专利名称：洋蓟中高纯度抗病毒活性组分的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及中药或天然产物中有效成分的分离纯化方法，主要涉及从中药或天
然产物中提取、分离单体化合物的方法，具体涉及一种高纯度咖啡酰奎宁酸类化合物
l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1，
3- 二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3，
4- 二 -0-咖啡酰奎宁酸和4， 5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸的分离制备方法。
背景技术：
洋蓟(Cynara scolymus L.，又名菜蓟、朝鲜蓟、洋百合、法国百合、荷花百合) 系菊科多年生草本植物。原产地中海沿岸。我国在20世纪90年代从国外引种，目前湖 南、浙江和云南等地均有大规模的种植。洋蓟的花蕾(肉质花托和总苞片)、茎叶自古药 食两用，具有丰富的食用和生理活性价值，传统用于消化不良、肝胆疾患、利尿解毒、 降脂、降压等。药理研究表明，洋蓟中含有多种抗病毒活性组分，如单咖啡酰奎宁酸类 化合物(1-0-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸和5-0-咖啡酰奎宁 酸)以及二咖啡酰奎宁酸类化合物(l， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁
酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸)等。 咖啡酰奎宁酸类化合物是由奎尼酸和咖啡酸縮合而成的一类多酚类化合物，广 泛存在于植物界中，广为分布的单咖啡酰奎宁酸类化合物l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖 啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸和5-0-咖啡酰奎宁酸为同分异构体，此类化合物的区 别在于一分子的咖啡酰基在奎宁酸上的连接位置不同，分子式均为(^16111809;而二咖 啡酰基奎宁酸类化合物为1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3，
5- 二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸也互为同 分异构体，五者之间的的区别在于两个咖啡酰基在奎宁酸上的连接位置不同，分子式均 为(^251124012，分子量为516。结构式如下
R4Os
R30 4 1 COOH
OR OR,
咖Bfft基=HO —-、 J)
HO&=咖啡酰基，=R3=R4=H1-0-咖啡酰奎宁酸=咖啡酰基，=R3=R4=H3-0-咖啡酰奎宁酸R3=咖啡酰基，=R2=R4=H 44-0-咖啡酰奎宁酸
R4=咖啡酰基，R丄=R2=R3=H5-0-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)=R2 =咖啡酰基，R3=R4=H1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸(洋蓟酸)&=R4 =咖啡酰基，R2=R3=H1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸&=R4 =咖啡酰基，R2=R3=H1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸R2=R4 =咖啡酰基，&=R3=H3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸R2=R3 =咖啡酰基，=R4=H3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸R3=R4 =咖啡酰基，=R2=H4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸 近代药理学试验研究表明咖啡酰奎宁酸类化合物具有多种重要生理活性，主 要是针对免疫系统的作用，抑制乙肝病毒、艾滋病毒、单纯疱疹病毒及流感病毒，抑制 白三烯合成和释放，抑制组胺释放，从而可用于抗病毒、抗炎和治疗过敏性疾病。此外 还发现其具有强效的抗氧化作用、抑制脂氧酶抗动脉粥硬化作用、抗血小板聚集活性以 及降血脂作用等活性。 咖啡酰奎宁酸类化合物为白色粉末状固体，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不 溶于乙醚、苯等极性较小的有机溶剂，受热发生氧化分解或转化为其它二咖啡酰奎宁酸 类化合物，此外，三个化合物在溶液中不稳定，能够相互转化，这给它们的分离纯化造 成很大的困难。因此，建立一种高效、快速的从中药或天然药物中分离纯化高纯度的多 个咖啡酰奎宁酸类化合物，对开发具有特殊疗效的现代中药制剂和充分利用我国的药材 资源等具有重要意义。 目前通用的咖啡酰奎宁酸类化合物分离提取方法是用甲醇、乙醇或水回流提 取，减压浓縮分离提取液得到浸膏，将浸膏悬浮于水，依次用石油醚或正己烷、氯仿或 乙酸乙酯、水饱和的正丁醇等不同极性的溶剂萃取。