专利名称：一种快速获取特异性人源抗体可变区基因序列的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速获取特异性人源抗体可变区基因序列的方法及其制备全人源抗体的方法。
背景技术：
随着经济的发展和医疗水平的提高，感染性和传染性疾病的总体患病率有所下降，但是某些感染性或传染性疾病仍然是威胁人类健康的重要因素。从2002年的SARS大规模爆发，到2008年EV71病毒引发的手足口病，再到2009年墨西哥甲型Hmi流感病毒引发的全球流感大流行，由于短时间内找不到行之有效的防控办法，一旦爆发它们就很快在大范围内或全球蔓延。所以对于这类病毒引发的爆发性、流行性疾病，非常迫切需要在很短时间内找到有效的预防和治疗方法。但常规的抗病毒药物开发是一个漫长的过程，无法在短时间内满足需要；而常规的疫苗研制，需要先清楚分离抗原，然后检测、筛选到最终形成疫苗产品，这过程至少需要半年的时间。单克隆抗体是针对特异抗原产生的特异纯化抗体，它具体有高度专一性，能精确地瞄准、捕获目标靶点，特异性地与靶目标发生反应。单克隆抗体已成为世界生物工程制药业的支柱产品之一。单克隆抗体药物发展经历了四个阶段，分别为鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源化单克隆抗体，而在全球的单克隆抗体市场， 第四个阶段的全人源化单克隆抗体是其未来的发展方向。鼠源单克隆抗体是用小鼠制备的普通单克隆抗体药物，但其有明显的局限性鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低， 与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱，在人血循环中的半衰期短， 鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应，常引起人体的不良反应，从而大大制约了其在临床实验及相关应用领域的发展。所谓人源化抗体就是将抗原吸附区或可变区部分(即Vh和Vl区)嫁接到人抗体上，以降低抗体上的外源成分，来减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体和全人源化抗体等几类。如嵌合抗体人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了 30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA。全人源化抗体与人体结合性最好，也是最安全和有效的单克隆抗体。全人源化抗体指抗体所有部分，包括指抗体的可变区部分(即Vh和Vl区)和恒定区(即Ch和Cl区) 由人类抗体基因所编码。全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术， 将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的动物或细胞中，使动物或细胞表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。全人源化抗体的研究始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。噬菌体抗体库技术从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因III (g:3)或基因VIII(g8)的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp III或gp VIII的N端。用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。核糖体展示技术将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3'末端终止密码子，核糖体翻译到 mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA的3'末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如固定在ELISA微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。基因工程小鼠制备全人抗体制备全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠(hu-PBL-SCID小鼠)、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人源抗体。转基因小鼠将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单抗技术。不足之处(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；C3)转基因小鼠表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。转染色体小鼠通过微细胞介导法(MMCT方法)将人14号染色体上产生IgH的胚系片段和2号染色体上5 50Mb的κ轻链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后，可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但是，转染色体小鼠导入的人Ig片断虽然比较大，但其表达的人Ig量却比较低。转染色体牛产生人Ig转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步发育成转染色体牛。产生人Ig转染色体牛的构建特点在于(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系，因此将人人工染色体导入牛胚胎成纤维细胞；(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC的微细胞与牛胚胎成纤维细胞融合后， 牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d,因此必须经过2次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。