专利名称：从马比木中提取喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法
技术领域：
本发明涉及天然药用植物马比木的深加工领域，尤其涉及一种利用微生物发酵与 溶剂提取结合技术从马比木中提取高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法。
背景技术：
传统的喜树碱(Camptothecin)生产是从中国特有的珙桐科植物喜树中提取出来 的。然而喜树碱在喜树中含量低，根皮中含量为万分之四，果实中含量为万分之七，枝叶中 含量极少，9-甲氧基喜树碱在喜树中含量更少，天然提取时其生产成本高、产量低，且植物 资源有限。因此，寻找替代资源以及对其综合利用，是解决喜树碱资源瓶颈的关键。马比木，学名:Nothapadytes foetida (Wight) Sleum 茶莱英科 Icacinaceae，小灌 木。原产地台湾兰屿。在印度有少量分布。现经调查发现，该物种在武陵山区有大面积生 长。在此之前，国外有文献(phytochemry，1972，11)介绍印度产一种铁青树科(即丁 皮木科OLacaceae)马比木属植物Mappa foetida Mlers (译为臭花马比木)中含喜树碱， 其含量比喜树要高，但在中国尚未发现此种植物。意大利因迪纳有限公司的发明人E ·鲍姆 巴德利和L ·威罗塔发明专利“从马比木分离的喜树碱骨架化合物及其作为新药物及治疗 剂的合成子的途径”〔申请号97194492. X〕说明了马比木分离的喜树碱骨架化合物，但未叙 述喜树碱的提取工艺。中国发明专利〔申请号891012184〕，发明人张宪德公开了从假柴龙 树中提取喜树碱的新方法。该方法是以假柴龙树植物为原料，将其粉碎后用常规方法提取 或萃取，再反复精制得到喜树碱；母液经回收处理、分离还获得另一种抗肿瘤药物有效成分 甲氧基喜树碱。但该发明采用的传统的方法，未说明提取得率，也无具体实施方案，而且所 述工艺过程简单，无数据说服力，未获批准。本发明以马比木为原料，利用微生物发酵技术进行高纯度喜树碱和9-甲氧基喜 树碱生产方法的研究。经研究发现，马比木植物中喜树碱的含量只有根皮含量较高，其根皮 中喜树碱的含量是喜树果的2倍以上，枝茎叶中喜树碱的含量并不比喜树果高，而且随季 节的变化其含量变化很大；研究还发现马比木植物中9-甲氧基喜树碱含量很是丰富，很有 工业生产价值。同时还发现，马比木中的部分喜树碱是以苷类形式存在，传统的喜树碱提取 工艺会造成此类物质的丢失，通过微生物发酵技术，可以使苷类转化成喜树碱，使喜树碱的 平均含量达喜树果的3. 6倍以上，从而提高喜树碱的得率，达到了节约植物资源，降低成本 的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用微生物发酵技术从马比木中提取高纯度喜树碱 和9-甲氧基喜树碱的方法。本发明一种从马比木中提取喜树碱的方法，其步骤包括(1)预处理及发酵步骤将马比木材料破碎，按原料酶液比为1 广2(w/w)投入4发酵罐或发酵池，在温度为20 50°C，发酵1 5天，所述的酶为安琪高糖干酵母或发利干 酵母，其在水溶液中的量为广10%。(w/w)；(2)溶剂提取步骤将上述步骤(1)中得到的发酵混合物投入提取罐，使用冷渗 法、温浸法或回流法中的一种方法提取1-12小时，每次溶剂的加入量为初始原料的6 10倍 (w/v)，溶剂提取1 3次，过滤，合并提取液；所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与 水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt% ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含 量占 O-IOOwt % ；(3)浓缩步骤将步骤( 中得到的提取液加入抗氧化剂，浓缩，得浓缩浸膏，所述 的抗氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种或两种，用量为提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步骤将提取物浓缩液用酸调PH值至1 6，然后加入广3倍量有机溶剂 (ν/ν)，萃取，静置，收集有机相，萃余项重复萃取2 3次，合并有机相，浓缩，回收溶剂，得 粗提物浸膏，所述的酸为醋酸、甲酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机 溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分离步骤(a)将粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，搅拌均勻，静置12 