专利名称：：用于类风湿关节炎免疫抗体体外检测的多肽组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种与免疫抗体相结合的多肽组合物，尤其涉及与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽组合物，更具体的是涉及一种至少有一个精氨酸被修饰的，用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物。
背景技术：
：临床上自身免疫疾病主要有系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征、皮肌炎、多发性肌炎、系统(多发)性硬化症、硬皮病等，这些疾病曾被命名为“结缔组织病”，后来国外和国内均将它们归为风湿性疾病。类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种较常见的以慢性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫疾病，其病程长，多反复，且会造成组织不可逆的损伤，而给患者造成很大痛苦。该病的发病率在世界范围内为0.5-1%，中国的发病率约为0.36%。患者发病年龄多在2050岁，女性多于男性，男女之比为13。最近流行病学统计，类风湿关节炎有逐年增加的趋势，其突出的早期临床表现为对称性关节红肿热痛、常见四肢小关节、指间近端关节肿胀、掌指、腕、肘和踝等关节肿痛及活动困难、晨间关节僵硬、午后逐渐减轻、关节外症状约有20%患者可出现皮下结节；长久不愈的晚期症状则有不同程度的关节畸形和强直，以及关节功能丧失等现象，还会损伤脏器和多组织器官，造成骨头缺血性坏死，对人体消耗大，致残率高。类风湿关节炎的病因至今尚不十分清楚，且早期临床表现也不典型。在国内外临床实践中，该疾病的常用诊断工具是美国风湿学学会(AmericanCollegeofRheumatology,ACR)在1987年制定的类风湿分类标准(ArthritisRheum1988，31，315-24)，该标准更依赖于类风湿关节炎所表现出的临床病症。但是，在该疾病早期，这些临床指标通常是不易操作的。因此，目前普遍认为这一标准不能较好适应于早期类风湿关节炎的诊断(ArthritisRheum2001,44,2485-91；NethJMed2002，60，383-8)。而目前使用的治疗类风湿关节炎的方法主要是采用消炎方法，这种方法虽能使得关节肿胀(swelling)和侵蚀(erosive)的程度得以减慢，却无法使疾病得到治愈。当前人们共同的观点认为，在该疾病早期采用多种方法治疗能得到最佳的治疗效果(AutoimmunityReviews2006，6，37-41)。由此，具有高专一性(Specificity)和高灵敏度(Sensitivity)的血清学检测标记对于类风湿关节炎在骨关节遭受损伤之前的早期诊断就显得尤为必要(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239—62)。研究发现一些自身免疫抗体虽然与类风湿关节炎疾病相联系，如抗calpastatin抗体(ProcNatlAcadSciUSA1995，92，7267-71)、抗中性粒细胞胞质抗体(anti-neutrophilcytoplasmicantibodies,ANCA)(IntArchAllergyImmunol1996,109，201-6)、核抗原抗体(anti-nuclearantigens,ANA)(ScandJRheumatol1986,15，185-92)、抗II型胶原抗体(anti-collagentypeII)(JImmunolMethods2001,247,191-203)和抗匍萄糖6磷酸异构酶(anti-glucose-6-phosphateisomerase,anti—GPI)(NatImmunol2001，2，746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康个体中检测出来(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239-62)。其中的某些抗体虽然能应用于风湿性疾病的识别，而且筛选这些抗体也有助于疾病监测和预测，但由于其对类风湿关节炎缺乏专一性，这些抗体中的绝大多数都很少应用于类风湿关节炎早期诊断(ClinicaChimicaActa2004，350，17-34)。对于类风湿关节炎早期诊断的理想标记(Marker)应当至少满足4个标准(1)高灵敏度，能检测的病人达到高百分比；(2)高专一性，尽可能地限制错误阳性结果的发生；(3)能适用于早期诊断；(4)能预见到某些病人会发展成侵蚀性疾病(erosivedisease)(AutoimmunityReviews2006,6,37-41；MEDICINE2006，34，441-4)。类风湿因子(rheumatoidfactor，RF)抗体作为血清学检测方法应用于ACR标准中，被公认为是IgG分子上Fc结构域的直接抗体。虽然其检测灵敏度范围可以达到60-80%，但其对于类风湿关节炎的专一性也比较一般，为60%。此外，RF同样可以在其它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5%健康人群中(其中10-30%的老年人)检测到(AnnRheumDis2003，62，261-3)。抗BiP(p68)抗体，抗Sa抗体和抗环状胍氨酸化蛋白抗体(APF、AKA、抗fiIaggrin和抗CCP)则对类风湿关节炎有更高的专一性。64%的类风湿关节炎病人能产生直接针对BiP的抗体，还有报道称其对该疾病具有高度的专一性，但目前没有数据支持BiP在预测类风湿关节炎方面具有作用，而且这些报道的BiP抗体还需要等待进一步通过独立的临床研究加以确认(ClinicaChimicaActa2004，350，17-34)。抗Sa抗体是源自于人脾脏和胎盘的提取物当中，分子量为50kDa的蛋白(InternalMedicine2005，44，1122-6)。另有研究揭示Sa抗原对于类风湿关节炎的专一性可以高达92-99%，但其灵敏度则显得一般，仅为30-40%(JRheumatol1994，21，1027-33;JRheumatol1999，26，7-13)。抗核周因子(antiperinuclearfactor,APF)首次披露于1964年。经研究这些自身免疫抗体对类风湿关节炎具有专一性，并能通过以人颊粘膜细胞为抗原底物的免疫荧光法间接测得(AnnRheumDis1964，23，302-5)。1979年研究者描述了一种类风湿关节炎专一性角质蛋白抗体，它能直接抑制角质层上皮细胞角质化，并将这类抗体的名称暂定为抗角质蛋白抗体(anti-keratinandtibody，AKA)(BMJ1979，2，97_9)。之后的研究证实，虽然AKA和APF的发现是互相独立的，但是两者所直接对应的抗原是一致的(J.Clin.Invest1995，95，2672-9)。许多研究进一步表明AKA和APF具有许多共同的特性，它们均对于RA患者表现出高度的专一性(InternalMedicine2005，44，1122-6)。