专利名称：一种高亲和力的抗cd20单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程产品领域，更具体地，本发明公开了一种具有高亲和力的抗 CD20单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二 位。非霍奇金淋巴瘤(Non Hodgkin's lymphoma, NHL)是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤， 其中B细胞来源的约占85 %，好发于青壮年，发病率和病死率呈逐年上升趋势。根据病情 特点，NHL可分为低、中、高三度。其中低度和部分中度NHL病程进展缓慢，统称为惰性NHL。 它们对首次化疗敏感，但很容易复发或耐药，当再次化疗或放疗时，疗效明显降低，因而被 认为是难以治愈的恶性肿瘤。近年来，单克隆抗体及其导向治疗NHL的临床试验研究取得 了重大进展，其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单抗制剂。CD20抗原是一种B细胞 分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95%以上的B细胞性淋巴瘤中表达，且表面 密度很高，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。更为重要的是，CD20分子 在与单克隆抗体结合后，无显著内化及脱落，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点[^cchi S,Federico M,Dastoli G,Fiorani C,Vinci G,Clo V,Casolari B.Treatment of B—cell non-Hodgkin' s lymphoma with anti CD 20 monoclonal antibodyRituximab. Crit Rev Oncol Hematol，2001，37(1) :13-25]。
目前采用抗CD20抗体治疗非霍奇金淋巴瘤已取得了较好的疗效。 Rituxan(Rituximab, C2B8)为美国基因科技公司研制的以⑶20为靶点的单克隆抗体，它 是一种人鼠嵌合基因工程抗体，包含了鼠单克隆抗体的可变区基因和人抗体的恒定区基因 [Reff ME, Carner K，Chambers KS, Chinn PC，Leonard JE, Raab R，Newman RA, Hanna N， Anderson DR. Depletionof B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood. 1994,83(2) :435-45]。Rituxan 已于 1997 年 11 月获 FDA 的批准 上市，用于复发性或顽固性低度或滤泡性非霍奇金淋巴瘤的临床治疗[Leget GAiCzuczman MS.Use of rituximab, the new FDA-approved antibody. Curr Opin Oncol. 1998 ；10 548-551]。尽管C2B8抗体在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有52%的病人对C2B8治 疗不产生反应。因此，寻求更为有效用于治疗B淋巴瘤的CD20抗体药物显得尤为迫切。
最新的实验数据表明，对Rituximab耐受的细胞通常变现为⑶20表达减低； Bcl-2 ^iifiiiii^ [Title !Development of Rituximab-Resistant LymphomaClones withAltered Cell Signaling and Cross-Resistance to Chemotherapy. Author Jazirehi, A. R. ；Vega, Μ. I. ；Bonavida, B. Source :Cancer Research，2007，67(3) 1270-1281；Title -Acquirement ofRituximab Resistance in Lymphoma Cell Lines Is Associated with Both Global CD20 Gene andProtein Down-Regulaion Regulaed at the Pretranscriptional and Posttranscriptional Levels. Author :Czuczman， M. S. ；Ole jniczak, S. ；Gowda, A.(…)Source :Clinical Cancer Research，2008，14 (5)1561-1570]。而抗体亲和力的提高能够增强抗体的特异性，提高检测灵敏度，增强抗体的功 能同时降低抗体的用量。因此，通过在临床上广泛使用具有较好治疗效果的Rituximab的 基础上，通过有限的几个突变，显著的提高Rituximab的亲和力，从而提高Rituximab对肿 瘤的杀伤效果。发明内容
本发明的申请人进行了大量的实验，采用基因工程技术构建了多种具有高亲和力 的抗⑶20单克隆抗体突变体。这些突变抗体与Rituximab相比具有更高的亲和力活性，能 够更加有效的识别CD20抗原。高亲和力的抗CD20单克隆抗体突变体可用于制备治疗B细 胞淋巴瘤的药物。与Rituximab相比，突变抗体亲和力提高，抗体特异性增强，对肿瘤的杀 伤效果也显著提高。
本发明公开了
1，一种高亲和力的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID NO 5 所示的C2B8重链可变区和/或如SEQID NO 6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨 基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸 的位置。
2，上述抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷氨酸、 赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。
3，上述1或2所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合⑶20的亲和 力与Rituximab相比提高至少2倍。
4，上述3所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的 氨基酸序列为 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :11， 或SEQ ID N0:14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQID NO :6或SEQ ID NO :12。
