠(pH3-4)作为平衡缓冲，20mMol/L Tris-HCl(pH 9)洗脱目的蛋白；(3) ZnCl2沉淀。向洗脱液中加入lmMol/L ZnCl2， 4。C静置过夜。高速冷冻离心弃沉淀，再 向上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4"静置过夜，离心后将沉淀溶解于含10-20mMol/LEDTA 的25mMol/L Tris—HCl(pH9. 0)中；(4) 酶切。按质量比1 : 5000加入经TPCK处理过的胰蛋白酶，4t:酶切过夜。用1Mo1/ LHC1调整pH至3. 0以下终止反应。
5. 权利要求1所述的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素由DesB30胰岛素与单甲氧基 聚乙二醇(mPEG)琥珀酰亚胺基活性基因，通过胰岛素上的游离氨基结合形成酰氨键而成。 单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基活性基因包括琥珀酰亚胺基包括琥珀酰亚胺基琥珀酸酯 (SS)、琥珀酰亚胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥 珀酰亚胺基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)。
6. 权利要求1所述的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素包括LysB29单修饰聚乙二醇化 DesB30重组人胰岛素和GlyA1和LysB29双修饰聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素。
7. 权利要求1的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素具有下式<formula>formula see original document page 3</formula>
8.权利要求1的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素具有下式
9. 权利要求7，8所述的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素，式中(OCH2CH2)n的n代表 20-200。
10. 权利要求1所述的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素的修饰方法，其特征在于具体 步骤如下(1) 将1份人DesB30胰岛素溶于0. 2mol/L Na2ra04混合溶液(pH值为9. 0-10. 5)(份 数以摩尔计)；(2) 将1 : 2 5份mPEG溶于DMF (份数以摩尔计)；(3) 胰岛素溶液与mPEG溶液混合，室温搅拌20 30min，稀释并将pH降至3终止反应；(4) 反相HPLC回收修饰产物。
11.权利要求5 9中所述的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素适应I和II型糖尿病 的治疗。
全文摘要
本发明涉及一种去B30人胰岛素(重组人DesB30胰岛素)的重组制备方法及采用化学修饰的方法对该胰岛素LysB29或者GlyA1和LysB29结合聚乙二醇。本发明制备的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素，聚乙二醇与胰岛素以酰氨键相连，其中聚乙二醇分子量范围为500-10000。经动物实验证明聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素保留了胰岛素的生物活性，在被试动物体内代谢平稳，降血糖持续作用时间延长。可作为一种治疗糖尿病的长效胰岛素制剂。
文档编号C07K1/30GK101717442SQ200810232828
公开日2010年6月2日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者张益 , 范开, 陈海容, 高剑坤 申请人:重庆富进生物医药有限公司