Filaggrin(filamentaggregatingprotein)是一种互相交联的角蛋白丝状体，作用是形成非常坚固的细胞骨架结构，其也是AKA和APF的常见抗原(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239-62)。其中，APF的目标抗原为profilaggrin，而AKA的抗原为filaggrin(JClinInvest1995，95，2672-9)。虽然AKA和APF对于类风湿关节炎具有专一性，但其缺陷也很突出。这两种抗体的检测灵敏度严重依赖于filaggrin的纯化方法。实践中，由于难以分离得到纯的且胍基含量具有可重复性的抗原，再加上其检测手段不简便，以及荧光免疫检测过程需要耗费较大的工作量，从而使得实验室间难以形成标准化，导致AKA和APF没有成为类风湿关节炎检测的主流方法(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239-62)。基于filaggrin和profiIaggrin是AKA和APF抗体靶点的知识，人们合成了含有瓜氨酸的多肽以检测类风湿关节炎血清中AKA和APF抗体的活性。由于瓜氨酸不是基本氨基酸而无法在蛋白质翻译中加入，因此通常的方法是通过肽精氨酸脱亚胺酶(peptidylargninedeiminine,PAD,EC3.5.3.15)催化精氨酸残基脱氨基得到。根据这些事实，一些从filaggrin序列中衍生出来的精氨酸侧链经修饰的，尤其是含有瓜氨酸的多肽被合成出来，并用于类风湿关节炎抗体的体外检测(US6，858，438)。在用酶联免疫吸附(Enzyme-LinkedimmunosorbentAssay,ELISA)方法检测实验中，这一方法合成的含有瓜氨酸直线性多肽能从类风湿关节炎患者血清中检测出抗瓜氨酸肽抗体，在保持高专一性(大于90%)的情况下，还大大提高了检测的灵敏度(达到63%)。实验还证明，只有含瓜氨酸的多肽才能实现该反应，若将多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替则完全没有反应发生。这些结果表明，瓜氨酸部分是决定能被AKA和APF抗体识别的抗原决定因子(JClinInvest1998，101，273-81)。其它研究者发现将含有瓜氨酸的直线性多肽通过二硫键(S-S键)形成环形结构的方式能模拟类似转角结构，从而模仿最初抗原决定簇的转角结构，并可增加多肽-抗体的亲和力(FASEBJ1995,9,37-42；MolImmunol1985，22，1255-64)。由此，一种环状肽被人工合成出来，其将filaggrin主要表位上的两个丝氨酸换成半胱氨酸后，再由二硫键环化形成，即第一代环瓜氨酸肽(thefirstgenerationcycliccitrullinatedpeptide,CCP1)(InternalMedicine2005，44，1122-6)。研究者将一条由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸肽中两个丝氨酸替换为半胱氨酸形成与β“转角具有相似结构的二硫键，得到人工合成CCP，并将CCPl与直线肽的检测结果作了比较。结果显示，采用CCPl为抗原的多肽用ELISA法检测RA患者的抗CCP抗体，灵敏度较用直线性瓜氨酸肽为抗原有显著提高，分别为68%和49%，二者专一性相似(ArthritisRheum2000，43，155-63)。穆荣等人在266例RA患者和186例对照者血清中检测RF和AKA抗体、APF和抗CCP抗体的方式，评估了抗聚丝蛋白抗体群(anti-filaggrinantibodies，AFAs)与RF联合检测的意义。由于AKA和APF的敏感性太低，临床上以RF和抗CCP抗体的联合测定更为实用(北京大学学报(医学版)2005，37，894)。研究还发现，通过检测抗CCP抗体还能作为类风湿关节炎早期病人一项重要指标，为这类人群的早期防治提供参考(JIndiaRheumatolAssoc2004，12，143-6)，其还能预测侵蚀性疾病(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反应模式中，类风湿关节炎血清检测表现出巨大的可变性。类风湿关节炎患者的血清/血浆中除了filaggrin精氨酸残基被瓜氨酸化外，Sa抗原、胶原蛋白(I和II型)、组蛋白、髓磷脂碱蛋白、纤维连接蛋白等也出现瓜氨酸化，并产生抗CCP抗体。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脱氨基转化为瓜氨酸；己瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全参与形成抗原表位，即产生抗CCP抗体。综上，抗瓜氨酸抗体的产生与瓜氨酸密切相关，并且瓜氨酸的侧翼序列对抗瓜氨酸抗体的产生起重要作用，这一事实暗示着瓜氨酸残基的周边氨基酸对于抗原表位(antigenepisode)具有重要作用，以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗体)活性是多克隆反应(JClinInvest1998，101，273-81)。基于filaggrin的属性，它被认为是模拟瓜氨酸抗原表位的天然库藏(ClinAppliedImmunolRev2004，4，239—62)。第二代CCP(CCP2)检测方法产生于2002年，通过将含有瓜氨酸的多肽库与类风湿关节炎血清筛选得到与filaggrin无关的第二代CCP，其具有更有利于抗体检测的表位(Reportonthe5thDresdensymposiumonautoantibodies.Lengerich,Germany:PabstSciencePublishers；2000.p.140-5)。将CCPl和CCP2经同一组病人测试后表明，CCP2不仅保持了较高专一性(96%)，而且其分析灵敏度也有显著的提高(Arm.Rheum.Dis.2005，64，1510-2)。许多研究者在最近5年的研究证明，抗含瓜氨酸多肽的测试的灵敏度具有较高的可变性，范围在40%-94%(Clin.ExpRheumatol.2005，23(Supp139)，569-76；Ann.Rheum.Dis.2006，65，845-51)。CCP2在类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测中得到应用说明了在该领域的检测抗原的筛选并不需要仅仅依赖filaggrin，也说明与filaggrin不同的结合表位能更有利于体外检测。BizzaroN等人(ClinChem2007，53，1527-33)和LutteriL等人(ClinicaChimicaActa2007，386，76-81)分别针对现在市场上使用的第二代和第三代CCP试剂盒(Kit)进行了比较，结果发现，伊诺瓦诊断(InovaDiagnostics)公司开发的三种检测方法中，其CCP3试剂盒与使用CCP2为抗原的方法相比仅仅略有改善，各自的灵敏度分别为67%和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3.0与即能检测IgG又能检测IgA的CCP3.1的检测方法相比后发现，两者竟然没有丝毫差别。可见，同时检测IgG和IgA抗体的方法并没有象看上去那样有显著改进。