5，上述1或2所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合⑶20的亲和 力与Rituximab相比提高至少4倍。
6，上述5所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的 氨基酸序列为SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID N0:14，轻链可变区(VL)的氨基酸序 列为 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7，上述1或2所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合⑶20的亲和 力与Rituximab相比提高至少10倍。
8，上述7所述的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区(VH)的 氨基酸序列为SEQID NO :14，轻链可变区(VL)的氨基酸序列为SEQ ID NO 6或SEQ IDNO 12。
9，一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗⑶20单克隆抗体和可药用的载体。
10，上述1至9任一所述的抗⑶20单克隆抗体或其制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的 药物中的用途。
11，上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
12，上述11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13，上述10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
更具体地，本发明的申请人通过大量实验，首先参照美国专利6，399，061公开的 抗CD20单抗资料及序列，构建了抗CD20嵌合抗体C2B8的轻、重链可变区和恒定区基因，然 后通过表达、纯化，获得嵌合抗体C2B8。根据图1所示的氨基酸突变位点，采用overlapPCR 的方式对嵌合抗体C2B8进行构建，其构建与表达、纯化的方法与未突变的嵌合抗体C2B8相 同。所述突变抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上 的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置，取 代氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
对于本发明，任何合适的真核表达载体都可以使用，这些载体可以为 pcDNA3. 1 (+)，pDRl, pDHFF 之一。
本发明的申请人对上述C2B8突变抗体进行了亲和力检测。实验结果表明，申请 人构建的C2B8抗体的亲和力与市售的Rituxiamb的亲和力相似。相对于未突变的原本 C2B8抗体或市售的Rituxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为重链可变区第57 位谷氨酸或第102位赖氨酸取代的突变抗体(H57DE或H102I)，亲和力提高了至少4倍左 右；重链可变区第102位精氨酸或丝氨酸或苏氨酸取代的突变抗体(H102YR或H102YS或 H102YT)，亲和力提高了 2倍左右；轻链可变区第93位精氨酸取代的突变抗体(L93NR)，其 亲和力也提高了。针对上述重链可变区和/或轻链可变区的突变点进行两点或三点的组合 突变，亲和力均提高了 10倍以上，最终提高亲和力程度最高的组合突变抗体为重链可变 区第57位谷氨酸、第102位赖氨酸，以及轻链可变区第93位精氨酸三个突变点同时取代的 突变抗体(H57DE，H102YK, L93NR)。
以上实验结果说明，高亲和力的C2B8突变抗体，其最佳突变位点为重链可变区第 57、102位，轻链可变区第93位氨基酸的位置；取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝 氨酸或苏氨酸，其中，最佳取代的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸或精氨酸。并且，多个单点组合突 变抗体的亲和力要高于单点突变抗体。
申请人还针对Rituximab突变体(C2B8突变抗体)的功能进行研究。通过对 Rituximab突变体的ADCC功能检测，随着Rituximab突变体亲和力的提高，ADCC功能也显 著增强，三点组合突变Rmi^8的ADCC杀伤活性显著高于Rituximab。通过对Rituximab突 变体凋亡功能检测，结果显示，亲和力的提高不能显著的增加Rituximab突变体的凋亡功 能，但是三突变体RmirtS却显示出了较强的凋亡能力；虽然加入不同浓度的caspase (半胱 氨酸蛋白酶)抑制剂可以部分的抑制RmirtS引起的凋亡，但是其仍然显示出了较强的促凋 亡能力。通过研究高亲和力Rituximab突变体(Rmut8)对Rituximab抵制型细胞的杀伤， 结果显示，Rmi^8不能提高对Rituximab抵制型细胞的⑶C杀伤，但是能够引起较强的ADCC 杀伤；RmirtS在Rituximab抵制型细胞株上仍然表现出较强的促凋亡能力。通过高亲和力 Rituximab突变体体内小鼠生存实验，结果显示，Rmut8不仅仅在正常的Daudi细胞处理组 显示出较强的抗肿瘤效果(P < 0. 001)，而且在Rituximab抵制型细胞株(Daudi-R)上，显 示出良好的治疗效果(P < 0. 01)。
本发明公开上述高亲和力的C2B8突变抗体，可以和药学上可以接受的辅料一起 组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等 制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述C2B8突变抗体的水针或冻干制剂，药 学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)； poloxamer (如poloxamer 188) ；Triton ；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、 亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics ；M0NAQUAT 等，其加入量应使C2B8突变抗体颗粒化 趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠 或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入 量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗 调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含高亲和力的C2B8突变抗体的组合物，在对包括人在内的动物给 药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为预防和/或治 疗肿瘤的药物使用。