但上述全人源化抗体技术中，制备和生产流程复杂，需要时间和周期漫长，无法适用于某些突发、流行性疾病的抗体药物的研发和生产，且对某些病原体或抗原快速变异方面显得无能为力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有全人源化抗体技术所存在的问题，提供了一种简单、快捷、高特异性的全人源抗体可变区基因序列获取方法及其制备全人源抗体的方法。为此，本发明公开了一种快速获取特异性人源抗体可变区基因序列的方法，其包括下列步骤a)从供体外周血或细胞系中分离CD19阳性的淋巴细胞；b)⑶19阳性的淋巴细胞体外诱导分化；c)检测特异性抗体和筛选特异性抗体阳性的淋巴细胞；d)设计兼并引物群；e)采用单细胞RT-PCR的方法来扩增可变区基因并测序；其中所述CD19阳性的淋巴细胞体外诱导分化步骤为将CD19阳性的淋巴细胞体以单个细胞形式在存在CD40L蛋白情况、细胞因子的培养液中培养。在一些实施例中，所述步骤a中分离CD19阳性的淋巴细胞的方法为磁珠分选法或流式细胞分析仪分选法；其中优选磁珠分选法。在一些实施例中，所述步骤b中所述存在⑶40L蛋白情况为培养液中含有⑶40L 蛋白、CD40L蛋白交联的介质、表达CD40L蛋白的滋养层细胞中之一情况，其中优选表达 ⑶40L蛋白的滋养层细胞，最优选表达⑶40L蛋白的CHO-Kl滋养细胞。所述表达⑶40L蛋白的CHO-Kl滋养细胞通过下列步骤制备a)通过RT-PCR的方法扩增CD40L基因；b)再将该基因克隆到真核表达载体中；c)转染CHO-Kl细胞株，筛选以获得稳定表达⑶40L细胞株；d)辐射处理或丝裂霉素处理终止CHO-Kl细胞的增殖能力，即得表达⑶40L蛋白的 CHO-Kl滋养细胞。所述滋养细胞是指能分泌或表达蛋白或因子供目的细胞生长或分化，但自身丧失增殖能力但仍保留活性的细胞。在一些实施例中，所述步骤b中所述细胞因子为IL-2和/或IL-21，其中优选100 单位 /mL 的 IL-2 和 100ng/mL IL-21 在一些实施例中，所述步骤c中所述检测特异性抗体的方法可为放射免疫法、 ELISA方法或蛋白芯片法中之一。在一实施例中，所述特异性抗体为破伤风抗毒素抗体。在一些实施例中，所述步骤d中所述兼并引物群为重链可变区和轻链可变区的引物群，其中下游引物紧靠与可变区接壤的恒定区，上游引物则根据已有的其它可变区序列、 考虑到可变区序列多变的特点设计兼并引物群，并紧靠可变区的5 ‘-UTR区或起始密码子。在一实施例中，所述重链可变区的引物群为如SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 6所示， 所述轻链可变区的引物群为如SEQ ID NO. 7 SEQ ID N0. 22所示。在一些实施例中，所述步骤e中所述单细胞RT-PCR步骤为先将单细胞进行裂解， 再以此裂解液作为模板进行一步法RT-PCR，在不同的PCR管中分别扩增重链和轻链的可变区。在一实施例中，所述特异性人源抗体可变区基因序列为破伤风抗毒素特异性人源抗体可变区基因序列。
另一方面，本发明还公开了一种破伤风抗毒素特异性人源抗体重链可变区基因序列如为如SEQ ID NO. 23所示；另一方面，本发明还公开了一种破伤风抗毒素特异性人源抗体轻链可变区基因序列如为如SEQ ID NO. 24所示。另一方面，本发明还公开了一种制备全人源抗体的方法，包括下列步骤a)将上述所述特异性人源抗体可变区基因序列克隆到人恒定区表达载体中；b)转染和筛选转化体；c)表达和纯化全人源抗体。本发明所涉及的过程简单、快速、有效，从分离CD19阳性淋巴细胞到获取特异性抗体的可变区基因序列，整个过程不超过14天。本发明提供了一个良好的技术平台，可广泛用于获取多种传染性/感染性、肿瘤性疾病、自身免疫性疾病中特异性的全人源化抗体的核心成分(重链和轻链的可变区)，特别是某些突发、重大流行性疾病，如SARS、禽流感等疾病，并且本发明为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。
图1为一具体实施例的单细胞RT-PCR扩增参数图。图2为一具体实施例的单细胞RT-PCR电泳图。
具体实施例方式如无其他说明，在进一步详细说明本发明之前，本发明中使用的术语定义如下“抗体”是指B细胞特异性识别抗原后，增殖分化成为浆细胞，所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。“人源抗体”是指将异源抗体中的抗原吸附区或可变区部分(即Vh和Vl区)嫁接到人抗体上，以降低抗体上的外源成分，来减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。“全人源抗体”是指抗体所有部分，包括指抗体的可变区部分(即Vh和Vl区)和恒定区(即ch和cl区)由人类抗体基因所编码。“抗体可变区”是指在免疫球蛋白多肽链氨基端(N端)，轻链的1/2与重链的1/4 区域内，氨基酸的种类、排列顺序与构型变化很大，故称为可变区。“CDR” 是指抗原互补决定区(complementary-determining region)，轻链可变区 (VH)和重链可变区(VL)的三个高变区共同组成免疫球蛋白的抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定基互补的表面，故高变区又称为互补决定区。“人类供体”是指从有过接触特定抗原的人，这类人类供体外周血中能被检测到特异性抗体。“磁珠分选”是指利用细胞表面特异性的标记，能与特异性的配体(抗体)相结合， 而该配体(抗体)是与磁珠相藕连的，在利用外加磁场的作用下，那些具有细胞特异性标记的细胞被吸附在磁场上，没有相应标记的细胞则被洗脱下来，从而达到将目的细胞和非目的细胞相分离的目的。“体外诱导分化”是指在体外培养的条件下添加各种细胞因子，促使前B淋巴细胞分化成熟并分泌抗体。