M小时，抽 滤，滤饼为含喜树碱的粗品；(b)将上述(a)中喜树碱的粗品加入脂肪醇或脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷 中一种混合物，混合物中脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种溶剂比例为(5-95%， v/v)，搅拌，静置，抽滤，滤饼为含喜树碱的粗品；(c)将上述(b)得到的滤饼使用不同pH的水溶液溶解，过滤，结晶，使用甲醇、丙 酮、乙酸乙酯、氯代甲烷、二甲基甲酰胺中混合溶剂进行重结晶；(d)实施上述(c)操作步骤2-3次，即可得到高于98%的喜树碱产品，干燥，粉碎， 装袋，入库。本发明从马比木中提取喜树碱的方法，提取步骤所述的溶剂为下述溶剂中的一 种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占30-100wt % ；B.乙醇与水的混合物，混合 物中乙醇的含量占30-100Wt% ；本发明从马比木中提取喜树碱的方法，浓缩步骤所述的抗氧化剂为二氧化硫和硫 酸亚铁中的一种，用量为提取液的1 5%。(w/v)；本发明从马比木中提取喜树碱的方法，萃取步骤所用的酸为醋酸、硫酸、盐酸或柠 檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；本发明从马比木中提取喜树碱的方法，分离步骤(e)所述的柱层析填料为大孔树 脂、活性炭、硅藻土、硅胶、氧化铝中的一种，洗脱剂可以为脂肪醇与水的混合物其中脂肪醇 在水中的含量为30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种或几种进 行洗脱。本发明一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其步骤包括(1)预处理及发酵步骤将马比木材料破碎，按原料酶液比为1 广2(w/w)投入 发酵罐或发酵池，在温度为20 50°C，发酵1 5天，所述的酶为安琪高糖干酵母或发利干 酵母，其在水溶液中的量为广10%。(w/w)；(2)溶剂提取步骤将上述步骤(1)中得到的发酵混合物投入提取罐，使用冷渗法、温浸法或回流法中的一种方法提取1-12小时，每次溶剂的加入量为初始原料的6 10倍 (w/v)，溶剂提取1 3次，过滤，合并提取液；所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与 水的混合物，混合物中甲醇的含量占0-100wt% ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含 量占 O-IOOwt % ；(3)浓缩步骤向步骤( 中得到的提取液加入抗氧化剂，浓缩，得浓缩浸膏，所述 的抗氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种或两种，用量为提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步骤将提取物浓缩液用酸调PH值至1 6，然后加入广3倍量有机溶剂 (ν/ν)，萃取，静置，收集有机相，萃余项重复萃取2 3次，合并有机相，浓缩，回收溶剂，得 粗提物浸膏，所述的酸为醋酸、甲酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机 溶剂为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分离步骤(a)将粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，搅拌均勻，静置12 M小时，抽 滤，滤饼为含喜树碱的粗品，滤液回收溶剂后得含9-甲氧基喜树碱粗品；(b)将上述(a)中喜树碱的粗品加入脂肪醇或脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷 中一种混合物，混合物中脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种溶剂比例为(5-95%， v/v)，搅拌，静置，抽滤，滤液回收溶剂得到含9-甲氧基喜树碱粗品；(c)将步骤(a)、(b)得到的含9-甲氧基喜树碱粗品进行柱层析，使用脂肪醇与水 的混合物洗脱，或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种或几种进行洗脱，分段收 集洗脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组分直接浓缩干燥，粉碎，装袋，入库；纯度小于等于 90%的可重复柱层析，纯度在90% -98%直接脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种 或几种进行重结晶，直至9-甲氧基喜树碱纯度大于等于98%，晶体干燥、粉碎，装袋，入库。