本发明中C2B8突变抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因 病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种 种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是0.广3000mg/天。
本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用 于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物烷 化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；钼类化合物如顺钼、卡钼和草酸钼等；丝裂霉素 (MMC) ； (2)影响核酸合成的药物二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂 如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制 剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物选择性作用于DNA模 板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、 表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物紫杉醇、泰索 帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼白硷类、高三尖杉酯碱；( 其他细胞毒药门冬酰胺酶主要抑 制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂 氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂诺雷德、依 那通等；3、生物反应调节剂主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2 ；胸腺 肽类；4、单克隆抗体Cetuximab (C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin) ；5、 其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡 诱导剂。本发明公开的C2B8突变抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合 联合用药。
本发明所指的B细胞淋巴瘤，包括B细胞慢性淋巴细胞白血病，B细胞原淋巴细胞 淋巴瘤，滤泡淋巴瘤，毛细胞白血病，Burkitt淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤等，这里不再一一 列举。
本发明所称的抗肿瘤药物，指具有预防和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿 瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿 瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。
图1. Rituxiamb (又称C2B8抗体)重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。图中第一行序列表示Rituxiamb的重链、轻链的碱基序列，第二行序列表示氨基酸序 列。其中有下划线的地方表示构建突变体的突变点。
图2. biacore检测Rituxiamb及C2B8抗体突变体。不同突变体按照相同浓度，等 倍比稀释在50μ Ι/min流速和25°C环境下进行检测。图中所示为，不同C2B8抗体突变体在 相同浓度下的sensorgram图。WT，表示申请人自行构建的未突变的C2B8抗体。
图3. Rituximab突变体结合饱和曲线。检测125碘标记的不同rituximab突变体 对Daudi细胞的结合饱和曲线。对不同的抗体突变体按照相同浓度等倍比稀释，37°C孵育 2h，通过离心分离，检测结合在细胞上的碘标记的抗体片段。饱和结合实验的数据通过 非线性最小二乘法进行拟合并确定结合常数。
图4. Rituximab突变体ADCC功能检测。图中A-D分别显示的是E T为50 1， 25 1,5 1和1 1四种比率下，ADCC杀伤作用与不同浓度Rituximab突变体的关系。
图5. Rituimab突变体凋亡功能检测。图5A显示不同条件下的Rituximab突变 体的凋亡功能检测结果；图5B-C显示加入不同浓度的caspase抑制剂ZVAD (图5B)和 VDVAD(图5C)后，Rituximab突变体的凋亡功能检测结果。
图6. Rituximab突变体对rituximab抵制型细胞株的杀伤情况。图6A显示Daudi 或者Daudi-R细胞与不同浓度的抗体(Rituximab或者Rmut8)作用，Rituximab抵制型细胞 株的CD20表达下降；图6B显示Raji-R和Daudi-R与10 μ g/mL的抗体和人补体(1 10) 作用的CDC杀伤情况；图6C显示Raji-R和Daudi-R与10 μ g/mL的抗体和PBMC (外周血单 核细胞)(E T = 40 1)作用的ADCC杀伤结果；图6D显示Rituximab或者Rmut8 (10 μ g/ mL)在有二抗交联(20yg/mL的羊抗人KF(ab' )2的片段)或者无交联的情况下的细胞 凋亡情况。
图7.高亲和力Rituximab突变体小鼠生存率实验。每日观察小鼠状况，当出 现后肢瘫痪情况时，处死该小鼠。生存曲线做图参照Kaplan-Meier的方法进行，组间比 较采用 log-rank 检验进行分析[Bland JM, Altman DG. Survival probabilities (the Kaplan-Meier method). BMJ. 1998 ；317 :1572.]。
具体实施方式
以下实施例仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施 例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因 插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook， J.，Fritsch，Ε.F. and Maniais，Τ. (1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 2nedition, Cold spring Harbor Laboratory Press.
