专利名称：一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法
技术领域：
一种4-氨基二苯甲酮的通用人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。
背景技术：
二苯甲酮主要用于塑料等作为光稳定剂，能有效保护食品塑料包装以及有机玻璃 等因光照变质，也是紫外线吸收剂、有机颜料、医药、香料、杀虫剂的中间体。由于二苯甲酮 具有挥发性，在不具功能性阻碍的情况下会从食品包装迁移到食品中。经研究发现二苯甲 酮会严重损害动物的肝肾组织，并会慢性致癌以及生殖毒性。欧盟食品安全局制定了含 二苯甲酮及4-氨基二苯甲酮的印刷油墨食品包装的最大迁移限量，规定食品包装印刷油 墨材料内的二苯甲酮迁移极限值须低于每公斤0.6毫克。目前，国内外有关二苯甲酮及 4-氨基二苯甲酮的检测主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气-质联用法 (GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，专业的操作人 员，对检材的要求也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代 检测对快速、方便、准确的要求。目前尚未见国内外有二苯甲酮酶联免疫的报道，为了弥补 这一空白，有必要制备二苯甲酮人工抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法。由于二苯甲 酮没有偶联必须的基团，所以采用4-氨基二苯甲酮作为半抗原，两者具有相同的母体，所 制备的产品用于二苯甲酮类的免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗 原。本发明的技术方案一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法，以4-氨基二苯甲 酮为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光广度法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的合成A液取0. Immol 4_氨基二苯甲酮溶于6mL N, N- 二甲基甲酰胺，冰浴，加入ImL 2mol/L HCl，再加13mL水，冰浴，滴加质量浓度1 % NaNO2溶液，冰浴中持续搅拌，NaNO2溶液 的加入量用淀粉_碘化物试纸进行监控，试纸变成蓝黑色以后，4°C下搅拌孵育15分钟为A 液；B液牛血清白蛋白BSA 0. 002mmol溶于0. 05mol/L、pH 9. 6的碳酸盐CBS缓冲液 中，为B液，4°C保存待用；将A液逐滴加入B液中，调pH 9.0然后置4°C下孵育半小时，室温反应4小时，即 得4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液；透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用；将4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0. OlM的pH7. 4的 磷酸盐缓冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨基二苯甲酮人工抗原；(2)4-氨基二苯甲酮人工抗原的鉴定4_氨基二苯甲酮人工抗原采用分光光度法 鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。偶联比测定是估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法，虽然 测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原 理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸 收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被 偶联的两种分子浓度.在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光 谱，并表现出光谱图迭加的性质。摩尔吸光系数ε 配制4-氨基二苯甲酮浓度为0，10，20，30 μ g.mL—1的0. OlM的 PBS溶液，通过紫外扫描可知4-氨基二苯甲酮的最大吸收波长为285nm，在285nm处测吸光 值，每个浓度做平行样.摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μ g -πιΓ1的牛血清白蛋 白溶液1. 5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5分钟，每个浓度做平 行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例 稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。偶联比测定配制150μ g · mL-1牛血清白蛋白的20 %乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150 μ g .mL-1,在285nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，样品溶液、空白液 测出的吸光值分别为A1, A2，则偶联比率Y为γ = [(A1-A2)/ε ]/(150X10—766200)。其中ε为摩尔吸光系数(I^mor1)AeZOO为牛血清白蛋白的分子量，150Χ10—3为 牛血清白蛋白浓度(yg'mL-1)。本发明的有益效果本发明合成了 4-氨基二苯甲酮的人工抗原，合成步骤简洁， 有效，完全可用于免疫分析当中，为以后人们的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其 研究的需要。
图1为4-氨基二苯甲酮人工抗原制备前后的紫外扫描图
具体实施例方式(1)人工抗原的制备取0. Immol 4_氨基二苯甲酮溶于6mLN，N-二甲基甲酰胺，冰浴，加入lmL2mol/L HCl，再加13mL水，冰浴，滴加质量浓度1 % NaNO2溶液(过量)，冰浴中持续搅拌。NaNO2溶 液的加入量可用淀粉_碘化物试纸进行监控，试纸变成蓝黑色以后，继续反应15分钟。为 A液。牛血清白蛋白BSA 0. 002mmol溶于pH 9. 6、0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，为B液。把A液逐滴滴加入B液中，边加边调pH 9.0，于4°C下孵育半小时，室温反应4h，即 得人工抗原混合液。透析袋前处理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去离子水冲洗 3min，保存在4°C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2 X 2L (每次2L，共2次)的0. OlM的PBS溶液和2X2L(每次2L，共2次)的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制 成粉末，即得到人工抗原。(2) 4-氨基二苯甲酮人工抗原的鉴定摩尔吸光系数ε 配制4-氨基二苯甲酮浓度为0，10，20，30 μ g.mL—1的0. OlM的 PBS溶液，通过紫外扫描可知4-氨基二苯甲酮的最大吸收波长为285nm，在285nm处测吸光 值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。本实验计算得ε =24786. 8L · mo Γ1偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0，10，20，40，60，80，100 μ g -πιΓ1的牛血清白蛋 白溶液1. 5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混勻，30°C水浴温热5分钟，每个浓度做平 行样.在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例 稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。偶联比测定配制150μ g · mL-1牛血清白蛋白的20 %乙醇溶液，将偶联产物用 20%乙醇稀释到150 μ g .mL-1,在285nm处测吸光值，以20%乙醇为空白，样品溶液、空白液 测出的吸光值分别为A1, A2，则偶联比率Y为Y = [(A1-A2)/ε ]/(150X10—766200)。本 实验计算得Y 19。其中ε为摩尔吸光系数(I^mor1)AeZOO为牛血清白蛋白的分子量，150Χ10_3为牛血清白蛋白浓度(yg'mL-1)。
权利要求
一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法，其特征在于以4-氨基二苯甲酮为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光广度法测定偶联物的偶联比；(1)人工抗原的合成A液取0.1mmol 4-氨基二苯甲酮溶于6mL N，N-二甲基甲酰胺，冰浴，加入1mL 2mol/L HCl，再加13mL水，冰浴，滴加质量浓度1％NaNO2溶液，冰浴中持续搅拌，NaNO2溶液的加入量用淀粉-碘化物试纸进行监控，试纸变成蓝黑色以后，4℃下搅拌孵育15分钟为A液；B液牛血清白蛋白BSA 0.002mmol溶于0.05mol/L、pH 9.6的碳酸盐CBS缓冲液中，为B液，4℃保存待用；将A液逐滴加入B液中，调pH 9.0然后置4℃下孵育半小时，室温反应4小时，即得4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将4-氨基二苯甲酮人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液和2×2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到4-氨基二苯甲酮人工抗原；(2)人工抗原的鉴定4-氨基二苯甲酮人工抗原采用分光光度法鉴定其偶联结果，利用标准蛋白得到标准曲线，计算其偶联比。
全文摘要
一种4-氨基二苯甲酮人工抗原的制备方法，属于生物化工技术领域。由于二苯甲酮没有偶联必须的基团，所以采用4-氨基二苯甲酮作为半抗原，两者具有相同的母体，本发明利用二苯甲酮的类似物4-氨基二苯甲酮，制备4-氨基二苯甲酮人工抗原。本发明以4-氨基二苯甲酮为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联，用分光光度法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了4-氨基二苯甲酮的人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对二苯甲酮和4-氨基二苯甲酮研究的需要。
文档编号C07K14/765GK101830981SQ201010182488
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者宋姗姗, 林菲, 胥传来, 许宙, 陈连君 申请人:江南大学