他们的结论是由于测试的诊断试剂盒灵敏度可能与胍基化精氨酸残基的位置和数量有关，而专一性则可能受到蛋白质或杂多肽序列的影响，因此，对此二者而言，抗原的种类显得更为重要。两者综合考虑，实验数据表明抗原的制备是决定测定方法优劣的最重要的可变因素。LutteriL等人(ClinicaChimicaActa2007，386，76-81)的研究还发现了抗CCP的另一个价值，他们指出，IgM-RF是最灵敏的标记，能在77.9%的类风湿关节炎患者中发现。必须注意的是，作为ACR标准中的RF，其类风湿关节炎诊断中灵敏度不能直接与那些没有包括在诊断标准中的其它方法相比较。IgM-RF被认为在疾病专一性方面略有欠缺。使用IgM-RF检测类风湿关节炎患者，其中有13-19%的人为RF阴性，与之相比，当这些患者使用抗CCP方法检测时均为阳性。类风湿关节炎的遗传因素会影响瓜氨酸化蛋白的出现和产生，也会影响针对这些修饰蛋白的抗体产物(ClinicaChimicaActa2004，350，17-34)。一系列相关研究表明，类风湿关节炎与某些HLA-DR等位基因有密切联系，尤其是HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404(Cell1996，85，307-10)。与相应的含有精氨酸的多肽相比，将多肽瓜氨酸化就能与HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404两种“袋形”抗原更好地结合(JIndiaRheumatolAssoc2004，12，143-6)。在不同地区的人群中，这些等位基因也略有不同。DRB1*0401主要出现在北欧和北美地区的人群中，有证据表明该基因与类风湿关节炎所导致的“特大关节，，表征(extraarticularmanifestations)有联系，在DRB1*0401/DRB1*0404杂合基因型中尤为突出。DRB1*0403、DRB1*0406和DRB1*0407与DRB1*0401、*0404或*0101基因组合后会增加类风湿关节炎病情的发展可能。DRB1*0404与DRB1*0408只要存在于白色人种中。DRB1*0405很少在北欧人群中，但在亚洲和环地中海沿岸国家的人群中极其普遍。DRB1*0101主要存在于北欧和北美人群中。美洲印第安人群中则为DRB1*1402和*1406(HumImmuno2000，61，1254-1261)。虽然这些与类风湿关节炎相关的基因在各地区人群中各有不同，但研究发现在DRBl的第三高度可变区(HV3)具有共享表位(sharedepitope,SE)，在70-74位氨基酸残基都为QKRAA、QRRAA或RRRAA(ClinicaChimicaActa2004,350,17-34)。将一群有几个共享表位基因型的类风湿关节炎患者与具有抗CCP2抗体的患者比较研究表明，一种共享表位等位基因与抗CCP2抗体的产生具有密切的内在联系(ArthritisRheum2000,50,2113-21；ArthritisResTher2004，6，R303-8)。经证实，这一关联是由于MHC分子共享表位β链的70-74位氨基酸残基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4个锚定袋(P4)，其与电中性或负电荷氨基酸具有高度亲和性(JImmuno2003，171，538-541)。当带正电荷精氨酸在PAD酶作用下转换成电中性的瓜氨酸后，得到的翻译后修饰蛋白/多肽亲和力远远大于精氨酸与P4的亲和力，并能够激活⑶4+T细胞，这些“瓜氨酸特异T细胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗体的产生(JImmuno2003，171，538-541；ArthritisRheum1987,30,1205-13；RheumDisClinNorthAm1992,18,741-59；ArthritisRheum2005,52，1063-68)。这些结果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活类风湿关节炎患者自身免疫反应。综合目前的研究结果，抗CCP抗体对RA具有较高的专一性，能将RA与其它与RA相似的疾病相区分，这类抗体存在于绝大多数的病人体内，在疾病的早期就能检测到，有助于对疾病的预测，能通过简单的方式加以检测(JIndiaRheumatolAssoc2004，12，143-6)。目前类风湿关节炎检测方法通常使用单一的多肽抗原。虽然这些从filaggrin衍生出的或人工设计的环形或直线型多肽在类风湿关节炎抗体检测中都表现出较高的专一性(>90%)，但是由于类风湿关节炎患者存在众多的HLA-DR等位基因，由此产生的抗体也相应地有所差异，这使得检测灵敏度则始终得不到明显提高(<70%)。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽。本发明的另一个目的在于提供一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物。一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；XaalO为Ala或Ile；Xaall为Ala或Arg，其中至少有一个精氨酸被修饰。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为修饰的Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；XaalO为Ala或Ile；Xaall为Ala或Arg0另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为Gly或His；Xaa7为修饰的Arg；Xaa8为Ser或Arg；Xaa9为Arg或Leu；XaalO为Ala或Ile；Xaall为Ala或Arg0上述与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，所述修饰的Arg为侧链修饰的Arg，其侧链具有通式(I)所示的结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中Gl为0、NH或CH2；G2为NH2,CH3>NHCH3或N(CH3)2；G3为0、NH、NHCH3>NHCH3；η为2、3或4；其中当Gl为NH，G2为NH2时，G3不为ΝΗ。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg0所述修饰的Arg为瓜氨酸(Cit)，即当Gl为NH，G2为NH2,G3为0，及η为3。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg0所述修饰的Arg为瓜氨酸(Cit)，即当Gl为NH，G2为NH2,G3为0，及η为3。另一种与类风湿关节炎免疫抗体相结合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg0所述修饰的Arg为瓜氨酸(Cit)，即当Gl为NH，G2为NH2,G3为0，及η为3。上述多肽能与类风湿自身免疫抗体相结合，形成抗原-抗体复合物(Complex)。