专利名称：重组4A β 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法。通过构建毕赤氏酵母重组工程菌株，使酵母高效分泌表达重组四价 A β 15，经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85%的重组四价A β 15。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种以进行性的记忆丧失、意识障碍 及人格变化为临床特征的中枢神经系统退行性疾病，也是最常见的一种老年痴呆。目前有 证据表明，β-淀粉样蛋白(i3-amyloid，Ai3)沉积是AD病理的中心环节。因此，以Αβ为 靶的免疫治疗方法成为AD研究的热点。已有的研究表明A β 42全肽疫苗临床试验在防治 AD方面切实有效，但出现一些副反应而被终止。通过去除可能引起副反应的A β 42C末端序 列，并将ΑβΝ末端B细胞表位串联形成多价Αβ疫苗，可达到有效且安全的免疫目的。四 价Αβ 15是4个Αβ42Ν端1_15氨基酸的串联体，目前国内生产的重组四价Aβ 15，主要是 大肠杆菌表达产物，其工艺缺陷是4Αβ 15基因在大肠杆菌表达系统中为胞内表达，表达 量低，且主要以包涵体形式存在。在生产的过程中，包涵体形式的蛋白质需要变性和复性， 纯化困难，增加成本。而且为了便于纯化，人们往往在4Αβ 15基因的下游带有一个组氨酸 标签序列，使得四价4Αβ 15在作为疫苗免疫人体的过程中可能产生一些非特异的抗体，从 而产生一些副作用。毕赤酵母(Picha pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不 高，适合于高密度发酵的大规模生产，尤其是以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体 系，表达外源蛋白时无需添加甲醇为碳源，可避免环境污染(甲醇是易挥发的有毒物质)和 减少下游产物纯化的步骤。此外Picha. patoris可将表达产物分泌于细胞外，而且自身蛋 白的分泌却很少，非常有利于下游的纯化。目前国内外未见采用以GAP为启动子的毕赤氏 酵母表达体系表达重组四价A β 15的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方 法，是选用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价A β 15的表达，并且 通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码 子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4Αβ 15的天然氨端和羧端。本发明所采用的技术原理是将4Αβ 15基因插入含有α -factor信号肽的组成型 酵母表达载体PGAPZ α A中，线性化后电击导入毕赤氏酵母菌株GSl 15 (购自Invitrogen公 司)，经摇瓶发酵获得工程菌株该工程菌株于2010年1月29日保藏于“中国典型培养物保 藏中心”，地址湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学，保藏登记号为CCTCCN0 :M2010034, 命名为6115Ζ20004Αβ 15，分类命名为毕赤氏酵母(Pichapastoris)，实现重组四价A β 15 在发酵上清中的分泌表达。收集发酵上清，用SDS-PAGE分析，发现有重组蛋白质的表达，其分子量为181((1，与四价4 0 15的理论值8KD不一致。Westernblot分析显示重组蛋白能够与Αβ 42抗体结合，具有免疫反应性。而且进一步采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间 质谱分析测定了重组蛋白的分子量和N端的氨基酸序列。质谱结果显示重组蛋白的分子量 为8KD，与理论值一致，N端的氨基酸序列亦与Αβ15Ν端的序列相同。重组蛋白被证实为 Αβ 15后，摇瓶发酵，发酵上清经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85% 的重组四价A β 15。本发明所采用的技术方案一种重组4Αβ 15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其步骤如下1、4Αβ15基因的克隆以含有4Αβ 15基因的质粒ρ415为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经回 收后与PMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克 隆。引物序列如下Pl :5，-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3，P2 5' -GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3，2、构建重组表达质粒对含有4Αβ 15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样 用XhoI和XbaI酶切pGAPZ α A质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，构建成含有 α -factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZaA_4A0 15。