咖啡酰奎宁酸类化合物一般集中在 正丁醇相，再利用正相硅胶柱层析，使用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂洗脱， 以及过Sephadex LH-20柱色谱或制备液相色谱得到单一化合物。这些方法步骤复杂， 费时费力，而且回收率低，成本高，不适合工业化。高速逆流色谱(high speed counter current chromatography, HSCCC)是20世纪80年代初期发展起来的一种无需使用任何固 态支持介质的液-液分配色谱技术，其基本原理是根据被分离的物质在两相溶剂系统中的 分配系数不同而得到最终分离；这种分离技术由于不使用固体支持介质，避免了因与固 体填料发生不可逆吸附而造成的样品损失、失活变性等常规填料易产生的弊端，可使样 品得以全部回收，且具有分离容量大、性能强、高效、快速的特点，尤其适用于制备性 分离，逆流色谱已广泛应用于生物、医药、环保等领域化学物质的制备分离和纯化。逆 流色谱技术的发展和应用结合高效制备液相色谱高效的分离纯化能力解决了目前咖啡酰 奎宁酸类化合物分离纯化技术面临的难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服传统分离技术的缺陷，提供一种从粗提物中分 离纯化l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁 酸，l， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸， 3， 4-二-O-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸的制备方法，该方法具有操作简 便，分离量大，回收率高等优点。3/5页 本发明的技术方案主要包括
a)粗提物的制备 将洋蓟植物粉碎，用水-强极性的有机溶剂提取，提取液减压浓縮至无醇味，并 经离心去除杂质后得到澄清的浓縮液，进行大孔吸附树脂柱层析，先以水洗至近无色， 再以不同浓度的乙醇水溶液梯度洗脱，接收50 70%的乙醇洗脱物，将洗脱液减压浓縮 至无醇味，加入乙醇至含醇量70 80%，除去沉淀，取上清液浓縮，得含咖啡酰奎宁酸 类化合物的粗品。 b)目标化合物的分离纯化 将富含咖啡酰奎宁酸类化合物的粗提物真空干燥后，用高速逆流色谱结合高效 制备液相色谱进行分离制备，根据紫外检测谱图或者TLC图谱收集目标组份。
目标组分经真空干燥后，用有机溶剂或水-有机溶剂的混合液进行重结晶即可得 高纯度的l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁 酸，1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸， 3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸单体化合物。
制备方法中，步骤a)中所用原料优选菊科洋蓟；提取溶剂为醇水混合溶剂， 其中醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇等或它们的混合物，优选甲醇或乙醇， 醇水混合溶剂可以是醇和水以任何比例混合的溶剂，优选乙醇和水混合溶剂，其间优选 70 80%的乙醇水溶液。提取溶剂的重量为药材重量的1 20倍，优选6 10倍；提 取时间为0.5-5小时，优选2小时；提取次数为l-5次，优选3次；柱层析所用介质为大孔 吸附树脂、聚酰胺、反相硅胶或葡聚糖凝胶类，优选DIOI， AB-8， HPDIOO， HPD300， D1或D2型大孔吸附树脂，洗脱溶剂优选30 40%乙醇水溶液；步骤b)中，优选脂肪 酯-脂肪醇-水或者卤代烃-脂肪醇-水组成的溶剂体系进行高速逆流色谱，脂肪酯可以是 乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、甲酸乙酯，最优选为乙酸乙酯，卤代烃可以是氯仿、 二氯甲烷或四氯甲烷，最优选为氯仿，脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇，最 优选为甲醇，其中主机转速正转为600 1200rpm，优选800rpm，流动相泵入柱内的流速 为0.5 5mL/min，优选1.5mL/min，实验条件温度为10 30°C ，优选为25。C，上相为固 定相，下相为流动相；优选脂肪醇-水-酸或者脂肪腈-水-酸组成的溶剂体系进行高效液 相色谱分离制备，脂肪醇可以是甲醇、乙醇等，最优选为甲醇，脂肪腈最优选为乙腈， 酸可以是甲酸、乙酸、磷酸盐缓冲溶液等，最优选为乙酸，其中流速为5 20mL/min， 优选10mL/min，实验条件温度为10 30°C，优选为25t:，采用梯度洗脱的方式；由于 咖啡酰奎宁酸类化合物的不稳定性，分离和收集到的目标成分，必须立即真空干燥后重 结晶，重结晶溶剂为有机溶剂或水-有机溶剂的混合液，优选80%甲醇水溶液或80%乙 醇水溶液。 本发明采用高速逆流色谱仪，其根据被分离的物质在两相溶剂系统中的分配系 数不同而得到最终分离，这种分离技术由于不使用固体支持介质，避免了因与固体填料 发生不可逆吸附而造成的样品损失、失活变性等常规填料易产生的弊端，可使样品得以 全部回收，具有分离容量大、性能强、高效、快速的特点。对纯度达不到98%的咖啡酰 基奎宁酸类化合物结合高效制备液相色谱进行分离。