专利名称：荧光标记的配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种标记的非肽配体库，它包含一个或多个配体部分，它们各自连接 到一个或多个不同标记部分；其制备方法；合理设计库以及由标记配体库进行选择的方 法；包含用于制备标记的非肽配体库的活性非肽配体以及活性标记底物的试剂盒；伴随其 药理学信息产生的标记的非肽配体；新的标记的配体；新的配体前体及其制备方法；已知 的和新的标记的配体以及标记的配体库在研究受体结合中的用途，所述受体结合如G-蛋 白质偶联受体(GPCR)结合或者细胞内酶抑制如环核苷酸磷酸二酯酶抑制以及将药物结合 到药物转运蛋白(例如，核苷转运蛋白或者ATP结合盒转运蛋白)；更具体地是使用如共焦 显微术和荧光激活分选以及荧光相关显微镜的技术研究细胞群或单细胞如急性分散细胞 中的这些相互作用。
背景技术：
所述腺苷-Al受体(A1-AR)是GPCR，它是在各种组织(包括脑、心脏、脂肪组织以 及肌肉)中发现的，并且已经在各种病症的病理生理学中提到(Ralevic，V.和Burnstock， J(1998)Pharmacol. Rev. 50，415)。目前，A1-AR药理学的研究仅可以在细胞中很好的进行，所述细胞可以使用例如放 射性配体结合的技术大量生长。放射自显影法能进行单独的细胞研究，但是不能直接判读 结合情况，而且要花费至多4-6周来使胶片显影，得到结合的结果。为了克服这一问题，已 经采用很少的荧光配体来使受体显像，并使用共焦显微术(CSLM)、共焦板读数器、荧光偏振 板读数器以及荧光相关光谱(FCS)在单细胞中获得定量的受体-配体结合的数据。共焦显 微术可以显示细胞的剖面，荧光团在细胞边缘的浓度显示膜受体的结合。FCS分析荧光种类 的扩散特征，快速扩散的游离配体可以不同于缓慢扩散的受体结合配体，并在容积定位到 于细胞膜上时同时进行定量。McGrath等TiPS，1996年11月(卷17)393-399讲述了使用荧光配体代替更多常 规放射性配体来研究细胞受体的可能性，使用共焦光谱学和荧光激活细胞分选(FACS)来 记录指示受体数的配体-受体复合物的量。他之处为了识别其结合位点(主要目的在于受 体的定位，而不是研究其性质)，已经作出很多努力来将荧光分子共轭到受体配体上。已经 报道一些化合物在结合到受体上时发荧光，但是在水相中则产生低的背景噪声。所报道的 目的是生产荧光药物，当结合到受体上时仍能保持荧光，而且，当洗去未结合的药物时仍能 保持结合。因此，需要很高的受体结合亲和性。评论性的工作包括结合到烟碱受体、肾 上腺素受体、阿片样GPCR型受体、组胺、神经加压素和α-肾上腺素受体的荧光配体。所述 出版物也评论了共焦显微术的优点。只有在很少的上述情况下报道了研究配体的药理学性质的努力。但是，很少使受体和受体类显像的努力起到作用。药理学性质通常在一定程度上 受到将荧光团连接到任意受体结合配体的影响，并且包括结合亲和性改变以及受体(即激 动剂或拮抗剂的性质)的活化等。为了量化所观察到的结合效果，在任何研究中了解荧光 配体的药理学是重要的。事实上，合成用于GPCR的非肽荧光配体存在严重的问题。少数合成的用于细胞 表面受体的市售非肽荧光配体包括阻胺-BODIPY FL和(以下图示)CGP12177-B0DIPY TMR (分子探针)所述BODIPY (BDI)荧光团最初设计用于附着于蛋白质，所述蛋白质具有更加均 一的附着可能性。可以得到一种试剂盒，它包含荧光团和一组普遍附着于大多数蛋白质的 试齐LU
权利要求
一种由如下通式(I)表示的化合物及其盐 (LigJL)mL(JTFl)m(JTL(JLLig)m)p其中，任意的旋光荧光配体作为外消旋物或其旋光异构体中的一种存在；它包含配体部分Lig，所述配体部分Lig在连接位点或连接官能团JT和JL通过接头L连接到荧光团部分Fl；其中，Lig包含非肽GPCR配体；L选自胺、酰胺、以及饱和或不饱和的取代的或未取代的C1 600支链或直链脂族、芳族、脂环族基团，以及它们的组合，它们可包含一个或多个选自N、O、S、P的杂原子，其中，取代基选自任意的C1 20脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个包括一个或多个上述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、肼、氧代、氰基、羰基、以及它们的组合；L是单体、具有2 30个低聚重复单元的低聚物、或具有超过30到至多300个聚合重复单元的聚合物；m是各自独立地选自1 