专利名称：一种抗西地那非的特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种最大可能包含西地那非原有结构的化合物作为西地那非半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。 本发明属于生物技术领域。
背景技术：
随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。随着人们生活水平的提高，人们越来越关注自己的健康，功能食品也日益受到人们的青睐。但是近些年来功能食品中违法添加药品问题十分突出，“补肾、壮阳”类功能食品中违法添加西地那非，不仅给患者造成了极大的危害，也带来了经济上的损失，已严重影响到我国人民对于食品的消费信心以及我国食品在国际市场上的竞争力。因此，加快对食品安全快速检测技术的研究开发，构建食品质量与安全保障体系，对加速我国食品流通领域现代化、提高食品在全球市场的竞争力，具有重要的现实意义和深远的战略
眉、ο非法添加在功能食品中的西地那非具有较大的副作用，对人体造成较大危害。由于西地那非在功能食品中的中的添加剂量都很微量，仪器方法检测具有很多限制和缺陷， 因此建立一种经济、可靠、特异、敏感、快速有效的方法具有重要意义。本课题根据西地那非结构制备出西地那非半抗原，进行免疫试验后得到高特异性的西地那非抗体，经过试验条件的优化，样品前处理方法的研究，建立了一种样品前处理简单、准确度高的西地那非酶联免疫检测方法，为今后西地那非试剂盒的开发研制奠定了基础。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示西地那非半抗原
权利要求
1.西地那非的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为
2.权利要求1所述的西地那非人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得1)将47.5mg西地那非加入到1. 5mL含60%氢化钠的N，N- 二甲基甲酰胺的悬浮液中并用氮气保护，室温搅拌Ih后，滴加含19mg溴乙酸乙酯的N，N- 二甲基甲酰胺0. 8mL,室温搅拌15min后，60°C油浴中继续搅拌16h，减压整除N，N-二甲基甲酰胺，残余物中加入ImL 水，用二氯甲烷提取产物，合并提取液，水洗涤后，分出有机层，无水硫酸镁干燥，滤除干燥剂，滤液减压浓缩后，残余物柱层析分离，得到取代乙酸甲酯接臂产物；2)将上述取代乙酸甲酯样品溶于ImL四氢呋喃，室温搅拌下加入氢氧化锂水溶液，室温搅拌5- ，直至薄层板中样品斑点完全消失，减压旋蒸掉四氢呋喃后，二氯甲烷先提取杂质，用5mol/L的盐酸调溶液pH 2_3后，用二氯甲烷提取制得的取代乙酸，合并提取液，水洗后无水硫酸镁干燥即可得到西地那非半抗原；3)称取423.2mg西地那非半抗原和126. 7mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于20mL无水四氢呋喃(THF)中，冰浴下搅拌0. ，加入溶有227. OmgN，N-二环己基碳二亚胺(DCC)的 5mL THF溶液，冰浴下继续搅拌lh，自然升至室温，搅拌过夜，旋蒸得到产物，将产物溶于ImL N-N 二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，将此溶液在冰浴中逐滴加入浓度为5mg mL—1的2mL KLH溶液中，搅拌，室温下反应5h，再精确称取4. 7mg EDC加入反应液中，搅拌，4°C反应过夜，然后将反应液在4°C、pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中透析三天，即可得到人工抗原；
3.权利要求1所述的西地那非酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得分别精确称权利要求2所得西地那非半抗原16.975mg溶于ImL N-N 二甲基甲酰胺溶液中，将此溶液在冰浴中逐滴加入2mL浓度为5mg/mL的HRP溶液中，搅拌，室温下反应5h， 4°C反应过夜，然后将反应液在4°C、pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液中透析三天即可得到西地那非的酶标抗原；
4.权利要求1所述的西地那非抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得免疫动物选用雌性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次，此后间隔一个月进行第五次免疫，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是初次免疫取Img按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫，加强免疫用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫，抗体纯化定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获得抗血清，使用G-kpharose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗西地那非的特异性抗体。
全文摘要
西地那非人工抗原和抗体的制备方法，涉及一种最大程度保留西地那非结构的人工半抗原、抗原和抗体的制备方法，通过化学合成方法制得的西地那非半抗原与载体KLH蛋白相连接合成人工抗原，抗体是人工抗原经动物免疫、取血，分出抗血清，纯化制得。本发明是通过设计合成具有西地那非结构的半抗原和人工抗原，突出了此分子特异性抗原决定簇又克服了化学合成的困难，并采用免疫动物诱导产生亲和性很高的抗体；与其他同类方法相比，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。
文档编号C07K16/06GK102336831SQ20101023796
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者张燕, 王俊平, 王硕, 王莉 申请人:天津科技大学