专利名称：在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋 ...的制作方法
在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质的方法
背景技术：
(I)发明领域
本发明涉及在巴斯德毕赤氏酵母G0ZcAia pastor is")中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本发明涉及使用重组的巴斯德毕赤氏酵母菌株，其不展现对于聚糖或O-聚糖的^ -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自由对于聚糖或O-聚糖的P -甘露糖基转移酶1、3和4的活性构成的组的至少一种活性。这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以产生蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的a-甘露糖苷酶抗性的￠-甘露糖残基。本发明进一 步涉及在巴斯德毕赤氏酵母OcYcAia中生产双唾液酸化的人促红细胞生成素的
方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测交叉结合活性。(2)相关技术的说明
生产重组的人蛋白质的能力引起了人体健康护理领域的很大发展，仍然是药物开发的活跃领域。许多治疗蛋白质需要向蛋白质的特定天冬酰胺残基翻译后添加聚糖GV-糖基化)以确保适当的结构-功能活性和随后在人血清中的稳定性。对于在人类中的治疗用途，糖蛋白需要人类样的糖基化。可以模拟人类样糖蛋白加工的哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞、人类视网膜细胞)具有几个缺点，包括低的蛋白质滴度、长发酵时间、异源产物、以及持续的病毒防范。因而希望的是使用不仅在短发酵时间中产生高的蛋白质滴度、而且还产生人类样糖蛋白的表达系统。真菌宿主例如甲基营养型酵母巴斯德毕赤氏酵母具有用于治疗蛋白质表达的独特优点，例如，它们不分泌高量的内源蛋白质，生产异源蛋白质的可诱导的强启动子是可用的，它们可以在化学成分已知的培养基中生长并且不使用动物血清，它们可以生产高滴度的重组蛋白质(Cregg et al. , FEMS Microbiol. Rev. 24:45-66 (2000))。然而，在巴斯德毕赤氏酵母中表达的糖基化蛋白质一般含有额外的甘露糖糖类，产生“高甘露糖”的聚糖，以及在糖蛋白上赋予负电荷的甘露糖基磷酸基团。具有高甘露糖聚糖或具有带电甘露聚糖的糖蛋白存在着在人类中引起不希望的免疫反应的风险(Takeuchi, Trends in Glycosci. Glycotechnol. 9:S29-S35 (1997) ；Rosenfeld andBallou, J. Biol. Chem. 249: 2319-2321 (1974))。因而，希望的是在真菌宿主细胞中生产治疗性糖蛋白，在所述宿主细胞中糖蛋白上的糖基化模式相同于、或类似于在人类中产生的糖蛋白上发生的模式，并且不具有可检测的P -甘露糖基化。如在未感染的个体中保护性抗体的存在所证明的，P -连接的甘露聚糖可能是免疫原性的，或不利地影响施用包含￠-连接的甘露聚糖的治疗蛋白质或糖蛋白的个体。另夕卜，在治疗蛋白质上暴露的甘露糖基团被巨噬细胞上的甘露糖受体快速地清除，导致低药物效力。因而，在真菌宿主例如巴斯德毕赤氏酵母中表达的异源治疗蛋白质的或化连接的聚糖上￠-连接的甘露糖残基的存在不是期望的，考虑到它们的免疫原性可能性以及它们与清除因子结合的能力。
在巴斯德毕赤氏酵母中制造的糖蛋白已经被报道含有￠-连接的甘露糖残基。在2003 年，Trimble 等(Glycobiol. 14: 265-274，Epub Dec 23)报道了在巴斯德毕赤氏酵母中表达的重组的人胆汁盐刺激脂肪酶(hBSSL)中￠-1, 2-连接的甘露糖残基的存在。已经在巴斯德毕赤氏酵母和白色念珠菌(Candida albicans)中鉴定了编码几种P _甘露糖基转移酶的基因(参见美国专利No. 7,465,577和Mille a人，J. Biol. Chem. 283:9724-9736 (2008))。根据上文，需要提供在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中制造重组治疗蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏在施用所述重组治疗蛋白质或糖蛋白的个体中可能引发不良反应的表位。确定重组治疗蛋白质或糖蛋白在施用给个体时是否提供了引发不良反应的风险的方法，是将重组治疗蛋白质或糖蛋白与针对总宿主细胞抗原制备的抗体接触。对于预期长期施用的蛋白质或糖蛋白这是特别关注的。缺乏与抗体的交叉结合表明所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。因而，需要生产重组治疗蛋白质或糖蛋白 的方法，所述重组治疗蛋白质或糖蛋白缺乏与所述抗体的可检测的交叉结合活性，并且当施用给个体时不太可能引发不良反应。发明概述
本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。特别地，本发明提供了利用重组的甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母菌株来生产重组蛋白质和糖蛋白的方法，所述酵母不展现对于N-聚糖或0-聚糖的P -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自3 -甘露糖基转移酶I、3 -甘露糖基转移酶3和3 -甘露糖基转移酶4的对于Ar-聚糖或聚糖的至少一种活性。在一个方面,所述宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母菌株，其中编码￠-甘露糖基转移酶2的基因，以及编码选自￠-甘露糖基转移酶I、3和4的P -甘露糖基转移酶的至少一种基因(分别为基因BMTl'Wn'Wm被删除或破坏或突变以产生无活性的3 -甘露糖基转移酶，来生产重组蛋白质和糖蛋白。