本发明一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于提取步骤所述 的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占30-100wt%， B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt% ；本发明一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于浓缩步骤所述 的抗氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种，用量为提取液的1 5%。(w/v)；本发明一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于萃取步骤所用 的酸为醋酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯、正丁 醇、二氯甲烷或氯仿；本发明一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于分离步骤(e) 所述的柱层析填料为大孔树脂、活性炭、硅藻土、硅胶、氧化铝中的一种，洗脱剂可以为脂肪 醇与水的混合物其中脂肪醇在水中的含量为30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、 氯代甲烷中的一种或几种进行洗脱。本发明采用微生物发酵预处理技术，使马比木中喜树碱苷和9-甲氧基喜树碱苷 类转化喜树碱和9-甲氧基喜树碱，同时获得两种具有抗癌活性的药物单体，其有效含量都 可高达98%以上，而且产品得率也大大提高，充分利用了有限的植物资源，适合于用马比木 来大规模生产高纯度的喜树碱和9-甲氧基喜树碱产品。具体实施例方式下面的实施案例是对本发明的进一步详细描述，但其不意味着对本发明的任何限制。实施例1 将IKg马比木原料粉碎成粉，均勻喷洒含有发利干酵母的水溶液^ig (酵母量为 20g)，放入IOL发酵罐中，保持温度50°C，时间72h。然后将发酵过的原料投入多功能提取 罐，加入甲醇6L，回流提取Ih后放出提取液；再加甲醇6L，重复提取2次，合并提取液并 加入硫酸亚铁180g ；减压浓缩至浓缩液量为SOOmL时停止浓缩；用稀硫酸调pH值至6，加 SOOmL氯仿进行搅拌，静置30min萃取，收集氯仿层，水层加氯仿重复萃取2次，合并萃取液， 减压回收氯仿得粗提物浸膏，将浸膏投入200mL含量为10%的丙酮水溶液中，搅拌均勻，静 置12h，过滤，沉淀为喜树碱粗品a，滤液回收丙酮后得9-甲氧基喜树碱粗品1(备用)；将 喜树碱粗品a加入到甲醇氯仿混合液IOOmL中(甲醇氯仿=1 3)，搅拌30min，静置， 过滤，沉淀为喜树碱粗品b，滤液回收溶剂后与前述的9-甲氧基喜树碱粗品1合并备用；将 喜树碱粗品b溶解于1. 0 %的NaOH溶液中，过滤，滤液加稀硫酸调pH为4，静置分层，抽滤， 得喜树碱粗品c ；喜树碱粗品c用氯仿结晶，过滤，得喜树碱粗品d，喜树碱粗品d用甲醇、丙 酮、乙酸乙酯(1 2 1)结晶，得喜树碱产品；减压干燥得喜树碱产品0.83g，HPLC检测含 量为98. 5%。将上述步骤得到的9-甲氧基喜树碱粗品1进行柱层析，柱填料为氧化铝，使用甲 醇二氯甲烷(1 lv/v)进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组 分直接浓缩干燥，纯度小于等于90%的可重复柱层析，纯度在90% -98%直接用甲醇氯 仿=1 3的混合液进行重结晶，最后得9-甲氧基喜树碱0J65g，HPLC检测含量为98%。实施例2 将500g马比木原料粉均勻喷洒含有安琪高糖干酵母的水溶液700g(酵母量为 5g)，放入5L烧瓶中，密封，置于恒温摇床上(40°C )震摇Mh，加入75%乙醇5L继续震摇， 1 后放出提取液；再加75%乙醇4L，重复提取2次，合并提取液并加入硫酸亚铁30g ；减压 浓缩至浓缩液量为200mL时停止浓缩；用盐酸调pH值至1，加200mL水饱和的正丁醇进行 搅拌，静置30min萃取，收集正丁醇层，水层加正丁醇重复萃取2次，合并萃取液，减压回收 正丁醇得粗提物浸膏，将浸膏投入150mL含量为90%的丙酮水溶液中，搅拌均勻，静置12h， 过滤，沉淀为喜树碱粗品a，滤液回收丙酮后得9-甲氧基喜树碱粗品1 (备用)；将喜树碱粗 品a加入到甲醇丙酮混合液IOOmL中(甲醇丙酮=5 95)，搅拌30min，静置，过滤，滤 饼为喜树碱粗品b，滤液回收溶剂后与前述的9-甲氧基喜树碱粗品1合并备用；将喜树碱 粗品b溶于50%乙醇中，滴加1 % NaOH溶液调pH为11，静置，过滤，滤液加盐酸调pH为3， 静置，抽滤，得喜树碱粗品c ；喜树碱粗品c使用IOOmL 二氯甲烷中结晶，过滤，得喜树碱粗 品d，喜树碱粗品d用甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺(3 2 6)重结晶，得喜树碱产品；减压 干燥得喜树碱产品0. 