3的整数；p是0 3；Fl是红色、近红外或蓝色染料；其中，Fl包括取代基 t ，它是杂芳基或链烯基团，起到荧光修饰功能，将荧光移到光谱的红区，并提高吸收的最大值，条件是a)当Lig是XAC以及L是单键、或L是gly并且n＝3，或L是NCS时，Fl不是荧光素；以及当Lig是XAC以及L是单键或NCS时，Fl不是荧光素或NBD；b)当Lig是腺苷时，Fl不是Fmoc；以及当Lig是ADAC以及L是 (Ph CH2CONH)2(CH2)2 、或L是单键时，Fl不是荧光素、NBD或若丹明；以及当Lig是NECA以及L是单键、或是 (CH2)m，其中当m是2，4，6，8，或10时，那么Fl不是NBD，或当m是3，4，6，8，10或12时，那么Fl不是丹磺酰基；以及当Lig是N6 [2 (4 氨基苯基)乙基]腺苷以及L是(CH2)2PhNH时，Fl不是FITC；以及d)当Lig是CGP12177以及L是单胺薄荷烷时，Fl不是BODIPYTMR；以及当Lig是CGP12177以及L是1，1，4，4 四甲基丁基胺时，Fl不是BODIPYFL；及当L是C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NHCSNG 时，Fl不是FITC、曙红或赤藓红；及当L是单胺薄荷烷时，Fl不是FITC；以及当Lig是CGP12177以及L是单键时，Fl不是NBD；以及当Lig是阿普洛尔以及L是 C(CH3)2 或单键时，Fl不是NBD；以及e)当Lig是XAC以及L是单键时，Fl不是BODIPYTM630/650；以及f)当Lig是ABEA以及L是单键时，Fl不是BODIPYTM630/650。FSA00000240861600021.tif,FSA00000240861600022.tif
2.如权利要求1所述的化合物及其盐，其特征在于，Fl选自EvoBlue染料、菁蓝染料、 dyomics (DY染料和ATTO染料)、Alexaf Iuor染料、荧光藻胆蛋白，以及BDI染料包括4，4- 二 氟-4-硼_3a，4a- 二氮_s_苯并二茚染料。
3.如权利要求1所述的化合物及其盐，其特征在于，Fl选自4，4-二氟-4-硼-3a，4a_ 二氮-S-苯并二茚荧光团。
4.一种由如下通式(I)表示的化合物及其盐(LigJL)fflL (J1Fl)ffl (JTL (JLLig) Jp 其中，任意的旋光荧光配体作为外消旋物或其旋光异构体中的一种存在； 它包含配体部分Lig，述配体部分Lig在连接位点或连接官能团Jt和1通过接头L连 接到荧光团部分Fl ；其中，Lig包含非肽GPCR配体；L选自胺、酰胺、以及饱和或不饱和的取代的或未取代的C1-600支链或直链脂族、芳 族、脂环族基团，以及它们的组合，它们可包含一个或多个选自N、0、S、P的杂原子，其中， 任选的取代基选自任意的C1-20脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个包括一个或多 个上述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、胼、氧代、氰基、羰基、以及它们的组合；L是单体、具有 2-30个低聚重复单元的低聚物、或具有超过30到至多300个聚合重复单元的聚合物； m是各自独立地选自1-3的整数； P 是 0-3 ；Fl是红色、近红外或蓝色染料；所述化合物或其盐用于在共焦显微术或荧光关联光谱术中显影受体结合、评定荧光配 体的药效性能、或者在结合到靶受体的新化学实体的高通量筛选中，其中，所述化合物显示 低背景荧光，不需要通过在进行共焦显微术或荧光关联光谱术之前进行洗涤来除去未结合 的配体， 条件是a)当Lig是XAC以及L是单键、或L是gly并且η= 3，或L是NCS时，Fl不是荧光素；以及当Lig是XAC以及L是单键或NCS时，Fl不是荧光素或NBD ；b)当Lig是腺苷时，Fl不是Fmoc；以及当Lig是ADAC以及L是-(Ph-CH2CONH)2 (CH2) 2_、或L是单键时，Fl不是荧光素、NBD或 若丹明；以及当Lig是NECA以及L是单键、或是-(CH2)m，其中当m是2，4，6，8，或10时，那么Fl不 是NBD，或当m是3，4，6，8，10或12时，那么Fl不是丹磺酰基；以及当Lig是N6-[2-(4-氨基苯基)乙基]腺苷以及L是(CH2)2PhNH时，Fl不是FITC ；以及d)当Lig是CGP12177以及L是单胺薄荷烷时，Fl不是BODIPY TMR ；以及当Lig是CGP12177以及L是1，1，4，4-四甲基丁基胺时，Fl不是BODIPY FL ；及当 L是C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NHCSNG-时，Fl不是FITC、曙红或赤藓红；及当L是单胺薄荷 烷时，Fl不是FITC ；以及当Lig是CGP12177以及L是单键时，Fl是NBD ；以及 当Lig是阿普洛尔以及L是-C(CH3)2-或单键时，Fl不是NBD ；以及e)当Lig是XAC以及L是单键时，Fl不是B0DIPY 630/650；以及f)当Lig是ABEA以及L是单键时，Fl不是B0DIPY 630/650。