在其他方面3 -甘露糖基转移酶I、3 -甘露糖基转移酶3和3 -甘露糖基转移酶4的一种或更多种的活性利用3 -甘露糖基转移酶抑制物来取消，所述抑制物包括但不限于化合物、针对编码P -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的反义DNA，针对编码P -甘露糖基转移酶的一种或更多种mRNA的siRNA。这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以生产蛋白质和糖蛋白，在其上缺乏可检测的a-甘露糖苷酶抗性的￠-甘露糖残基。本发明进一步提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产双唾液酸化的人促红细胞生成素的方法，所述双唾液酸化的人促红细胞生成素缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性。所述方法和宿主细胞允许产生重组治疗蛋白质和糖蛋白，与此处公开的未修饰的菌株中生产的相比，其在施用所述重组治疗蛋白质和糖蛋白的个体中具有引发不良反应的降低的风险。所述方法和宿主细胞对于生产具有结合清除因子的更低可能性的重组蛋白质或糖蛋白也是有用的。在一个方面，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于N-聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自￠-甘露糖基转移酶I活性和P -甘露糖基转移酶3活性的、对聚糖或0-聚糖的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于N-聚糖或O-聚糖的P -甘露糖基转移酶2活性、P -甘露糖基转移酶I活性和^ -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现对聚糖或0-聚糖的￠-甘露糖基转移酶4活性。在另一个方面，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有编码3-甘露糖基转移酶2活性的基因的删除或破坏，以及选自编码￠-甘露糖基转移酶I活性和￠-甘露糖基转移酶3活性的基因的至少一种基因的删除或破坏，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码3 -甘露糖基转移酶2活性、3 -甘露糖基转移酶I活性和￠-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码P-甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。
在另一个方面，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中￠-甘露糖基转移酶2基因和选自￠-甘露糖基转移酶I (S#77)和￠-甘露糖基转移酶3
的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，^ -甘露糖基转移酶2 CBMm, & -甘露糖基转移酶I (MTl)和￠-甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因被删除。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括￠-甘露糖基转移酶4 (S#7￥)基因的删除或破坏。在另一个方面，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的@-甘露糖基转移酶2活性，不展现选自3-甘露糖基转移酶I和3-甘露糖基转移酶3的对于聚糖或聚糖的至少一种活性，以及其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的3 -甘露糖基转移酶2活性、3 -甘露糖基转移酶I活性和3 -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或O-聚糖的& -甘露糖基转移酶4活性。在另一个方面，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞具有编码3 -甘露糖基转移酶2活性的基因的删除或破坏，以及编码选自￠-甘露糖基转移酶I活性和￠-甘露糖基转移酶3活性的活性的至少一种基因的删除或破坏，以及其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码&-甘露糖基转移酶2活性、& -甘露糖基转移酶I活性和3-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞具有编码￠-甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。在另一个方面，本发明提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中￠-甘露糖基转移酶2 (沒#720基因和选自^ -甘露糖基转移酶I (MT卿P -甘露糖基转移酶3 CBMT3)的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述￠-甘露糖基转移酶2 CBMm, ￠-甘露糖基转移酶I (S#77)和甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因被删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括P -甘露糖基转移酶(A#7￥)基因的删除或破坏。一般地，与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在例如夹心ELISA或Western印迹的分析中测定。所述方法对于生产治疗蛋白质或糖蛋白是特别有用的。