“共培养”是指在体外将不同类型的细胞置于同一培养体系中进行培养。“ELISA” 是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay)的简称，它是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。"RT-PCR"是指逆转录 PCR，或者称反转录 PCR(reversetranscription_PCR， RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作 “逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。“单细胞RT-PCR”是指以单个细胞的裂解物为模板的逆转录PCR。“电泳”是指在外加直流电源的作用下，DNA在琼脂糖凝胶介质里向阳极作定向移动以达到不同大小DNA相分离的目的。蛋白的表达本发明包括编码本发明蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如 F. Ausubel et al. , Current Protocolsin Molecular Biology. Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端 DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λ PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA 或 UAG)。如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathiones-transferase, GST)、 六聚组氨酸肽(His. Tag)、蛋白质A (protein Α)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His. Tag与 Ni-ChelatingS印harose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和)(a因子等，以获得目标蛋白。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解) 蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology(1986)。编码本发明的所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。 如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、 疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。 在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Qsepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、PhenylSepharose FF 柱、DEAE Sepharose FF> Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。另外，可使用国际公开号W000/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的蛋白。以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。在下面的实施例中，下述的缩略语表示如下的意义，未加定义的缩略语使用其通常可接受的定义°C=摄氏度min =分钟hr=小时M=摩尔mM=豪摩尔mL =毫升ng =纳克μ L =微升PBS =磷酸缓冲液FBS=胎牛血清PBMC =外周血单核细胞IL-2 =人类重组白介素2IL-21 =人类重组白介素21IMDM= Iscove' s Modified Dulbecco' s Medium 培养基HRP =辣根过氧化物酶BSA=牛血清白蛋白TMB = 3 ‘，4 ‘，5，-三甲氧基苯甲醛dNTP =三磷酸脱氧核糖核苷材料与方法培养基
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在本申请中使用的培养基，如果没有其他说明，一般采用10%胎牛血清(GIBC0， cat#89-4901DJ)、200mM 的谷氨酰胺(GIBCO，cat#25030_081)、IOmM 非必须氨基酸(GIBC0， cat#l 1140-050) UOOmM 的丙酮酸钠(GIBCO，cat#l 1360-070)、55mM 的 beta 巯基乙醇 (GIBCO, cat#21985-023)、lX 的青霉素和链霉素(GIBCO, cat#15750-053)的 IMDM(GIBCO， cat#12440-046)培养基。人外周血单核细胞来自美国Memcell Technologies he公司(cat#PB005F)。在该淋巴细胞株供体的外周血中被检测到破伤风抗毒素抗体。⑶19+淋巴细胞的磁珠分选PBMC 先与藕连抗人 CD19 抗体的磁珠(Stemcell Technologies Inc, cat#18054) 孵育，再用磁铁分离柱(Stemcell Technologies Inc, cat#18000)进行分离。简单地说，淋巴细胞被磁珠标记，标记之后细胞通过一个置于永久强磁场的分离柱中。在这高强度的磁场中，被标记的与磁珠结合的阳性细胞被吸附和保留在管壁上，未与磁珠抗体相结合的阴性细胞则在溶液中，当倾倒出管内溶液时，阴性细胞被分离出去。从而达到分离的目的。稳定表达⑶40L的CH0-K1细胞株制备通过RT-PCR的方法扩增⑶40L基因的全长(从起始密码子到终止密码子)，再将该基因克隆到真核表达载体pcDNA 3. 1的质粒中，在测序验证后将该重组质粒转染CH0-K1 细胞株，用G418药物筛选以获得稳定表达⑶40L细胞株。在将稳定表达⑶40L的CH0-K1 细胞株作为滋养层与淋巴细胞共培养前，需终止CH0-K1细胞的增殖能力。本发明提供了相应的方法，即采用Gamma射线照射的方法。照射检测细胞的生长曲线以明确其丧失了增殖的能力。照射后的细胞可直接用作滋养层与淋巴细胞共培养，或冻存与液氮中将来备用。结果本发明成功地扩增到人类⑶40L基因全长，并成功克隆到真核表达载体 pcDNA3. 1的质粒中，在转染CH0-K1细胞及G418药物筛选4个星期后成功获得稳定表达 CD40L的细胞株。