3、筛选重组工程菌株将组成型酵母表达载体pGAPZaA_4Ai3 15经AvrII酶切，然后采用电击方式将酶切 产物转化毕赤氏酵母GS115，将转化液涂布含有Zeocin 25，50，100 μ g/mL的YPD平板，培养 后获得抗性菌株，挑取ZeocinlOO μ g/mL抗性菌株进行PCR鉴定，选取阳性克隆即为工程菌 株，命名为 G115Z20004A3 15。4、摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28°C _30°C培养48_96h，使毕 赤氏酵母GSl 15分泌表达4Αβ 15。对上述重组4Α β 15进行检测(I)SDS-PAGE检测收集发酵上清，用12% SDS-PAGE检测发酵上清中重组4Α β 15 的表达。(2) Western blotting检测将丙酮沉淀后，将发酵上清加样进行12 %聚丙烯酰 凝胶电泳，然后用电转移至硝酸纤维膜上，用BSA封闭硝酸纤维膜，然后依次加入一抗 (Α β 42抗体)和二抗(羊抗小鼠HRP标记IgG)，TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒 显色。(3)质谱分析从考染凝胶上切下重组蛋白带，送中山大学中山医学院蛋白质组 中心进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。5、重组四价A β 15的纯化。离心收集分泌型4Α β 15重组酵母工程菌株G115Z20004Ai3 15的发酵上清，然后用 IN NaoH 调节 pH 值至 7. 5-8. 5，载样于 UNOsphere 阴离子交换柱(1ml，Biorad. America), 先用 5-10ml 20mmolTris. cl (pH7. 5-8. 5)平衡 UNOsphere 阴离子交换柱，然后用 0-lmol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3-0. 4mol/L NaCl目标洗脱峰，得到 纯度大于85%的重组四价Aβ 15。本发明利用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Αβ 15的 表达，并且通过在引物中引入XhoI酶切位点和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和 终止密码子TCA，保证了酵母分泌表达的重组4A β 15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌 株发酵上清中目标蛋白的含量。
图1是本发明的重组表达质粒pGAPZaA_4A β 15的构建图。图2是本发明的酵母转化子的PCR的鉴定。1. DL-2000Marker ；2.宿主菌GS115 ； 3. GS115/pGAPZaA ；4.GS115/pGAPZaA_4Aβ 15。图3是本发明的SDS-PAGE电泳图谱。1.蛋白质分子量标准；2. GS115诱导表达96 小时上清；3. GS115/pGAPZaA诱导表达96小时上清；4_7. GS115/pGAPZaA_4A β 15诱导表达 24小时，48小时，72小时，96小时上清。图 4 是本发明的 Western blotting 检测。1、3. GS115/pGAPZaA_4A β 15 发酵上清； 2、4.GS115/pGAPZaA发酵上清；5.预染的蛋白质分子量。图5是本发明的重组4A β 15的质谱分析。图6是UNOsphere阴离子交换柱对发酵上清的纯化。1.标准蛋白质分子量； 2. GS115/pGAPZaA-4A3 15 发酵上清；3.穿透锋 4-8. NaCl 洗脱峰；7、8 为 0. 3mol/L NaCl 目 标洗脱峰，重组四价A β 15的纯度为90%。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明。实施例一14Αβ 15基因的克隆与测序以本研究室前期构建的pQE4A β 15为模板，设计的特异引物进行PCR扩增，扩增产 物经琼脂糖凝胶分析，大小为220bp左右，与理论值一致。产物回收后克隆到PMD18T载体， 送去上海生工进行序列测定，测序结果表明4A β 15基因已成功克隆到pMD18T载体中。引物 序列如下P1-5， CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’XhoI Lys-Arg (Kex2 位点)P2-5， GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3，XbaI2酵母组成型分泌表达载体的构建对含有4Αβ 15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样 用XhoI和XbaI酶切pGAPZ α A质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，连接后转化 TOPlO菌株，获得Zeocin抗性的转化子，从转化子中提取重组表达质粒，酶切鉴定和DNA序 列测定，证明重组表达质粒的构建完全正确。(载体构建如图1)。3重组表达质粒电转化毕赤氏酵母GSl 15