治疗蛋白质或糖蛋白的实例包括但不限于促红细胞生成素(EPO);细胞因子例如干扰素a、干扰素0、干扰素Y和干扰素《 ;以及粒细胞-集落刺激因子(GCSF) ;GM-CSF;凝血因子例如因子VIII、因子IX和人类蛋白质C ;抗凝血酶III ;凝血酶；可溶的IgE受体a链；免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合物和IgM ;免疫粘附素和其他Fe融合蛋白，例如可溶的TNF受体-Fe融合蛋白；RAGE_Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；胃促胰酶；和脲胰蛋白酶抑制物；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；annexin V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子_2 ;骨髓祖代抑制因子_1 ;护骨素(osteoprotegerin) ; a-I-抗胰蛋白酶；a-feto蛋白；DNase II;人类血纤蛋白溶解酶原的kringle 3 ;葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白I ;促滤泡激素；细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 - Ig ;跨膜激活物和I丐调节物和亲环蛋白(cyclophilin)配体；高血糖素样蛋白质I ;和IL-2受体激动剂。在宿主细胞或方法的特定实施方式中，编码所述重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母表达而被优化。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞被遗传工程化来产生具有人类样聚糖的糖蛋白。在宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，宿主细胞进一步不展现对于糖蛋白上的聚糖的a 1，6-甘露糖基转移酶活性，并且包括与细胞靶向信号肽融合的a 1，2_甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将a I, 2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶I催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将GIcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的GlcNAc转移酶II催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结
构域相连，并且被选择以将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的岩藻糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将岩藻糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括选自由GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI和GnTIX构成的组的一种或更多种GlcNAc转移酶。在宿主细胞或方法的再进一步的实施方式中，所述宿主细胞被遗传工程化以产生糖蛋白，所述糖蛋白主要具有选自Man5Gl cNAc2、GlcNAcMan5G I cNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2, NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc(1_4)Man3GlcNAc2、Gal (1_4)G1cNAc (1_4)Man3GlcNAc2、和 NANA (1_4)Gal (1_4)G1cNAc (1_4)Man3GlcNAc2的聚糖，其中下标表示聚糖结构上特定糖残基的数目。聚糖结构的实例包括但不限于 Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2^ Gal2GlcNAc3Man3GIcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GIcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2^ Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2^ Gal4GlcNAc4Man3GIcNAc2、NANAGa12GIcNAc2Man3GIcNAc2, NANA2GaI2GIcNAc2Man3GIcNAc2、NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2和 NANA4Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2。进一步的提供的是组合物，其包含使用上述宿主细胞的任一种通过上述方法获得的一种或更多种重组糖蛋白。在进一步的方面中，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现3-甘露糖基转移酶2活性和选自3-甘露糖基转移酶I活性和3-甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，以及其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现& -甘露糖基转移酶4活性。