上述多肽能与HLA-DR分子具有高亲和力，与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物。一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I,His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8_Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；多肽II，His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；多肽III,His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；所述修饰的Arg为侧链修饰的Arg，其侧链具有通式(I)所示的结构〒ι式IHCr/\G2G3其中Gl为0、NH或CH2；G2为NH2,CH3>NHCH3或N(CH3)2；G3为0、NH、NHCH3>NHCH3；η为2、3或4；其中当Gl为NH，G2为NH2时，G3不为ΝΗ。另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I,His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8_Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；多肽II,His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；多肽III,His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-XaalO-Cys-Gly,其中，Xaal为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；XaalO为Ala或Arg；所述修饰的Arg为瓜氨酸(Cit)，即当Gl为NH，G2为NH2,G3为0，及η为3。另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Xaa2-Xaa3-Arg-His-Cit-Xaa4-Xaa5_Xaa6-Xaa7-Cys-Gly,其中，Xaal为Gln或Arg；Xaa2为Arg或Gln；Xaa3为Phe或Met；Xaa4为Ser或Arg；Xaa5为Arg或Leu；Xaa6为Ala或Ile；Xaa7为Ala或Arg；多肽II，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Xaa2-Xaa3-Cit-His-Cit-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Gly,其中，Xaal为Gln或Arg；Xaa2为Arg或Gln；Xaa3为Phe或Met；Xaa4为Ser或Arg；Xaa5为Arg或Leu；Xaa6为Ala或Ile；Xaa7为Ala或Arg；多肽III，His-Gln-Cys-His-Xaal-Phe-Xaa2-Xaa3-Cit-Gly-Cit-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Cys-Gly,其中，Xaal为Gln或Arg；Xaa2为Arg或Gln；Xaa3为Phe或Met；Xaa4为Ser或Arg；Xaa5为Arg或Leu；Xaa6为Ala或Ile；Xaa7为Ala或Arg0另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Xaa2-Xaa3-Arg-His-Cit-Xaa4-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Arg或Gln；Xaa3为Phe或Met；Xaa4为Ser或Arg；多肽II，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Xaal-Cit-His-Cit-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Phe或Met；Xaa2为Ser或Arg；Xaa3为Arg或Leu；Xaa4为Ala或Ile；多肽III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Gly-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Phe或Met；Xaa3为Ser或Arg；Xaa4为Arg或Leu0另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Gln-Xaa2-Arg-His-Cit-Xaa3-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Phe或Met；Xaa3为Ser或Arg；多肽II，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Xaal-Met-Cit-His-Cit-Xaa2-Xaa3-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Ser或Arg；Xaa3为Arg或Leu；多肽III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Phe-Cit-Gly-Cit-Xaa2-Xaa3-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Ser或Arg；Xaa3为Arg或Leu0上述组成多肽组合物的各种多肽是通过各自序列中的不相邻的两个Cys之间形成二硫键。所形成的二硫键能使该多肽具有环状结构并能模拟转角结构，使得该多肽不仅具有与HLA-DR分子具有高亲和力，与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物；还能与抗CCP抗体高效结合，形成抗原_抗体复合物。