实施例1.人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(鼎国生物技术发展公司产品)分离健康人淋巴细胞，用 iTrizol 试剂 Qnvitrogen 公司产品)提取总 RNA，根据文献(Cloned human and mouse kappaimmunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments. HieterPA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cell. 1980Nov ；22(1 Pt 1) 197-207.)禾口文献(The nucleotide sequence of a human immunoglobulin Cgamma1 gene. Ellison Jff,Berson BJ,Hood LE. Nucleic Acids Res. 1982 Jul 10 ； 10 (13) 4071-9.)报道的序列分别设计引物采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到PGEM-T载体(promega公司)中，测序验证后确 认获得了正确的克隆。SEQ ID NO 1和SEQID NO 2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸 序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸序 列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH和pGEM-T/CL。
实施例2.抗⑶20嵌合抗体C2B8的表达载体构建
参照美国专利6，399，061公开的抗⑶20单抗资料及序列，委托上海生工生物工程 有限公司全基因合成抗CD20单克隆抗体C2B8重链可变区基因(C2B8VH)及轻链可变区基 因(C2B8VL)。图1显示了 C2B8重链和轻链可变区的核苷酸序列和氨基酸序列。
以C2B8VH基因和pGEM_T/CH载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体重链基因，反 应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟。并使 此嵌合抗体重链基因的5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，3’端含有翻译 终止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为ATGGGATTCAGCAGGATCTTTCTCTTCC TCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCACTCC。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带 并克隆到PGEMT载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆用HindIII和EcoR I酶 切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体重链片段C2B8VHCH，与用HindIII和EcoR I酶切 的质粒pcDNA3. 1 (+)(美国hvitrogen公司产品)进行连接，构建成嵌合重链真核表达载 体 pcDNA3. 1(+)(C2B8VHCH)。
以C2B8VL基因和pGEM_T/CL载体为模板通过重叠PCR合成嵌合抗体轻链基因，反 应条件为95°C 15分钟；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30个循环；72°C 10分钟，得到 PCR产物C2B8VLCL，其5’端含有限制酶位点HindIII和信号肽基因序列，，3’端含有翻译终 止密码TAA和限制酶位点EcoR I。信号肽基因序列为ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATTTTC AGC TTC CTG CTA ATC AGT GCT TCA GTC ATA ATG TCC AGA GGA。挑选测序正确的克隆 用HindIII和EcoR I酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收嵌合抗体轻链片段C2B8VLCL，与用 HindIII和EcoR I酶切的质粒pcDNA3. 1载体(美国hvitrogen公司产品)进行连接，构 建成嵌合轻链真核表达载体pcDNA3. 1 (C2B8VLCL)。
实施例3.嵌合抗体的稳定表达与纯化
于3. 5cm组织培养皿中接种3 X IO5CHO-Kl细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养 至90% -95%融合时进行转染取质粒1(^8(质粒？00嫩3.1(+) (C2B8VHCH)4y g，质粒 pcDNA3. 1 (C2B8VLCL) 6 μ g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000 Reagent (Invitrogen 公司产品) 分别溶于500 μ 1无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20 分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血 清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4小时后补加2ml含 10%血清的DMEM完全培养基，置于(X)2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600 μ g/ ml G418选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆羊抗 人IgG (Fe)包被于ELISA板，4°C过夜，用2% BSA-PBS于37°C封闭池，加入待测的抗性克隆 培养上清或标准品(Human myeloma IgGl，κ )，37°C温育2h，加入HRP-羊抗人IgG ( κ )进 行结合反应，37°C温育lh，加入TMB (四甲基联苯胺)于37°C作用5min，最后用H2SO4终止8反应，测A45tl值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用ftOtein A亲和柱 (GE公司产品)分离纯化嵌合抗体C2B8。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法 定量确定纯化后抗体的浓度。