在进一步的方面中，本发明提供了重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有编码3 -甘露糖基转移酶2活性、3 -甘露糖基转移酶I活性和3 -甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码@-甘露糖基转移酶4活性的基因的删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有^ -甘露糖基转移酶2 (.BMT2)基因和选自P -甘露糖基转移酶I (MTl)和P -甘露糖基 转移酶3 (BMT3)基因的至少一种基因的删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去。在特定的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码￠-甘露糖基转移酶4 (谷#7￥)基因的基因的删除或破坏。在再进一步的方面中，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述酵母主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，其不展现对于聚糖或O-聚糖的3 -甘露糖基转移酶2活性，不展现选自^ -甘露糖基转移酶I活性和P -甘露糖基转移酶3活性的对于聚糖或O-聚糖的至少一种活性，被遗传工程化以产生唾液酸终止的双分枝聚糖，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进 一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性、^ -甘露糖基转移酶I活性和P -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步不展现3-甘露糖基转移酶4活性。在再进一步的方面中，本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述酵母主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组宿主细胞，其被遗传工程化以产生唾液酸终止的双分枝聚糖，其中编码3 -甘露糖基转移酶2活性的基因以及编码选自P-甘露糖基转移酶I活性和P-甘露糖基转移酶3活性的活性的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进一步的实施方式中，所述宿主包含编码3 -甘露糖基转移酶2活性、3 -甘露糖基转移酶I活性和3 -甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括编码P-甘露糖基转移酶3活性的基因的删除或破坏。在再进一步的方面中，本发明提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述巴斯德毕赤氏酵母主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以产生唾液酸终止的双分枝聚糖，其中3 -甘露糖基转移酶2基因和选自￠-甘露糖基转移酶I (S#77)和￠-甘露糖基转移酶30 #/^)基因的至少一种基因被删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码融合蛋白，所述融合蛋白包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素，所述信号肽靶向ER，并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在进一步的实施方式中，所述宿主包含β-甘露糖基转移酶2 (沒#720基因、β-甘露糖基转移酶I (沒#77)基因和甘露糖基转移酶3 (沒#7^)基因的删除或破坏。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞进一步包括β -甘露糖基转移酶3基因(ΜΜΤ4)的删除或破坏。在宿主细胞或方法的特定的实施方式中，融合到促红细胞生成素的末端的信号肽是酿酒酵母(5 cerevisiae) a MATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。在宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，至少一种核酸分子编码融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，以及至少一种核酸分子编码融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽、鸡溶菌酶信号肽 。在宿主细胞或方法的进一步的实施方式中，编码促红细胞生成素的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母中表达而被优化。在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在方法的进一步的实施方式中，从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，随后是羟磷灰石层析步骤，其任选地跟随着阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。本发明进一步提供了组合物，其包含利用上述宿主细胞从上述方法获得的成熟的人促红细胞生成素以及药学上可接受的盐，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在特定的实施方式中，约50到60%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基；在进一步的实施方式中，大于70%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基；在进一步的实施方式中，大于80%的聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基。在进一步的方面中，小于30%的N-聚糖是中性的N-聚糖(S卩，在N-聚糖的非还原末端处的至少一个末端上不是唾液酸化的)。在再进一步的方面中，小于20%的N-聚糖是中性的N-聚糖。在特定的方面中，约99%的N-聚糖含有一个或更多个唾液酸残基，以及小于1%的N-聚糖是中性的聚糖。在进一步的方面中，提供了组合物，其中存在每摩尔rhEPO 4. 5摩尔或更多的唾液酸。在进一步的方面中，提供了组合物，其中存在每摩尔rhEPO至少5. O摩尔的唾液酸。在组合物的进一步的实施方式中，所述成熟的人促红细胞生成素轭合到亲水性聚合物，在特定的方面中所述亲水性聚合物是聚乙二醇聚合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在特定的实施方式中，所述聚乙二醇聚合物轭合到所述成熟的人促红细胞生成素的末端，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