另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Gln-Xaa2-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Phe或Met；多肽II,His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Xaal-Met-Cit-His-Cit-Xaa2-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Ser或Arg；多肽III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Xaa3-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；Xaa2为Arg或Leu；所述多肽I、II和III第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽I，His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Gln-Met-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；多肽II，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Xaal-Met-Cit-His-Cit-Ser-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其中，Xaal为Arg或Gln；多肽III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly,所述多肽I、II和III第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。上述组成多肽组合物的各种多肽的摩尔比为0.1-10.1-10.1-1。另一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，$月太I，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly；多肽II，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Cit-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly；多肽III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly,所述多肽I、II和III第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。上述组成多肽组合物的各种多肽的摩尔比为111。本发明所述的多肽为通过化学方法直接合成或先通过化学合成或基因工程方法，即将从表达载体中分离纯化得到的的多肽再经过修饰精氨酸侧链的步骤得到。具体地说，所述的多肽通过化学方法直接合成，或先通过化学方法合成后，再由PAD酶修饰精氨酸侧链得到。本发明所述的多肽能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合。进一步地说，所述的多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于90%。进一步地说，所述的多肽对类风湿关节炎自身免疫抗体的灵敏度大于70%。更进一步的，所述的多肽对类风湿关节炎自身免疫抗体的灵敏度大于75%。本发明所述的多肽对HLA-DR具有高亲和力，与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物。本发明所述的多肽及其组合物能应用于类风湿关节炎疾病自身免疫抗体的体外检测。本发明所述的类风湿关节炎疾病自身免疫抗体的体外检测的应用，其一般方法为将待测血清(serums)与包含有上述的多肽(即抗原)试剂混合，检测所述多肽与血清中抗体所形成的复合物。检测结果呈阳性表明，该血清中具有类风湿关节炎疾病自身免疫抗体。检测介质选择固相或液相。固相介质选择塑料板、玻璃片或试纸条。塑料应当理解为全部或部份由碳与氧、氢、氮及其它有机及无机元素化合而成，在制造的最后阶段成为固体，在制造中某些阶段是液体(塑料材料在成为最终产品以前，在某些阶段必需要能够流动)，因而可以加热或加压力，或二者并用的方式，使其形成各种形状，此庞大而变化多端的材料族类中的任何一种，如树脂、热固性树脂、纤维素衍生物等，在一条长链的分子结构中存在众多的重复原子或分子。塑料包括人工合成或自然界有机材料。玻璃应当被理解为易碎的非晶体物质，这些物质可以是透明的也可以是半透明的，通常由熔融硅和硅碳酸盐融合组成。玻璃还可以认为是一类不具有结晶过程，而是由熔化状态固化而来的材料，大体上由Na20、Ca0和6Si02化学氧化物组成，具有光学属性和各种机械属性。具体的，塑料板是由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚碳酸酯等制成的直板或具有多孔构造的酶标板；试纸条是由聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚酯等制成的膜。在所述塑料板或试纸条上结合有检测所需的上述多肽或多肽组合物。检测方法可以有多种，例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术和蛋白芯片检测技术等。一般选择间接酶联免疫测定，即间接ELISA方法。所述的ELISA检测方法具体的实验步骤可以参见US6，858，438中关于ELISA检测的相应部分。其基本原理是多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。应用于ELISA检测方法中的上述多肽及其组合物，还可以为经生物素标记的多肽及其组合物，其能与亲和素或链霉亲和素非共价结合。所述的亲和素(Avidin)是一种相对分子质量为68，000Da，pi为10.5的一种碱性糖蛋白，又称卵白素，在鸡蛋清中含量比较丰富，一般从蛋白清中提取。所述的链霉亲和素(Streptavidin)是一种从链霉菌(Streptomycesavidinii)培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60，OOODa，不具有糖链。其特性与亲和素一样，也具有4个生物素结合位点，与生物素具有高亲和力。所述的多肽与生物素标记相结合的方法可以通过先由固相合成或基因工程表达并纯化，所得多肽再与生物素连接并纯化(如申请号为200310108264.0中国发明专利所公开的技术方案)。所述的多肽与生物素标记相结合的方法还可以在多肽的固相合成过程中先与生物素连接再纯化的方式(P印t.Res.1989，2，189-194)。具体的，所述的结合有生物素的多肽，其上生物素与多肽的N末端相结合。在ELISA检测方法中，所述的抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的抗人IgG抗体其具体配制方式为，取20μL储存液，加800ml抗体稀释液作140000稀释，混勻，分装标准小瓶，每瓶15ml，28°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制方式为称取柠檬酸17.9g和Na2HPO4·12Η204.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30%H2O2330μL，搅拌均勻后，加水至500ml，28°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制方式为称取四甲基联苯氨(tetramethylbenzidine,TMB)0.Ig于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO)2.5ml,在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml6MHCL，直至完全溶解，最后加水至500ml，28°C下保存。