在采用Gamma射线照射的方法，即利用3000Rad的照射剂量照射后，CH0-K1 细胞即丧失增殖能力，但仍保留活性。⑶19+淋巴细胞的体外培养和分化诱导将Gamma射线后冻存的稳定表达⑶40L的CH0-K1细胞株复苏后接种到384 孔板。再将分离到的⑶19阳性细胞首先稀释至5X103个细胞/mL，再进一步稀释至 500个细胞/mL，取2000个细胞稀释到25个细胞/mL，并添加适量的IL_2 (Roche公司， Cat#11011456001)和 IL-21 (PR0SPEC Tany iTechnoGeneLtd 公司，Cat#CYT_408)，在将稀释的细胞接种到已经接种好Gamma射线照射后的CH0-K1细胞的5个384孔培养板(每个培养孔接种3万个CH0-K1细胞)，最终在每个培养板的每个培养孔中接种1个淋巴细胞。每个培养孔的最终培养体系为60 μ L，将培养板置于37°C，5% C02的培养箱中培养10天后 ELISA检测。ELISA 检测从上述5个384培养板中取样，每个培养孔中转移40 μ L培养液至新的384孔板中用于ELISA检测，并在原有的培养孔中加入10 μ L 20%的灭菌甘油，立即将含有细胞的 384孔板冻存于_80°C的冰箱中。将用包被液(1. 59g/L的碳酸钠、2. 93g/L的碳酸氢钠、 0.02%的叠氮钠溶液)稀释破伤风抗毒素(Astarte Biologies LLC公司，美国，Cat#1002)至 0. 1 μ g/ μ L，添加至 96 孔板(Sigma Aldrich，美国，Cat#CLS3590)，25 μ L/ 孔，4°C过夜。 第二天用洗涤液(含0. 02%吐温20的PBS溶液)洗涤两次。加100 μ L封闭液(含有3% BSA的PBS溶液)室温封闭Ihr ；将来自384孔板的培养上清添加到96孔板中，每孔20 μ L。 37°C孵育Ihr，洗涤液洗涤2次；用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)藕连的兔抗人IgG抗体(abeam公司，cat#ab6759) (1 10000)，37°C孵育Ihr，洗涤液洗涤2次；每孔添加50 μ L TMB 底物(Sigma Aldrich，美国，Cat#T0440)，室温反应 30min，每孔添加 50 μ L IMHCL 终止反应；酶标仪上检测Α450。兼并引物群按下表分别合成重链和轻链的引物群。
权利要求
1.一种快速获取特异性人源抗体可变区基因序列的方法，其包括下列步骤a)从供体外周血或细胞系中分离CD19阳性的淋巴细胞；b)CD19阳性的淋巴细胞体外诱导分化；c)检测特异性抗体和筛选特异性抗体阳性的淋巴细胞；d)设计兼并引物群；e)采用单细胞RT-PCR的方法来扩增可变区基因并测序；其中所述CD19阳性的淋巴细胞体外诱导分化步骤为将CD19阳性的淋巴细胞体以单个细胞形式在存在CD40L蛋白情况、细胞因子的培养液中培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤a中分离CD19阳性的淋巴细胞的方法为磁珠分选法或流式细胞分析仪分选法。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤b中所述存在CD40L蛋白情况为培养液中含有CD40L蛋白、CD40L蛋白交联的介质、表达CD40L蛋白的滋养层细胞中之一情况。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤b中所述细胞因子为IL-2和/或 IL-21。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述细胞因子为100单位/mL的IL-2和 100ng/mL IL-21
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤c中所述检测特异性抗体的方法可为放射免疫法、ELISA方法或蛋白芯片法中之一。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤d中所述兼并引物群为重链可变区和轻链可变区的引物群，其中下游引物紧靠与可变区接壤的恒定区，上游引物则根据已有的其它可变区序列、考虑到可变区序列多变的特点设计兼并引物群，并紧靠可变区的 5 ‘-UTR区或起始密码子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述重链可变区的引物群为如SEQID NO. 1 SEQ ID NO. 6所示，所述轻链可变区的引物群为如SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 23所不。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤e中所述单细胞RT-PCR步骤为先将单细胞进行裂解，再以此裂解液作为模板进行一步法RT-PCR，在不同的PCR管中分别扩增重链和轻链的可变区。
10.一种制备全人源抗体的方法，包括下列步骤a)将权利要求1所述方法获得的特异性人源抗体可变区基因序列克隆到人恒定区表达载体中；b)转染和筛选转化体；c)表达和纯化全人源抗体。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种快速获取特异性人源抗体可变区基因序列的方法及其制备全人源抗体的方法。本发明所涉及的过程简单、快速、有效，从分离CD19阳性淋巴细胞到获取特异性抗体的可变区基因序列，整个过程不超过14天。本发明提供了一个良好的技术平台，可广泛用于获取多种传染性/感染性、肿瘤性疾病、自身免疫性疾病中特异性的全人源化抗体的核心成分重链和轻链的可变区，特别是某些突发、重大流行性疾病，如SARS、禽流感等疾病，并且本发明为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。
文档编号C07K16/12GK102234641SQ20101016280
公开日2011年11月9日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者孙毅, 徐俊, 曾桥, 胡西陵, 薛志刚 申请人:杭州星博生物科技有限公司