5.如权利要求4所述的化合物及其盐，其特征在于，Fl选自4，4-二氟-4-硼-3a，4a_ 二氮-S-苯并二茚荧光团。
6. 一种由如下通式(I)表示的化合物及其盐 (LigJL)fflL (J1Fl)ffl (JTL (JLLig) Jp 其中，任意的旋光荧光配体作为外消旋物或其旋光异构体中的一种存在； 它包含配体部分Lig，述配体部分Lig在连接位点或连接官能团Jt和1通过接头L连 接到荧光团部分Fl ；其中，Lig包含非肽GPCR配体；L选自胺、酰胺、以及饱和或不饱和的取代的或未取代的C1-600支链或直链脂族、芳 族、脂环族基团，以及它们的组合，它们可包含一个或多个选自N、0、S、P的杂原子，其中， 任选的取代基选自任意的C1-20脂族、芳族或脂环族取代基，它们中任一个包括一个或多 个上述杂原子、羟基、硫醇、卤素、胺、胼、氧代、氰基、羰基、以及它们的组合；L是单体、具有 2-30个低聚重复单元的低聚物、或具有超过30到至多300个聚合重复单元的聚合物； m是各自独立地选自1-3的整数； P 是 0-3 ；Fl是红色、近红外或蓝色染料；所述化合物或其盐用于在荧光关联光谱术中显影受体结合、评定荧光配体的药效性 能，或者在结合到靶受体的新化学实体的高通量筛选中，其中使用荧光配体的荧光靶标所 述荧光配体包括GFP-标记的受体或荧光抗体，其中，Fl是红色或近红外染料，光谱特征选 择成允许进行最佳的两色交叉相关的单光子或多光子荧光关联光谱术，或者Fl是蓝色染 料，光谱特征选择成允许进行最佳的两色交叉相关的多光子荧光关联光谱术， 条件是a)当Lig是XAC以及L是单键、或L是gly并且η= 3，或L是NCS时，Fl不是荧光素；以及当Lig是XAC以及L是单键或NCS时，Fl不是荧光素或NBD ；b)当Lig是腺苷时，Fl不是Fmoc；以及当Lig是ADAC以及L是-(Ph-CH2CONH)2(CH2)2-、或L是单键时，Fl不是荧光素、NBD或 若丹明；以及当Lig是NECA以及L是单键、或是-(CH2)m，其中当m是2，4，6，8，或10时，那么Fl不 是NBD，或当m是3，4，6，8，10或12时，那么Fl不是丹磺酰基；以及当Lig是N6-[2-(4-氨基苯基)乙基]腺苷以及L是(CH2)2PhNH时，Fl不是FITC ；以及d)当Lig是CGP12177以及L是单胺薄荷烷时，Fl不是BODIPY TMR ；以及当Lig是CGP12177以及L是1，1，4，4-四甲基丁基胺时，Fl不是BODIPY FL ；及当 L是C(CH3)2(CH2)2C(CH3)2NHCSNG-时，Fl不是FITC、曙红或赤藓红；及当L是单胺薄荷 烷时，Fl不是FITC ；以及当Lig是CGP12177以及L是单键时，Fl不是NBD ；以及 当Lig是阿普洛尔以及L是-C(CH3)2-或单键时，Fl不是NBD ；以及e)当Lig是XAC以及L是单键时，Fl不是B0DIPY 630/650；以及f)当Lig是ABEA以及L是单键时，Fl不是B0DIPY 630/650。
7.如权利要求6所述的化合物及其盐，其特征在于，Fl选自EvoBlue染料、菁蓝染料、 dyomics (DY染料和ATTO染料)、Alexaf Iuor染料、荧光藻胆蛋白，以及BDI染料包括4，4- 二 氟-4-硼_3a，4a- 二氮_s_苯并二茚染料。
全文摘要
本发明涉及荧光标记的配体，提供了一种由如下通式(I)表示的化合物及其盐 (LigJL)mL(JTFl)m(JTL(JLLig)m)p。
文档编号C07D209/56GK101962390SQ20101026089
公开日2011年2月2日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年4月2日
发明者B·凯拉姆, M·乔治, R·J·米德尔顿, S·J·希尔 申请人:圣瑞细胞荧光技术有限公司