其中HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制方式分别量取55ml98%H2SO4和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混勻，28°C下保存。酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD45tl值。本发明技术方案实现的有益效果本发明所述的多肽组合物，其各自序列上至少有一精氨酸侧链经修饰后呈现电中性或电负性，并优先选择瓜氨酸。通过各自序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键的方式，产生环状的多肽。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA-DR具有高亲和力。经过实验验证，该类多肽与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于90%，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75%。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。实施例1多肽I的合成多肽采用Fmoc化学方法，通过固相合成技术合成。该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994，24，3188-3193J.Org.Chem.1972，37，3404-3409；黄惟德，陈常庆多肽合成，北京科学出版社，1985。二硫键的形成方法及其步骤可以参见文献黄惟德，陈常庆多肽合成，北京科学出版社，1985,p85;MichaelW.PenningtonPeptideSynthesisProtocols(MethodsinMolecularBiology),HumanaPress，1994，p91_169。通过上述步骤，合成多肽的具体序列为^月太I:His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟转角结构。实施例2多肽II的合成根据实施例1所公开的方法合成多肽II=His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Gln-Met-Cit-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly,其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟转角结构。实施例3多肽III的合成根据实施例1所公开的方法合成多肽III=His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly,其上第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构，并能模拟转角结构。实施例4多肽的纯化先将蛋白质或多肽末端的保护基在二甲基酰胺(DMF)溶剂中脱保护，中和。再用氟化氢将多肽从合成树脂上切下，得到的粗产物经过反相色谱C18或C8柱(如5μπι，250X4.6mm)，以流动相A(0.1%(ν/ν)三氟乙酸乙腈溶液)和流动相B(0.1%(ν/ν)三氟乙酸水溶液)为梯度洗脱溶剂。在45分钟内，流动相A占Α、Β两相总体积0%(ν/ν)变化至IJ100%(ν/ν)收集得到目标多肽，通过脱盐色谱柱(GEHealthcare)或旋转蒸发去除有机溶剂，目标多肽可以通过LC-MS连用或将收集得到的多肽直接进样的方式通过ESI质谱得到的分子量来确定。(参见中国分析化学2002，30，1126-9)实施例5多肽I和多肽II的纯度与分子量检测上述合成出的多肽I和多肽II分别通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4.6X250mm5ymC18分析柱(Kromasil)；流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic，TFA)加入100%腈(acetonitrile,ACN)中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流速为1.Oml/min；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两项总体积15%(ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(GradientElution)，在25分钟内流动相A占A、B两项总体积从15%(ν/ν)改变至50%(ν/ν)的比例，之后以100%(ν/ν)流动相A平衡5分钟。多肽I的保留时间(RetentionTime)为12.5，其纯度大于95%。多肽II的保留时间为13.2，其纯度大于95%。通过ESI质谱分别测定多肽I和多肽II的分子量，其具体条件为质谱(Probe)ESI质谱电压(Probebias)+4.5kv喷雾器流速(NebulizerGasFlow)1.5L/min检测器(Detector)1.5kv样品电离化装置(CDL)-20.Ov流动相流速(Τ·Flow)0.2ml/minCDL温度(CDLTemp)250°C缓冲液浓度(B.conc)50%H2O,50%ACN加热块温度(BlockTemp)200°C多肽I分子量为2167.59Da；多肽II分子量为2168.58Da。实施例6多肽III的纯度与分子量检测上述合成出的多肽III通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4.6X250mm5ymC18分析柱(Kromasil)；流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic,TFA)加入100%乙腈(acetonitrile,ACN)中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流速为1.Oml/min；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两相总体积10%(ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(GradientElution)，在25分钟内流动相A占A、B两相总体积从10%(ν/ν)改变至35%(ν/ν)的比例，之后以100%(ν/ν)流动相A平衡5分钟。多肽III的保留时间为9.32，其纯度大于95%。使用与实施例5相同的质谱条件，测定多肽III的分子量为2017.26Da。实施例7多肽的生物素标记生物素-多肽I、II和III均采用在固相合成过程中先与生物素连接再纯化的方式分别进行，其具体方式参见Deibel，M.R.，Jr.，Lobl，T.J.andYem,Α.W.,Atechniqueforrapidpurificationoflowyieldproducts:Biotinylationofchemicallysynthesizedproteinson-resin.Pept.Res.1989,2,189-194。