395g，HPLC检测含量为98. 0%。将上述步骤得到的9-甲氧基喜树碱粗品1进行柱层析，柱填料为硅胶，使用丙 酮二氯甲烷(1 2v/v)进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组 分直接浓缩干燥，纯度小于等于90%的可重复柱层析，纯度在90% -98%直接用丙酮二 氯甲烷(3 7v/v)的混合液进行重结晶，最后得9-甲氧基喜树碱0. 118g，HPLC检测含量 为 99. 0%。7
实施例3 将1. OKg马比木原料粉均勻喷洒含有安琪高糖干酵母的水溶液2000g(酵母量为 15g)，放入保鲜袋中密封，20°C放置5天，然后装入渗漉器，加入50 %乙醇IOL进行渗漉提 取，提取12h，流速为13mL/min，渗漉液加入二氧化硫30g ；减压浓缩至浓缩液量为400mL时 停止浓缩；用醋酸调PH值至4，加400mL 二氯甲烷进行搅拌，静置30min萃取，收集二氯甲 烷层，水层加二氯甲烷重复萃取2次，合并萃取液，减压回收二氯甲烷得粗提物浸膏，将浸 膏投入250mL丙酮中，搅拌均勻，静置12h，过滤，滤饼为喜树碱粗品a，滤液回收溶剂后得 9-甲氧基喜树碱粗品1(备用)；将喜树碱粗品a加入到乙酸乙酯氯仿混合液200mL中(乙 醇乙酸乙酯=95 5)，搅拌30min，静置，过滤，滤饼为喜树碱粗品b，滤液回收溶剂后与 前述的9-甲氧基喜树碱粗品1合并备用；将喜树碱粗品b溶于90%甲醇中，滴加NaOH 溶液调PH为10，过滤，滤液加盐酸调pH为2，静置，过滤，得喜树碱粗品c ；喜树碱粗品c使 用IOOmL乙酸乙酯结晶得喜树碱粗品d，喜树碱粗品d使用丙酮重结晶，得喜树碱产品；减 压干燥得喜树碱产品0. 735g，HPLC检测含量为98. 3%。将上述步骤得到的9-甲氧基喜树碱粗品1进行柱层析，柱填料为大孔树脂，使用 乙醇水进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组分直接浓缩干燥，纯 度小于等于90%的可重复柱层析，纯度在90%-98%直接用乙酸乙酯氯仿=2 8的混 合液进行重结晶，最后得9-甲氧基喜树碱0. 282g，HPLC检测含量为98. 2%。实施例4 将600Kg马比木原料粉碎，均勻喷洒含有Ikg安琪高糖干酵母的水溶液lOOOKg， 放入密封完好的发酵池中，保持温度30°C，时间48h。然后将发酵过的原料投入多功能提取 罐，加入含量为80%的甲醇5T，在50°C时提取(并搅拌)4h后放出提取液；再加入含量为 80%的甲醇4T，在50°C时提取(并搅拌)4小时后放出提取液；再重复1次，合并提取液；将 提取液泵入三效浓缩器，加入6. 5kg 二氧化硫进行减压浓缩，当浓缩液总量为800 1000L 时转入到单效浓缩器继续浓缩至浓缩液量为200L左右时停止浓缩；将上述浓缩液投入到 1000L萃取罐中，用盐酸调pH值为2 3，加500L氯仿进行搅拌，静置30min萃取，收集氯 仿项，萃余项加氯仿重复萃取2次，合并萃取液，减压回收氯仿得粗提物浸膏。向上述粗提 物浸膏加入35L含量为80 %的丙酮水溶液，搅拌均勻，静置Mh，过滤，滤饼为喜树碱粗品a， 滤液回收丙酮后得9-甲氧基喜树碱粗品1 (备用)；向上述喜树碱粗品a加入甲醇氯仿 (4 lv/v)混合液55L，搅拌均勻，静置，抽滤，滤饼为喜树碱粗品b，滤液回收溶剂后与前述 的9-甲氧基喜树碱粗品1合并备用；将喜树碱粗品b溶解于1. 5%的NaOH溶液中，过滤，滤 液加酸调PH为4，静置分层，抽滤，得喜树碱粗品c ；喜树碱粗品c使用200L氯仿结晶得喜 树碱粗品d，喜树碱粗品d丙酮、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺进行2次结晶，得喜树碱产品412g HPLC检测含量为98. 2%。将上述步骤得到的9-甲氧基喜树碱粗品1进行柱层析，柱填料为大孔树脂，使用 甲醇、水、丙酮(1 2 1)进行梯度洗脱，分段收集洗脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组 分直接浓缩干燥，粉碎，装袋，入库；纯度小于等于90%的可重复柱层析，纯度在90% -98% 直接用甲醇氯仿(1 3v/v)的混合液进行重结晶，直至9-甲氧基喜树碱纯度大于等于 98%，最后得纯度大于等于98%的9-甲氧基喜树碱132克晶体干燥、粉碎，装袋，入库。上述所得的喜树碱、9-甲氧基喜树碱，同时得到纯度大于98% (高压液相色谱仪8检测)的两种产品，产率收率高，成本低，充分利用资源，很适合于大规模工业化生产。
