专利名称：一种土壤中抗虫水稻外源基因表达蛋白的高效提取方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤中抗虫水稻外源基因表达蛋白的高效提取方法，尤其是一种 土壤中 CrylAb/CrylAc 杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)的提取方法。
背景技术：
据ISAAA主席Clive James统计，2009年，全球25个国家的1400万农民种植了 1. 34亿公顷转基因作物，实际面积已达到1. 8亿公顷。我国在转Bt基因水稻的选育方面居 世界先进水平，且很有可能成为世界上率先商品化种植转基因水稻的国家之一。例如，浙江 大学核农所与加拿大渥太华大学合作，成功地将Bt基因导入粳稻——秀水11等多个品种 中，于1998年首次育成了遗传稳定且高抗二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等7种鳞翅目害虫 的转Bt基因水稻系列品系——转cryIAb基因克螟稻。另外，华中农业大学培育的高抗鳞 翅目害虫转Bt基因水稻品系TT51 (华恢1号)，其外源基因是crylAb/crylAc融合基因。 该转基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟和大螟等鳞翅目害虫的抗虫稳定在80%以上， 具有节省投入成本，减少劳动强度和中毒风险，大幅减少农药用量，减少环境污染，维持稻 田生物种群动态平衡等优势。这些转Bt基因水稻一旦商品化生产，无疑将给我国带来巨大 的经济和环境效益。但是，Bt水稻中外源基因及其表达产物可能是一类潜在的环境外源污 染物，有关这类生物大分子在农业生态系统中的环境行为等方面的研究已经成为国内外新 的研究热点，具有重要的科学和现实意义。但迄今为止，转Bt基因作物环境风险评价多数集中在对靶标害虫抗性或对农业 生态系统影响等方面。国内外对源于苏云金杆菌本身、Bt玉米和Bt棉花的Bt毒素的环 境行为与归趋，以及土壤中的结合态蛋白残留的生物有效性等进行了研究。美国纽约大学 Stotzky教授领导的研究小组证实了 Bt蛋白可以通过Bt玉米根系分泌，其浓度接近95 μ g g"1 土壤。Bt玉米根系和秸秆释放的CrylAb蛋白可迅速吸附在土壤活性颗粒表面，并保留 杀虫活性至少180d。他们的研究还表明，该蛋白能快速和紧密地与粘土矿物和腐殖酸等土 壤基质结合，形成结合态残留物，这种结合残留物仍保留杀虫活性，持留期可长达234d，较 之游离态更难被生物降解。Palm等报道，从土壤中提取转Bt基因棉花中的Bt蛋白的效率为27% 60%。 实际上，使用该方法提取我国某些土壤中的Bt蛋白，其提取效率相当的低(仅为4. 6 35%)。因此，为了研究Bt蛋白在土壤中的环境行为与归趋，该提取方法亟待改进。而国内 有关转Bt基因水稻的外源蛋白在土壤中的残留等研究鲜见报道，故有必要建立一种从土 壤中高效提取抗虫转基因水稻外源基因表达蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种从土壤中高效提取抗虫转基因水稻外源基因表达蛋白 尤其是CrylAb/CrylAc杀虫晶体融合蛋白的方法，并可以对获得的游离态蛋白进行检测，以便研究该蛋白在土壤环境中的行为与归趋。本发明采用的技术方案是—种土壤中抗虫水稻外源基因表达蛋白的高效提取方法，所述方法包括取 抗虫水稻周围的土壤样品，按照0.5 10mL/g 土壤的添加量加入蛋白提取液，室温 振荡提取0. 5 2. Oh,离心，取上清液重复提取1 3次，合并上清液，即得含抗虫水 稻外源基因表达蛋白的溶液；所述蛋白提取液组成如下无水碳酸钠(Na2CO3) 50 IOOmM,碳酸氢钠(NaHCO3) 50 IOOmM,乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 1. 0 5. OmM,焦磷 酸钠(Na4P2O7 · IOH2O) 20 50mM, 二 硫苏糖醇(DTT) 5 IOmM,曲拉通 X-100 (Triton X-100)0. 01 ~ 0. 1% (v/v)，溶剂为水，pH7 10。优选的，所述抗虫基因表达蛋白为CrylAb/CrylAc融合蛋白。本发明方法也可适 用于土壤中其它外源基因表达蛋白的提取，例如CrylAb、CrylAc、CrylC等蛋白，与现有常 规提取方法相比，均能获得更好的提取效率。优选的，所述蛋白提取液组成如下Na2C03100mM，NaHCO3IOOmM, EDTA 5. OmM, Na4P2O7 · IOH2O 50mM, DTT IOmM, Triton X-1000. 1% (ν/ν)，溶剂为水，ρΗ7 10。本发明关键在于蛋白提取液的设计。