如在此使用的，术语“N-聚糖”和“糖形式”可互换地使用，是指连接的低聚糖，例如，通过天冬酰胺乙酰葡萄糖胺连键与多肽的天冬酰胺残基连接的低聚糖。连接的糖蛋白含有与蛋白质中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡萄糖胺残基。糖蛋白中存在的主要糖类是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、乙酰半乳糖胺(GalNAc)、#-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白，糖基团的加工与翻译共同地发生于ER的腔中，并在翻译后在高尔基体中继续。N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2的五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄 糖；“NAc”是指乙酰基；GlcNAc是指乙酰葡萄糖胺)。聚糖根据包含外周糖类(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(触角)的数目而不同，所述外周糖类被添加到Man3GlcNAc2 (“Man3”)核心结构，所述核心结构也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”。聚糖根据它们的分枝成分来分类(例如，高甘露糖、复合的或杂合的)。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型聚糖一般具有连接到1，3甘露糖臂的至少一个GlcNAc，和连接于“三甘露糖”核心的1，6甘露糖臂的至少一个GlcNAc。复合聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基，其任选地用唾液酸或衍生物修饰(例如，“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸，“Ac”是指乙酰基)。复合聚糖还可以具有链内的取代，其包含“二分的(bisecting^GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复合聚糖还可以具有“三甘露糖核心”上的多分枝，常称为“多分枝聚糖”。“杂合聚糖具有在三甘露糖核心的1，3甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc，以及三甘露糖核心的1，6甘露糖臂上的零个或更多个甘露糖。各种聚糖也被称为“糖形式”。在此使用的缩写具有本领域通用的用途，参见，例如，上述的糖类缩写。其他常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“糖苷酶”，其都是指肽糖苷酶F (EC 3.2.2. 18)。如在此使用的，术语“重组宿主细胞(“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称“宿主细胞”)意图指已经导入重组载体的细胞。要理解的是，这种术语不仅仅意图指特定的主题细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响在继承的代中可能出现某些改变，实际上，这种子代可能不与母细胞相同，但仍然包括在此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是在培养物中生长的分离的细胞或细胞系，或可以是存在于活组织或生物体中的细胞。优选的宿主细胞是酵母和真菌。“不展现”酶活性的宿主细胞是指一种宿主细胞，其中所述酶活性已经被取消或破坏。例如，通过删除或破坏编码酶活性的基因(包括删除或破坏控制基因表达的上游或下游调节序列)可以取消或破坏酶活性；通过突变编码酶活性的基因使得编码酶活性的基因无功能来取消或破坏酶活性；通过使用酶活性化学、肽或蛋白质抑制物来取消或破坏酶活性；通过使用基于核酸的表达抑制物，例如反义DNA和siRNA来取消或破坏酶活性；以及，通过使用转录抑制物或调节因子的表达或活性的抑制物来取消或破坏酶活性，所述调节因子控制或调节编码酶活性的基因的表达。当涉及糖蛋白制品中存在的聚糖的“摩尔百分比”时，该术语是指当蛋白质制品用PNG’ ase处理、然后通过不受糖形式组成影响的方法来定量时，所释放的连接的寡聚糖的库中存在的特定聚糖的摩尔百分比(例如，用荧光标签例如2- 氨基苯甲酰胺标记PNG’ ase释放的聚糖库，然后通过高效液相层析法或毛细管电泳分离，然后通过荧光强度定量聚糖)。例如，50摩尔百分比的NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2是指，释放的聚糖的百分之50是NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其余百分之50包含其他N-连接的寡聚糖。在实施方式中，糖蛋白的制品中特定聚糖的摩尔百分比将在20%到100%之间，优选的高于25%、30%、35%、40%或45%，更优选的高于50%、55%、60%、65%或70%，以及最优选的高于75%、80%、85%、90% 或 95%。