权利要求
1.一种从马比木中提取喜树碱的方法，其步骤包括(1)预处理及发酵步骤将马比木材料破碎，按原料酶液比为1广2(w/w)投入发酵 罐或发酵池，在温度为20 50°C，发酵1 5天，所述的酶为安琪高糖干酵母或发利干酵 母，其在水溶液中的量为广10%。(w/w)；(2)溶剂提取步骤将上述步骤(1)中得到的发酵混合物投入提取罐，使用冷渗法、温 浸法或回流法中的一种方法提取1-12小时，每次溶剂的加入量为初始原料的6 10倍(w/ ν)，溶剂提取1 3次，过滤，合并提取液；所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的 混合物，混合物中甲醇的含量占O-IOOwt % ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占 O-IOOwt % ；(3)浓缩步骤将步骤( 中得到的提取液加入抗氧化剂，浓缩，得浓缩浸膏，所述的抗 氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种或两种，用量为提取液的0. 5 10%。(w/v)(4)萃取步骤将提取物浓缩液用酸调pH值至1 6，然后加入广3倍量有机溶剂(ν/ ν)，萃取，静置，收集有机相，萃余项重复萃取2 3次，合并有机相，浓缩，回收溶剂，得粗提 物浸膏，所述的酸为醋酸、甲酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂 为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分离步骤(a)将粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，搅拌均勻，静置12 M小时，抽滤，滤 饼为含喜树碱的粗品；(b)将上述(a)中喜树碱的粗品加入脂肪醇或脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中 一种混合物，混合物中脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种溶剂比例为(5-95%，ν/ ν)，搅拌，静置，抽滤，滤饼为含喜树碱的粗品；(c)将上述(b)得到的滤饼使用不同pH的水溶液溶解，过滤，结晶，使用甲醇、丙酮、乙 酸乙酯、氯代甲烷、二甲基甲酰胺中混合溶剂进行重结晶；(d)实施上述(c)操作步骤2-3次，即可得到高于98%的喜树碱产品，干燥，粉碎，装 袋，入库。
2.根据权利要求1所述的一种从马比木中提取喜树碱的方法，其特征在于提取 步骤所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占 30-100wt% ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt%。
3.根据权利要求1所述的一种利用微生物发酵与溶剂提取结合技术从马比木中提取 分离高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于浓缩步骤所述的抗氧化剂为二 氧化硫和硫酸亚铁中的一种，用量为提取液的1 5%。(w/v)。
4.根据权利要求1所述的一种从马比木中提取喜树碱的方法，其特征在于萃取步骤 所用的酸为醋酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂为乙酸乙酯、 正丁醇、二氯甲烷或氯仿。
5.根据权利要求1所述的一种从马比木中提取喜树碱的方法，其特征在于分离步骤 (e)所述的柱层析填料为大孔树脂、活性炭、硅藻土、硅胶、氧化铝中的一种，洗脱剂可以为 脂肪醇与水的混合物其中脂肪醇在水中的含量为30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙 酯、氯代甲烷中的一种或几种进行洗脱。