当生物素通过缩合剂在多肽合成时直接缩合后，使用Kaisertest检测缩合反应是否完全。该反应的详细说明请参见Sigma-Aldrich60017产品说明(60017DataSheet)，该方法可不仅应用于定性(AnalyticalBiochemistryl970,34，595)，还能进行定量(AnalyticalBiochemistry1981，117，147)检测。通过实施例1公开的二硫键形成方法，在多肽第三位和第十六位Cys通过巯基形成二硫键，并使多肽形成环状结构。实施例8多肽与生物素结合后的分离和纯化在树脂上进行生物素标记。首先，蛋白质或多肽末端在二甲基酰胺(DMF)溶剂中脱保护，中和；然后与N-羟基琥珀酰亚胺生物素反应(即生物素化)，反应条件为45°C24小时；再用氟化氢将标记有生物素的多肽切下，得到的粗产物经过亲和素偶联琼脂的亲和层析柱(GEHealthcare)，用磷酸盐缓冲液洗涤，去除未结合的成分，最后用0.IM的甘氨酸溶液(PH2.0)洗脱，得到生物素化的蛋白质或多肽。实施例9生物素_多肽I和II的纯度与分子量检测上述合成出的环形生物素_多肽I和II分别通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4.6X250mm5ymC18分析柱(Kromasil)；流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic,TFA)加入100%乙腈(acetonitrile,ACN)中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流速为1.Oml/min；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两项总体积15%(ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(GradientElution)，在25分钟内流动相A占A、B两项总体积从15%(ν/ν)改变至50%(ν/ν)的比例，之后以100%(ν/ν)流动相A平衡5分钟。环形生物素-多肽1的保留时间为8.4，其纯度大于95%。环形生物素-多肽2的保留时间为13.5，其纯度大于95%。通过ESI质谱分别测定多肽I和多肽II的分子量，其具体条件为质谱(Probe)ESI质谱电压(Probebias)+4.5kv喷雾器流速(NebulizerGasFlow)1.5L/min检测器(Detector)1.5kv样品电离化装置(CDL)-20.Ov流动相流速(Τ·Flow)0.2ml/minCDL温度(CDLTemp)250°C缓冲液浓度(B.conc)50%H2O,50%ACN加热块温度(BlockTemp)200°C根据峰值和其所带的电荷来计算，生物素_多肽I分子量为2393.9Da；生物素-多肽II分子量2394.89Da。实施例10生物素_多肽III的纯度与分子量检测上述合成出的环形生物素-多肽III通过反相色谱(RP-HPLC)测定，其具体方法为4.6X250mm5ymC18分析柱(Kromasil)；流动相A为三氟乙酸(trifluoroacetic,TFA)加入100%乙腈(acetonitrile,ACN)中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流动相B为TFA加入100%水中，使得TFA浓度为0.1%(ν/ν)；流速为1.Oml/min；检测波长为220nm;洗脱梯度以流动相A占A、B两相总体积15%(ν/ν)的比例平衡，进样后，采用线性梯度洗脱(GradientElution)，在25分钟内流动相A占A、B两相总体积从15%(ν/ν)改变至40%(ν/ν)的比例，之后以100%(ν/ν)流动相A平衡5分钟。生物素-环形多肽的保留时间为17.76，其纯度大于95%。通过ESI质谱分别测定多肽的分子量，其具体条件为使用与实施例9相同的质谱条件，测定生物素_环形多肽III分子量为2243.57Da。实施例11类风湿关节炎抗体的体外检测使用ELISA方法检测类风湿关节炎患者的血清中自身免疫抗体，具体的实验步骤可以参见US6，858，438中关于ELISA检测的相应部分。其基本原理是多肽(抗原)包被在酶标板表面，将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。本发明所述的抗人IgG抗体为HRP标记的兔抗人IgG抗体采购于武汉博士德生物工程有限公司(货号BA1070)。其具体配制方式为，取20μL储存液，加800ml抗体稀释液作140000稀释，混勻，分装标准小瓶，每瓶15ml，28°C下保存。抗体稀释液购自Pierce公司(货号37552)。HRP标记的抗人IgG抗体底物A配制称取柠檬酸17.9g和Na2HPO4·12H204.67g溶解于400ml去离子水中，然后缓慢加入30%Η202330μL，搅拌均勻后，加水至500ml，28°C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物B配制称取四甲基联苯氨(tetramethylbenzidine,TMB)0.Ig于100ml去离子水中，加入二甲基亚砜(DMSO)2.5ml，在搅拌的同时，缓慢加入0.5ml6MHC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，28°C下保存。HRP标记的抗人IgG抗体底物反应终止液的配制分别量取55ml98%H2SO4和去离子水445ml，然后将浓硫酸缓慢加入到去离子水中，混勻，28°C下保存。酶标仪测定波长设定在450nm，30分钟内测定各孔OD45tl值。将实施例1-3中合成的三种未经标记生物素的环形多肽以摩尔比为111与类风湿关节炎患者血清进行实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>多肽组合物灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)=109/144=75.7%将实施例1-3中合成的三种环形多肽以摩尔比为111与非类风湿关节炎患者血清进行实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>多肽组合物专一性=真阴性/(真阴性+假阳性)=224/246=91.1%实施例12生物素标记多肽组合物用于类风湿关节炎抗体的体外检测加有0.05%(v/v)Tween-20的pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBST)稀释链霉亲和素，使其浓度为5μg/ml。然后加入到酶标板各孔中，4°C过夜，取出酶标板，去除包被液，用pH7.4的PBST溶液洗2次，然后加入PBST稀释的生物素标记的多肽，室温孵育1小时(在脱色摇床上混勻)，洗板，备用。