如在此使用的，术语“主要地”或变体如“主要”或“主要的是”将被理解为意思是，在糖蛋白用PNGase处理、通过质谱法例如MALDI-TOF MS分析释放的聚糖之后，在总的聚糖中具有最高摩尔百分比(％)的聚糖种类。换句话说，用语“主要地”被定义为单个实体，例如特定的糖形式，其以比任何其他的单独实体更高的摩尔百分比存在。例如，如果组合物由 40摩尔百分比的A种类、35摩尔百分比的B种类和25摩尔百分比的C种类组成，该组合物主要地包含A种类。术语“治疗有效量”是指本发明的重组促红细胞生成素的量，其给予了为患者提供益处的血细胞比容的提高。所述量将在一个个体与另一个之间不同，将取决于许多因素，包括患者的总体身体状态以及贫血的基础病因。例如，对于患有慢性肾衰竭的患者，本发明的促红细胞生成素的治疗有效量可以基于治疗的适应症在20到300单位/kg或O. 5 μ g/kg到500 μ g/kg的范围内。术语“单位”是指用于评估促红细胞生成素组合物的活性的领域公知的单位。一毫克纯的促红细胞生成素大约相当于150，000单位。给药日程表可以是每周约三次到每四周或六周约一次。实际的日程表将取决于许多因素，包括向患者施用的促红细胞生成素的类型(ΕΡ0或聚乙二醇化的-ΕΡ0)以及各个患者的响应。更高的剂量范围一般不在贫血应用中使用，但是对于其他治疗应用是有用的。对于患者实现和建立合适的促红细胞生成素剂量的手段是本领域公知的和常规实践的。患者与患者之间给予的量和给药日程表的变化，通过与量或日程表一起地提及术语“约”来包括。用于治疗的促红细胞生成素的量给出了可接受的血细胞比容提高速率，并且将血细胞比容维持在有益的水平(例如，通常至少约30%，一般在30%到36%的范围内)。当前组合物的治疗有效量可以由本领域技术人员使用公众可获得的材料和操作来容易地确定。另外，在治疗期间可以给予患者铁来维持提高的红细胞生成。给予的量可以通过本领域技术人员通常使用的方法来容易地确定。附图的简要描述
附图IA-J显示了从野生型菌株NRRL-Yl 1430 (附
图1A)开始的、巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3159 (附图1E)和菌株YGLY7113到YGLY7122 (附图II)的家系。附图2显示了质粒pGLY6的图谱。质粒pGLY6是靶向做^座位的整合载体，含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元iScSUC2、的核酸分子，其一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母基因的5’区域(PpURA5-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母做^基因的3’区域(PpURA5-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图3显示了质粒pGLY40的图谱。质粒pGLY40是靶向OCHl座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，其侧翼是包含IacZ重复的核酸分子(hcZ重复)，随后在一侧是包含来自OCHl基因的5’区域(PpOCHl-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来 自OCHl基因的3’区域(PpOCHl-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图4显示了质粒pGLY43a的图谱。质粒pGLY43a是靶向沒座位的整合载体，含有句念乳酸克鲁维酵母UDPtV-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)转运蛋白基因或转录单元(KlGlcNAc Transp.)的核酸分子，其邻近于侧翼是包含重复的核酸分子重复)的、包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，所述邻近的基因一侧是包含来自现化 基因的5’区域(PpPBS2-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自基因的3’区域(PpPBS2-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图5显示了质粒pGLY48的图谱。质粒pGLY48是靶向座位的整合载体，含有表达盒，所述表达盒包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(MmGlcNAc Transp.)开放阅读框(ORF)的核酸分子，其在5’末端可操作地连接到包含酿酒酵母GAPDH启动子(PpGAPDH Prom)的核酸分子，和在3’末端可操作地连接到包含酿酒酵母CTC终止序列(ScCYC TT)的核酸分子，邻近于侧翼是重复重复)的、包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PpURA5)的核酸分子，其中所述表达盒整体上在一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母麗#也7基因的5’区域(PpMNN4Ll-5 ’)的核苷酸序列的核酸分子，并且在另一侧包含来自MNN4L1基因的3’区域(PpMNN4Ll-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图6显示了质粒pGLY45的图谱。质粒pGLY45是靶向PM)1/Mm4座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，其侧翼是包含hcZ重复的核酸分子QacZ重复)，随后在一侧是包含来自PNOl基因的5’区域(PpPN01-5’)的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来自基因的3’区域(PpMNN4-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图7显示了质粒pGLY247的图谱。