6.一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其步骤包括(1)预处理及发酵步骤将马比木材料破碎，按原料酶液比为1广2(w/w)投入发酵 罐或发酵池，在温度为20 50°C，发酵1 5天，所述的酶为安琪高糖干酵母或发利干酵 母，其在水溶液中的量为广10%。(w/w)；(2)溶剂提取步骤将上述步骤(1)中得到的发酵混合物投入提取罐，使用冷渗法、温 浸法或回流法中的一种方法提取1-12小时，每次溶剂的加入量为初始原料的6 10倍(w/ ν)，溶剂提取1 3次，过滤，合并提取液；所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的 混合物，混合物中甲醇的含量占O-IOOwt % ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占 O-IOOwt % ；(3)浓缩步骤向步骤( 中得到的提取液加入抗氧化剂，浓缩，得浓缩浸膏，所述的抗 氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种或两种，用量为提取液的0. 5 10%。(w/v)；(4)萃取步骤将提取物浓缩液用酸调pH值至1 6，然后加入广3倍量有机溶剂(ν/ ν)，萃取，静置，收集有机相，萃余项重复萃取2 3次，合并有机相，浓缩，回收溶剂，得粗提 物浸膏，所述的酸为醋酸、甲酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂 为乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿；(5)分离步骤(a)将粗提物浸膏中加入10-100%丙酮水溶液，搅拌均勻，静置12 M小时，抽滤，滤 饼为含喜树碱的粗品，滤液回收溶剂后得含9-甲氧基喜树碱粗品；(b)将上述(a)中喜树碱的粗品加入脂肪醇或脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中一 种混合物，混合物中脂肪醇与丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种溶剂比例为(5-95%，ν/ ν)，搅拌，静置，抽滤，滤液回收溶剂得到含9-甲氧基喜树碱粗品；(c)将步骤(a)、(b)得到的含9-甲氧基喜树碱粗品进行柱层析，使用脂肪醇与水的混 合物洗脱，或使用脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种或几种进行洗脱，分段收集洗 脱液，HPLC检测，纯度大于98%的组分直接浓缩干燥，粉碎，装袋，入库；纯度小于等于90% 的可重复柱层析，纯度在90% -98%直接脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种或几 种进行重结晶，直至9-甲氧基喜树碱纯度大于等于98%，晶体干燥、粉碎，装袋，入库。
7.根据权利要求6所述的一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于 提取步骤所述的溶剂为下述溶剂中的一种A.甲醇与水的混合物，混合物中甲醇的含量占 30-100wt% ；B.乙醇与水的混合物，混合物中乙醇的含量占30-100Wt%。
8.根据权利要求6所述的一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于 浓缩步骤所述的抗氧化剂为二氧化硫和硫酸亚铁中的一种，用量为提取液的1 5%。(w/ν) 。
9.根据权利要求6所述的一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于 萃取步骤所用的酸为醋酸、硫酸、盐酸或柠檬酸中的一种或几种；萃取所用的有机溶剂为乙 酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷或氯仿。
10.根据权利要求6所述的一种从马比木中提取9-甲氧基喜树碱的方法，其特征在于 分离步骤(e)所述的柱层析填料为大孔树脂、活性炭、硅藻土、硅胶、氧化铝中的一种，洗脱 剂可以为脂肪醇与水的混合物其中脂肪醇在水中的含量为30-100wt% ；或使用脂肪醇、丙 酮、乙酸乙酯、氯代甲烷中的一种或几种进行洗脱。
全文摘要
本发明涉及天然药用植物马比木的深加工领域，尤其涉及一种利用微生物发酵与溶剂提取结合技术从马比木中提取高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱的方法。本发明利用溶剂提取及微生物分解法提取马比木中天然的喜树碱和9-甲氧基喜树碱，再利用提取萃取、柱层析、结晶等分离技术获得高纯度喜树碱和9-甲氧基喜树碱。本发明充分利用马比木资源，分离步骤简捷，产品纯度高，收率高，同步提取两种产品，大大降低生产成本，适合于工业化生产。
文档编号C07D491/22GK102051393SQ20091027268
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者余龙江, 廖娜, 彭炜, 敖明章, 王晶, 甘国伟, 石永进 申请人:华中科技大学, 恩施市锦华生物工程有限责任公司