通过控制实验条件，可以获得高纯 度的1-0-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸(纯度大于98% )。 本发明方法适 合于从各种工艺途径制备的含不同含量的咖啡酰奎宁酸类化合物的粗提物中制备高纯度 的l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸， 1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸单体化合物，适合于各种型号高速逆 流色谱仪以及高效制备液相色谱仪制备l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖 啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁 酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸 单体化合物，能直接使用大量咖啡酰奎宁酸粗提物或其中几种的混合物或其它类似合成 物进行进样。 下面通过实施例及附图进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用于说明本 发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行简单的改进都属于本发明 要求保护的范围。
图1为洋蓟粗提物的高效液相色谱图(HPLC)
图2为本发明的工艺流程图
具体实施例方式
1.将洋蓟全草于5(TC干燥，粉碎。取200g生药，置2000mL圆底烧瓶中，加 入75%乙醇1600mL，回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓縮至无醇味， 回收有机溶剂。将浓縮液进行D101大孔吸附树脂柱层析，先用水洗至无醇味，再依次 用20%， 40%的乙醇水溶液进行洗脱，收集40%乙醇洗脱液，减压浓縮至无醇味，加入 乙醇至含醇量80%，滤去沉淀，取上清液真空干燥得含二咖啡酰奎宁酸类化合物粗品。
将粗品进行高速逆流色谱分离纯化，条件为转速800rpm;溶剂体系乙酸乙酯-正
丁醇-水(3 :2:5， v/v);流速1.5mL/min;温度25°C ;上相为固定相，下相为流 动相；固定相保留率65%。逆流色谱的操作步骤为将HSCCC溶剂体系按比例配制于 分液漏斗中并剧烈振荡，体系分相平衡后分离出上下相，分别超声脱气30min。将固定 相泵入高速逆流色谱仪的螺旋管，待螺旋管完全充满后，开启速度控制器，使高速逆流 色谱仪按顺时针方向以800rpm旋转，同时以1.5mL/min的流速泵人流动相。当体系达 到流体动力学平衡后，将样品由进样阀注入分离管路。柱后流出物以紫外检测器检测。 根据色谱图收集色谱峰组分，分离得到九个流份，将各流份合并浓縮，使用分析型高效 液相色谱仪进行纯度检测。HPLC分析条件:色谱+卞Symmetry⑧(;(l()()r誦X:",mmi. d.， 5iim)，流动相为甲醇0.1%醋酸(40 : 60)，流速0.8mL/min，检测波长326nm， 柱温3(TC (在此条件下，洋蓟粗提物高效液相色谱图见图1)。对纯度小于98%的流 份经过0.45ym的膜过滤，进入制备型的高校液相色谱仪分离，制备柱为ZorbaxODS 9.4X250mm，流速为10ml/min，得到纯品。各纯品用80%乙醇进行重结晶得高纯度的 l-O-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1，3- 二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3，
4- 二 -0-咖啡酰奎宁酸和4， 5- 二 -0-咖啡酰奎宁酸单体化合物(工艺流程图见图2)。
权利要求
一种洋蓟中高纯度抗病毒活性组分1-O-咖啡酰奎宁酸，3-O-咖啡酰奎宁酸，4-O-咖啡酰奎宁酸，5-O-咖啡酰奎宁酸，1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸，1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸的分离纯化方法，由粗提物的制备和分离纯化两部分组成。其特征在于a)取含单咖啡酰奎宁酸类化合物和(或)双咖啡酰奎宁酸类化合物的植物为原料，粉碎或切成小段，用水或水-强极性的有机溶剂的混合液提取，浓缩提取液，回收溶剂，得浓缩液；b)取步骤a)得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用醇、酮或它们与水的混合溶剂洗脱；c)将步骤b)得到的洗脱液减压浓缩至无醇味或无酮味，干燥得含单咖啡酰奎宁酸类化合物和(或)双咖啡酰奎宁酸类化合物的粗品；d)将步骤c)得到的粗品醇沉除杂后，使用高速逆流色谱结合高效制备液相色谱分离和纯化，根据检测谱图接收目标成分流份；e)将步骤d)得到的流份减压浓缩至一定体积，真空干燥得目标化合物；f)将步骤e)得到的化合物，采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的1-O-咖啡酰奎宁酸，3-O-咖啡酰奎宁酸，4-O-咖啡酰奎宁酸，5-O-咖啡酰奎宁酸，1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸，1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸单体化合物。