发明人以EnviroLogix公司生产的蛋白提 取液和按Palm等报道的方法配制的提取液提取进行了提取对照，结果显示在相同的条件 下，采用不同提取液从土壤中提取CrylAb/CrylAc融合蛋白，并用美国EnviroLogix公司的 Bt-CrylAb/Ac试剂盒测定回收率，比较后确定本发明提取液配方在3种提取液中具有最高 的提取效率。发明人选用5种不同类型的土壤——黄筋泥，红砂土，黄松土，小粉土和滨海盐土 分别进行了目标蛋白的提取，发现采用本发明方法，CrylAb/CrylAc融合蛋白的提取率随土 壤中有机质含量增加而显著提高。因此，本发明方法优选适用于有机质含量高的土壤类型， 比如黄松土和小粉土。本发明的有益效果主要体现在本发明方法步骤简单、操作简便，提取效率高，为 该蛋白在土壤中的环境行为与归趋研究提供了基础，同时也可为同类研究提供可资借鉴的 技术方法。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 本发明所需要的试剂与药品包括Na2CO3、NaHCO3、EDTA、Na4P2O7 · IOH2O,DTT,Triton X-100等，均为化学纯。选用的材料为华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系——TT51， 其外源基因是由我国科学家人工改造合成的crylAb/crylAc融合基因，受体品种是水稻 三系恢复系“明恢63”。该转基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟和大螟等鳞翅目害虫 的抗虫稳定在80%以上，具有节省投入成本，减少劳动强度和中毒风险，大幅减少农药用 量，减少环境污染，维持稻田生物种群动态平衡等优势。于水稻灌浆期，取TT51秸秆，挑出 其它植物组织残体，并用自来水洗干净，置于室内通风处自然风干半个月以上，然后用微
4型植物试样粉碎机磨成粉，再自然均衡风干2天。接着使用美国Envirologix公司提供 的纯蛋白提取液对CrylAb/CrylAc融合蛋白的进行高效提取纯化获得该蛋白，密封后放 入-70°C冰箱中保存备用。选用的5种不同类型的土壤，分别为黄筋泥，红砂土，黄松土， 小粉土和滨海盐土，分别取自浙江省不同地区未曾种植过转基因水稻的稻田0 15cm深 的表层土。取新鲜的土样，拣去植物残体、石砾等杂物，敲碎，置于室内通风处风干半个月， 磨细后过Imm筛，在室温下自然均衡两天后，供试。土壤的某些基本理化性质的测定参照 Nelson & Sommers(1982. Total carbon,organic carbon,and organic matter. In :Page, A. L. , Miller, R. H. , Keeney, D. R. (Eds. ), Methods of Soil Analysis, Part 2, Chemical andMicrobiological Properties. American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, PP. 539-579.)的方法，结果见下表1。表1 供试土壤基本理化性质 1、源于TT51的CrylAb/CrylAc融合蛋白在土壤中的提取效率测定方法 1) 5种土壤各取10. Og于IOOmL的具塞锥形瓶中，每种土壤称取10份。每份土壤 中加入1. OmL的CrylAb/CrylAc纯蛋白溶液(CrylAb/CrylAc融合蛋白含量1258. 40ng/mL, Mr = 60kDa) 2) 5种土壤的含水量用蒸馏水调至60% WHC (减去1. 0mLCrylAb/Ac蛋白溶液)，再 用玻璃棒仔细搅拌均勻。室温(25士2°C)放置2h，使CrylAb/CrylAc融合蛋白和土壤充分结合。3)每份土壤称取500mg于5mL离心管中，加入1. OmL提取液 A (Na2C03100mM+NaHC03100mM+EDTA 5. 0mM+Na4P207 ‘ 10H2050mM+DTT 10mM+Triton X-1000. 1% (ν/ν)，溶剂为水 pH7 10)，室温(25 士 2°C )振荡提取 lh，12000r/min 离心 5min，取上清液，重复提取3次，合并上清液。同时以提取液B (由EnviroLogix公司提供)和提取液C(按Palm等报道的方法 配制，具体为10. 0mmol/L Tris-HCl+1. 0mmol/L EDTA+0. lmol/L NaCl,pH8. 0)进行提取作 为对照，提取CrylAb/CrylAc融合蛋白的步骤与上述提取液A的相同。4)取适当稀释后的100 μ L上清液加入到已包埋好抗体的96孔CrylAb/Ac试剂 盒(Envirologix 公司，AP 003)，同时加入不同浓度(0、0. 5,2. 5 和 5. 0ng/ml)的 CrylAb/ CrylAc融合蛋白标准溶液进行测定并绘制标准曲线，测定步骤按试剂盒提供的方法进行。