挑取毕赤氏酵母GS115单菌落，接种至YPD培养基，28°C_30°C至0D600达到1. 3 1. 5，离心收集菌体，用冰预冷的无菌水和lmol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀各洗涤两次，最 后用ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液悬浮，制成感受态细胞。将10 μ g的经AvrII线性 化的4Αβ 15基因与80 μ 1的感受态细胞混勻，在1300V，25 μ F，200 Ω条件下电击转化，用 ImL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混勻，在30°C孵育2小时，然后将菌液涂布于含有25，50， 100 μ g/mL zeocin 的 YPD 平板上，28°C _30°C培养 36 小时左右，结果在含 25，50，100 μ g/mL 分别得到40，32，20个抗性单菌落。4酵母阳性转化子的PCR鉴定
挑取上述获得的100 μ g/mL Zeocin抗性单菌落置于无菌水中，混勻，在微波炉中 加热2分钟，再置于-20°C冰箱中，冷冻5分钟，重复此过程一次。离心后取上清液进行PCR， PCR反应条件按常规设置。引物序列如下pGAP forward primer :5，-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3，；3，-A0X1 primer :5，-GCAAAT GGCATTCTGACATCC-3，。(参见INVITR0GEN酵母手册)1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物。结果 表明，以GS115基因组为模板的反应管中，没有特异带出现。在以GS115/pGAPZaA基因组 DNA为模板的反应管中，有约520bp的片段，是扩增自表达载体pGAPZaA本身的DNA片段。 而在以GS115/pGAPZa4Ai3 15基因组DNA为模板的管中有约740bp的DNA片断出现，这表明 约220bp大小的4Αβ 15基因已整合到GS115的酵母基因组中。所得阳性克隆为重组工程 菌株 G115Z20004A β 15 (如图 2)。5重组4Α β 15的检测与鉴定5. 1 重组 4Α β 15 的 SDS-PAGE 分析挑阳性克隆单菌落接种于YPD培养基中，于28°C，250rpm/min培养；每24h取样， 离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行12% SDS-PAGE分析，结果显示在ISkD左右处产 生一条新的蛋白质条带(见图3)。5. 2 重组 4Αβ 15 的 Western blotting 鉴定将丙酮沉淀后上请加样进行12%聚丙烯酰凝胶电泳，然后用电转移至硝酸纤维 膜上，用BSA封闭硝酸纤维膜，然后依次加入一抗(Αβ42抗体)和二抗(羊抗小鼠 HRP标记IgG)，TBST洗涤5次，HRP-DAB底物显色试剂盒显色。结果显示在18KD左右处， 6115Ζ20004Αβ 15发酵上清有明显的目的蛋白带，而作为负对照的GS115/pGAPZaA发酵上 清则没有特异带的出现。这表明甲醇诱导表达的重组蛋白能够与A β 42抗体结合，具有免 疫反应性(见图4)。5. 3重组4Α β 15的质谱分析从考染凝胶上切下重组蛋白带，送中山大学中山医学院蛋白质组中心进行基 质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析。质谱结果显示重组蛋白的分子量为8KD，与 4Αβ 15的分子量理论值一致，N端的氨基酸序列亦与4Αβ 15Ν端的序列相同，充分表明 6115Ζ20004Αβ 15发酵上清中的重组蛋白是4Αβ 15(见图5)。6摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28°C -30°C培养72h，使毕赤 氏酵母GSl 15分泌表达4A β 15。