实施例4. C2B8抗体突变体的构建及表达
采用overlapPCR的方式进行C2B8抗体突变体的构建，其构建与表达、纯化的方法 与C2B8嵌合抗体相同。构建的抗体突变体共10个，分别为Rmutl至RmutlO，突变抗体的重 链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO 2和SEQID NO 4，重链 可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列分别见SEQ ID NO 5 14。
实施例5. C2B8及突变体的biacore鉴定
将SA芯片(GE公司)在50 μ 1/min的PBS溶液中25 °C平衡30min，然后用IM NaCl 50mMNa0H的活化液活化3次，每次Imin ；将biotin标记的抗原肽(为人⑶20分子 膜外区的部分片段，制备方法请见Title :Structural Basis for Recognition of CD20 by TherapeuticAntibody Rituximab. Author :Du, J. ；Wang, H. ； Zhong, C.(…)Source: J Biol Chem,2007,282(20) :15073-15080)稀释成终浓度为 1μ g/ml,10y 1/min 的流速包被 ARu = 1000 ；然后用PBS缓冲液50 μ 1/min平衡lOmin。将平衡后的芯片用0. 04%的生物 素溶液封闭芯片。将抗体等两倍比稀释五个浓度，50 μ 1/min上样75sec，然后用PBS解离 IOmin0图2显示了在相同样品浓度下biacore检测的sensorgram图；具体检测亲和力数 值见表1。其中，我们构建的C2B8抗体的亲和力与市售的Rituxiamb的亲和力相似。
相对于未突变的原本C2B8抗体，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为=Rmutl 和Rmut5,亲和力分别提高了 6. 08和3. 96倍；Rmut2, 3,4,亲和力提高了近2倍。最终，亲 和力提高最高的为三点组合突变体RmutS，其亲和力最终提高了 15. 47倍。
相对于市售的Rituxiamb，提高亲和力程度较高的单点突变抗体为=Rmutl和 Rmut5,亲和力分别提高了 7. 73和5. 04倍；Rmut2, 3,4,亲和力提高了 2倍多。最终，亲和力 提高最高的为三点组合突变体RmutS，其亲和力最终提高了 19. 68倍。
表1. biacore检测抗体突变体的亲和力
权利要求
1.一种高亲和力的抗⑶20单克隆抗体，其特征在于所述抗体包括如SEQ ID N0:5所 示的C2B8重链可变区和/或如SEQ ID NO :6所示的轻链可变区的下述任何一个或多个氨 基酸位点上的氨基酸取代，所述位点为重链可变区第57、102位，轻链可变区第93位氨基酸 的位置。
2.权利要求1所述抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述一个或多个氨基酸位点上由谷 氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸或苏氨酸取代。
3.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和 力与Rituximab相比提高至少2倍。
4.权利要求3所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基 酸序列为 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO :14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
5.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和 力与Rituximab相比提高至少4倍。
6.权利要求5所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸 序列为SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:11或SEQ ID NO 14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :12。
7.权利要求1或2所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合CD20的亲和 力与Rituximab相比提高至少10倍。
8.权利要求7所述的抗CD20单克隆抗体，其特征在于所述抗体的重链可变区的氨基酸 序列为SEQ ID NO :14，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO 6或SEQ ID NO :12。
9.一种制剂，含有上述1至8任一所述的抗CD20单克隆抗体和可药用的载体。
10.权利要求1至9任一所述的抗CD20单克隆抗体或其制剂在制备抗B细胞淋巴瘤的 药物中的用途。
11.权利要求10的用途，其中B细胞淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。
12.权利要求11的用途，其中非霍奇金淋巴瘤为低度和部分中度非霍奇金淋巴瘤。
13.权利要求10的用途，其中B细胞淋巴瘤为慢性淋巴性白血病。
全文摘要
本发明公开了一种具有高亲和力的抗CD20单克隆抗体和其在制备抗肿瘤药物中的用途。所述抗体包括C2B8重链可变区和/或轻链可变区的下述任何一个或多个氨基酸位点上的氨基酸取代。这些突变抗体与Rituximab相比具有更高的亲和力活性，抗体特异性增强，对肿瘤的杀伤效果也显著提高。
文档编号C07K16/28GK102030826SQ20091005795
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月25日 优先权日2009年9月25日
发明者侯盛, 李博华, 王皓, 赵磊, 郭亚军 申请人:上海抗体药物国家工程研究中心有限公司