5)用酶标仪测定，波长为450nm，依据标准曲线计算出CrylAb/CrylAc融合蛋白的 含量。依据标准曲线和提取液稀释倍数计算出纯CrylAb/CrylAc融合蛋白的添加回收率。2、土壤中CrylAb/CrylAc融合蛋白的提取效率分析1)在添加CrylAb/CrylAc融合纯蛋白的5种土壤中，提取液A对该蛋白的提取效 率为46. 2 81. 7% (见表2)。提取液A对土壤中CrylAb/CrylAc融合蛋白的提取效率显 著高于另两种提取液B和C(p < 0.01)。其中，提取液B对纯蛋白的添加回收率为7. 3 34.2%,提取液C相应的提取效率则为4. 6 21. 3%。对比3种提取液的提取效率，提取液 A最适合用于提取土壤中的CrylAb/CrylAc融合蛋白。表2 3种提取液分别对5种土壤中CrylAb/CrylAc融合蛋白的提取效率 2)不同类型土壤中提取液A对CrylAb/CrylAc融合蛋白的提取效率是不相同的。 土壤中该蛋白的添加回收率与土壤有机质含量显著相关，而与土壤PH、粘粒度和阳离子交 换量等无显著相关。3)在高有机质土壤中CrylAb/CrylAc融合蛋白的回收率明显高于低有机质含量 的土壤。CrylAb/CrylAc融合蛋白在土壤中的高提取效率主要取决于蛋白的化学特性、提取 液的成分以及土壤性质等因素。4)焦磷酸钠是提取土壤中有机质的最有效的提取剂之一，提取液A中含有焦磷酸 钠成分，能够提取吸附和结合在土壤有机质中的大部分蛋白，因此提取效率随土壤有机质 含量的增加而显著提高。5)由于该蛋白的等电点(PI)为5. 5，提取缓冲液的pH值应该远离pi点。发明人 经研究已经证实低PH值(3.0 7.0)的提取缓冲液导致很低的回收率，而碱性的缓冲液得 到较高的回收率。一种标准的缓冲液体系需要使得蛋白质更稳定，且不能破坏蛋白质的化 学性质和结构，所以为了更高效地从土壤中提取获得该蛋白，本发明选择提取缓冲液的PH 值为7 10。6)当遇到土壤中的巯基酶时，需要在蛋白提取液中添加金属络合剂EDTA和巯基 试剂DTT，用于络合痕量金属离子如Ca2+、Mg2+和Fe2+(能直接与巯基残留物结合)。而浓度 为0. 025 0. 5%的Triton X-100比其他表面活性剂(如Tween-20等)更能有效地提取 土壤中的CrylAb/CrylAc融合蛋白。某些土壤的提取效率较低，可能是由于部分蛋白与土 壤基质结合紧密，处于结合态，不可提取。而提取获得的游离态CrylAb/CrylAc融合蛋白能
6够用ELISA方法测定，该方法目前已经比较成熟，且可信度较高。
权利要求
一种土壤中抗虫水稻外源基因表达蛋白的高效提取方法，所述方法包括取抗虫水稻周围的土壤样品，按照0.5～10mL/g土壤的添加量加入蛋白提取液，室温振荡提取0.5～2.0h，离心，取上清液重复提取1～3次，合并上清液，即得含抗虫水稻外源基因表达蛋白的溶液；所述蛋白提取液组成如下Na2CO350～100mM，NaHCO350～100mM，EDTA1.0～5.0mM，Na4P2O7·10H2O 20～50mM，DTT 5～10mM，Triton X 1000.01～0.1％，溶剂为水，pH710。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗虫基因表达蛋白为CrylAb/CrylAc融合蛋白ο
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白提取液组成如下=Na2CO3IOOmM, NaHCO3IOOmM, EDTA 5. OmM, Na4P2O7 ‘ IOH2O 50mM, DTT IOmM, Triton X-1000· 1 %，溶剂为水， pH710。
全文摘要
本发明提供了一种土壤中抗虫水稻外源基因表达蛋白的高效提取方法，所述方法包括取抗虫水稻周围的土壤样品，按照0.5～10mL/g土壤的添加量加入蛋白提取液，室温振荡提取0.5～2.0h，离心，取上清液重复提取1～3次，合并上清液，即得含抗虫水稻外源基因表达蛋白的溶液；所述蛋白提取液组成如下Na2CO350～100mM，NaHCO350～100mM，EDTA 1.0～5.0mM，Na4P2O7·10H2O 20～50mM，DTT5～10mM，Triton X-1000.01～0.1％，溶剂为水，pH7～10。本发明方法步骤简单、操作简便，提取效率高，为该蛋白在土壤中的环境行为与归趋研究提供了基础，同时也可为同类研究提供可资借鉴的技术方法。
文档编号C07K1/14GK101921341SQ20101023787
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者叶庆富, 张燕飞, 汪海燕 申请人:浙江大学