将稀释后的待检血清/血浆和对照物加入反应板孔中，如果被检血清/血浆中存在抗CCP抗体，经温育后，则血清/血浆中特异性抗体与反应板孔中的CCP抗原多肽结合，形成固相抗原-抗体复合物，洗去未结合的血清/血浆中其它成分，加入酶标记的抗人IgG抗体，温育，固相CCP抗原(多肽)结合的抗CCP抗体再与酶标记的抗人IgG抗体结合，洗去未结合的酶标记抗体成分，加入酶底物，并被催化成为有色产物，最后加入终止液终止反应。根据试剂盒内的对照物，可对抗CCP抗体进行定量或定性测定。后续操作及所用试剂与实施例11记载相一致。将使用实施例9和10中公开的方法合成的三种环形生物素-多肽I、II和III以摩尔比为111与类风湿关节炎患者血清进行实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>生物素多肽组合物灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)=105/129=81.4%将使用实施例9和10中公开的方法合成的三种环形生物素-多肽I、II和III以摩尔比为111与非类风湿关节炎患者血清进行实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>生物素多肽组合物专一性=真阴性/(真阴性+假阳性)=240/261=92.0%序列表<110>上海荣盛生物药业有限公司<120>用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物<130>0911143<160>3<170>PatentInversion3.3<210>SEQIDNo1<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>1HisGlnCysAlaArgPheGlnMetArgHisXaaArgLeulieArgCys151015Gly<210>SEQIDNo2<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>2HisGlnCysAlaArgPheGlnMetXaaHisXaaArgLeulieAlaCys151015Gly<210>SEQIDNo3<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa为瓜氨酸<400>3HisGlnCysHisGlnPheArgPheXaaGlyXaaSerArgAlaAlaCys151015Gly权利要求一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，由三种多肽组成，多肽Ⅰ，His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg；多肽Ⅱ，His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg；多肽Ⅲ，His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Cys-Gly，其中，Xaa1为His或Ala；Xaa2为Gln或Arg；Xaa3为Arg或Gln；Xaa4为Phe或Met；Xaa5为修饰的Arg；Xaa6为修饰的Arg；Xaa7为Ser或Arg；Xaa8为Arg或Leu；Xaa9为Ala或Ile；Xaa10为Ala或Arg；所述修饰的Arg为侧链修饰的Arg，其侧链具有通式I所示的结构式I其中G1为O、NH或CH2；G2为NH2、CH3、NHCH3或N(CH3)2；G3为O、NH、NHCH3、NHCH3；n为2、3或4；其中当G1为NH，G2为NH2时，G3不为NH。F2009100479424C00011.tif2.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述多肽组合物为，肽组合物，其特征在于所述多肽组合物为，多肽I,His-Gln-Cys-Ala-Xaal-Phe-Gln-Met-Arg-His-Cit-Arg-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其中，Xaal为Arg或Gln；多月太II，His-Gln-Cys-Ala-Arg-Phe-Xaal-Met-Cit-His-Cit-Ser-Leu-Ile-Arg-Cys-Gly，其中，Xaal为Arg或Gln；多月太III，His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Gly-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gl3.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，组成所述多肽组合物的各种多肽的摩尔比为0.1-10.1-10.1-1。4.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，组成所述多肽组合物的各种多肽的摩尔比为111。5.根据权利要求1所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述的多肽I、II和III结合有生物素标记。6.根据权利要求5所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述的多肽I、II和III的N末端结合有生物素标记。7.根据权利要求5所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述的标记有生物素的多肽与亲和素或链霉亲和素非共价结合。8.根据权利要求1-7之一所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述多肽I、II和III与HLA-DR相结合形成HLA-DR-多肽复合物。9.根据权利要求1-7之一所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，其特征在于所述多肽I、II和III在第三位Cys与第十六位Cys之间形成二硫键。10.根据权利要求9所述的用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，在类风湿关节炎自身免疫抗体体外ELISA检测中的应用。全文摘要一种用于类风湿关节炎自身免疫抗体体外检测的多肽组合物，各种多肽序列中至少有一精氨酸侧链被修饰为电中性或电负性氨基酸。通过序列上两个不相邻的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键的方式，产生环状的多肽。这类多肽不仅能与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合，同时还能对HLA-DR具有高亲和力。经过实验验证，该类多肽组合物与类风湿关节炎自身免疫抗体相结合的专一性大于90％，对类风湿关节炎自身免疫抗体的检测灵敏度大于75％。与市场上销售的同类产品相比，其灵敏度得到显著提高，更有利于类风湿关节炎自身免疫抗体的体外检测。文档编号C07K19/00GK101819201SQ20091004794公开日2010年9月1日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者朱绍荣申请人:上海荣盛生物药业有限公司