2. 根据权利要求1所述的高纯度1-0-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡 酰奎宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸， 3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸的分 离纯化方法，其特征步骤在于a)中所用原料优选洋蓟，还包括含以上九种咖啡酰奎宁酸 类化合物中的一种或几种成分的天然产物；提取溶剂为醇水混合溶剂，提取溶剂的重量 为药材重量的1 20倍，提取时间为0.5 5小时，提取次数为1 5次；步骤b)中柱 层析所用介质为大孔吸附树脂、聚酰胺、反相硅胶或葡聚糖凝胶类；步骤c)减压浓縮至 无醇味或无酮味；步骤d)中除杂优选醇沉工艺，高速逆流色谱溶剂系统优选脂肪酯-脂 肪醇-水或者卣代烃-脂肪醇-水进行；高效制备液相色谱溶剂系统优选脂肪醇-水-酸或 者脂肪腈-水-酸进行；步骤e)中为真空干燥；步骤f)中重结晶溶剂为有机溶剂或水-有 机溶剂的混合液。
3. 根据权利要求1和2的提取植物，其中提取部位是根、茎、叶、种子、花、皮，或 者它们的混合物。
4. 权利要求3的植物提取物的制备方法，步骤a)中用70 80X的乙醇提取，提取 1 5次，每次用3 10倍量，每次提取0.5 4小时。
5. 根据权利要求2的植物提取物，其中步骤b)中柱层析所用介质为市售的大孔吸附 树脂或聚酰胺树脂以及改良的大孔吸附树脂或聚酰胺树脂，先用0 15%的乙醇水溶液 洗脱，接着用50 70%的乙醇水溶液洗脱，收集50 70%的乙醇洗脱液。
6. 根据权利要求5的制备方法，步骤c)的乙醇洗脱液浓縮后，先加入乙醇至含醇量 70 80%，除去沉淀，取上清液浓縮，得咖啡酰奎宁酸类化合物粗品。
7. 权利要求1 6之一的咖啡酰奎宁酸粗提物中咖啡酰奎宁酸类化合物的总含量为10% -90%。
8. 根据权利要求2中所述的1-0-咖啡酰奎宁酸，3-0-咖啡酰奎宁酸，4-0-咖啡酰奎 宁酸，5-0-咖啡酰奎宁酸，1， 3-二-0-咖啡酰奎宁酸，1， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸，3， 4-二-0-咖啡酰奎宁酸和4， 5-二-0-咖啡酰奎宁酸的纯化制 备方法，其特征在于，所述的步骤d)中优选脂肪酯-脂肪醇-水或者卤代烃-脂肪醇-水组 成的溶剂体系进行高速逆流色谱，脂肪酯可以是乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、甲酸 乙酯等；卤代烃可以是氯仿、二氯甲烷或四氯甲烷等，脂肪醇可以是甲醇、乙醇、异丙 醇或正丁醇。在氯仿-甲醇-水体系中，优选用量体积比为2 :2:1;在乙酸乙酯-正丁醇-水体系中，优选用量体积比为3 :2:5，以上相为固定相，下相为流动相。所述的步骤d)中优选脂肪醇-水-酸或者脂肪腈-水-酸组成的溶剂体系进行高效制备液相色 谱分离，脂肪醇可以是甲醇和乙醇等，脂肪腈可以是乙腈等，酸可以是乙酸、甲酸、磷 酸盐溶液等，采用梯度洗脱。
9. 根据权利要求8所述的一种高纯度咖啡酰奎宁酸类化合物的制备方法，其特征在 于在高速逆流色谱仪中，先用固定相存满逆流色谱仪柱子，调节主机转速，将流动相 泵入柱内，待整个体系建立动态平衡后，由进样阀进样，根据检测器紫外图谱接收目标 成分；其中主机转速正转为600 1200rpm，所述的流动相泵入柱内的流速为0.5 5mL/ min，实验条件温度为10 3(TC;在高效制备液相色谱仪中，色谱柱为半制备型C18柱， 流速为5 20mL/min，实验条件温度为10 30°C 。
10. 根据权利要求2所述的九个目标产物的纯化方法，其特征在于，所述的步骤f) 中，优选80 %的甲醇或80 %的乙醇进行重结晶。
全文摘要
本发明公开了一种高效分离制备洋蓟中高纯度抗病毒活性组分(单咖啡酰奎宁酸类化合物以及二咖啡酰奎宁酸类化合物)的方法，主要包括使用醇水溶液提取洋蓟鲜品或干品，浓缩后进行柱层析分离，制备富含抗病毒活性组分的粗提物，然后对粗提物再以高速逆流色谱结合高效制备液相色谱进行分离纯化，最后采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的1-O-咖啡酰奎宁酸，3-O-咖啡酰奎宁酸，4-O-咖啡酰奎宁酸，5-O-咖啡酰奎宁酸，1，3-二-O-咖啡酰奎宁酸，1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，3，4-二-O-咖啡酰奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰奎宁酸。该方法适用于以各种途径获得的各种含以上咖啡酰奎宁酸类化合物中的一种或几种成分的天然产物或天然产物提取物为原料制备高纯度单体，并且步骤简单，操作简便，效率高，成本低，易于重复，分离制备量大。使用该方法制备的咖啡酰奎宁酸类化合物的纯度可达98％。
文档编号C07C67/56GK101691330SQ20091004442
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月28日 优先权日2009年9月28日
发明者张宇平, 施树云 申请人:中南大学