7重组4A 3 15的纯化离心收集分泌型4A0 15重组酵母工程菌株G115Z2OOO4A0 15的发酵72小时 上清，然后用IN NaoH调节pH值至8.0，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad. America)，先用 5mL 20mmolTris. cl (pH8. 0)平衡UNOsphere 阴离子交换柱，然后用 0-lmol/ L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0. 3mol/L NaCl目标洗脱峰，得到纯度 为90 %的重组四价A 3 15 (如图6)。实施例二1将实施例一获得的高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28°C -30°C 培养48h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4A0 15。2、离心收集分泌型4A 0 15重组酵母工程菌株G115Z20004A 0 15的发酵48小时 上清，然后用IN NaoH调节pH值至7. 5，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad. America)，先用 8mL 20mmolTris. cl (pH 7. 5)平衡 UNOsphere 阴离子交换柱，然后用 0-lmol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0. 35mol/LNaCl目标洗脱峰， 得到纯度为86%的重组四价A 0 15。实施例三1将实施例一获得的高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28°C _30°C 培养96h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4A0 15。2、离心收集分泌型4A015重组酵母工程菌株G115Z2OOO4A015的发酵96小时 上清，然后用IN NaoH调节pH值至8. 5，载样于UNOsphere阴离子交换柱(1ml，Biorad. America)，先用 10mL 20mmolTris. cl (pH 8. 5)平衡 UNOsphere 阴离子交换柱，然后用 0-0. 5mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0. 4mol/LNaCl目标洗脱峰， 得到纯度为88%的重组四价A0 15。对上述实施例所得产物进行检测，所得结果列表如下
权利要求
一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，其特征在于，其步骤如下1)、4Aβ15基因的克隆以含有4Aβ15基因的质粒p415为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经回收后与pMD18T载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行测序，确定阳性克隆；引物序列如下P15’-CCG CTC GAG AAA AGA GAT GCA GAA TTC CGA CAT-3’P25’-GC TCT AGA TCA TTG ATG ATG AAC TTC ATA-3’2)、构建重组表达质粒对含有4Aβ15基因的pMD18T载体进行XhoI和XbaI的双酶切，回收小片段，同样用XhoI和XbaI酶切pGAPZαA质粒，回收大片段，然后再用T4DNA连接酶连接，构建成含有α-factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZaA-4Aβ15；3)、筛选重组工程菌株将组成型酵母表达载体pGAPZaA-4Aβ15经AvrII酶切，然后采用电击方式将酶切产物转化毕赤氏酵母GS115，将转化液涂布含有Zeocin 25，50，100μg/mL的YPD平板，培养后获得抗性菌株，挑取Zeocin100μg/mL抗性菌株进行PCR鉴定，选取阳性克隆即为工程菌株，命名为G115Z20004Aβ15；4)、摇瓶发酵将高表达的重组工程菌株接种于YPD液体培养基中，28℃-30℃培养48-96h，使毕赤氏酵母GS115分泌表达4Aβ15；5)、重组四价Aβ15的纯化离心收集分泌型4Aβ15重组酵母工程菌株G115Z20004Aβ15的发酵上清，然后用1N NaoH调节pH值至7.5-8.5，载样于UNOsphere阴离子交换柱，先用5-10ml 20mmolTris.c平衡UNOsphere阴离子交换柱，然后用0-1mol/L线性梯度的NaCl洗涤与交换柱结合的蛋白质，收集0.3-0.4mol/L NaCl目标洗脱峰，得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。
全文摘要
本发明涉及一种重组4Aβ15在毕赤氏酵母中的高效分泌表达及纯化方法，是将4Aβ15基因插入含有α-factor信号肽的组成型酵母表达载体pGAPZαA中，经电击转化毕赤氏酵母菌株GS115，在YPD平板上进行培养后获得工程菌株G115Z20004Aβ15，经摇瓶发酵，在发酵上清中有高含量的4Aβ15的表达，发酵上清经UNOsphere阴离子交换柱的一步纯化可得到纯度大于85％的重组四价Aβ15。本发明利用以GAP为启动子的毕赤氏酵母组成型表达体系进行重组四价Aβ15的表达，并且通过在引物中引入XhoI和XbaI酶切位点以及Kex2信号肽切割位点和终止密码子TCA，保证了重组4Aβ15的天然氨端和羧端，大大提高工程菌株发酵上清中目标蛋白的含量。
文档编号C07K14/47GK101864424SQ20101016316
公开日2010年10月20日 申请日期2010年4月11日 优先权日2010年4月11日
发明者姚志彬, 谭琳 申请人:中山大学