质粒pGLY247是靶向MET16座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)的核酸分子，其侧翼是包含h cZ重复的核酸分子(h cZ重复)，随后在一侧是包含来自MT7 6基因的5’区域(PpMET16-5’)的核苷酸序列的核酸分子，在另一侧是来自基因的3’区域(PpMET16_3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图8显示了质粒pGLY248的图谱。质粒pGLY248是靶向做^座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母歷T76基因或转录单元(PpMET16)的核酸分子，其一侧是包含来自基因的5’区域(PpURA5-5’ )的核苷酸序列的核酸分子，另一侧是包含来自URA5基因的3’区域(PpURA5-3’ )的核苷酸序列的核酸分子。附图9显示了质粒pGLY582的图谱。质粒pGLY582是靶向扭分座位的整合载体，含有串联的四个表达盒，它们编码(I)酿酒酵母m)P-葡萄糖差向异构酶(2)在N-末端与酿酒酵母前导区肽(33)融合的人半乳糖基转移酶I催化结构域，
(3)侧翼是IacZ重复UacZ重复)的巴斯德毕赤氏酵母URA5基因或转录单元(PpURA5)，和
(4)黑腹果蝇(AUDP-半乳糖转运蛋白(ifeW；/1)。所有的表达盒侧面都是HISl基因的5’区域(PpHISl-5’ )和扭分基因的3’区域(PpHISl-3’)。PMAl是巴斯德毕赤氏酵母启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母/*47终止序列；似/%7是巴斯德毕赤氏酵母汾启动子，ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母OCHl启动子，PpALG12 TT是巴斯德毕赤氏酵母ALG12终止序列。附图10显示了质粒pGLY167b的图谱。质粒pGLY167b是靶向他价座位的整合载体，含有串联的三个表达盒，它们编码(I)在末端与酿酒酵母麗呢 前导区肽融合的黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域(密码子优化的)(C0-KD53)，(2)巴斯德毕赤氏酵母扭基因或转录单元，以及(3)在末端与酿酒酵母麗前导区肽融合的大鼠乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)转移酶II催化结构域(密码子优化的)(C0-TC54)。所有的表达盒侧面都是基因的5’区域(PpARGl-5’)和他价基因的3’区域(PpARGl-3’)。PpPMAl Prom是巴斯德毕赤氏酵母/*47启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母/*47终止序列；PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母似汉汾启动子，ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母况启动子；PpALG12 TT是巴斯德毕赤氏酵母ALG12终止序列。附图11显示了质粒pGLY1430的图谱。质粒pGLY1430是靶向ADEl座位、不破坏该座位表达的KINKO整合载体，含有串联的四个表达盒，它们编码(I)在末端与巴斯德毕赤 氏酵母前导区肽融合的人GlcNAc转移酶I催化结构域(密码子优化的)(C^-NAlO),(2)UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(MmTr)，(3)在末端与酿酒酵母前导区肽融合的小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域(FB) (FB8),以及(4)侧翼是重复(7acZ)的巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PPURA5)。所有的表达盒侧面都是ADEl基因的5’区域和 ORF (ADEI 5’ 和 0RF)和 ADEl 基因的 3’ 区域(PpADEl_3，)。PpPMAl prom 是巴斯德毕赤氏酵母启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母终止序列；SEC4是巴斯德毕赤氏酵母SEC4启动子；OCHl TT是巴斯德毕赤氏酵母况终止序列；ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpOCHl Prom是巴斯德毕赤氏酵母况好7启动子；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母JZ似终止序列；以及PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母GADPHB·。附图12显示了质粒pGFI165的图谱。质粒pGFI165是靶向PROl座位、不破坏该座位的表达的KINKO整合载体，含有表达盒，它们编码(I)在末端与酿酒酵母a MATpre信号肽融合的李氏木霉α -I, 2-甘露糖苷酶催化结构域(aMATTrMan)，以将嵌合蛋白靶向分泌途径并从细胞分泌；以及(2)侧翼是重复重复)的巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元。所有的表达盒侧面都是PROl基因的5’区域和ORF (5’ PROlorf)以及PROl基因的3’区域(3’ PRO)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母终止序列；以及PpGAPDH是巴斯德毕赤氏酵母GADPHB·。 附图13显示了质粒pGLY2088的图谱。质粒pGLY2088是靶向TRP2或JAT7座位的整合载体，含有编码以下的表达盒(I)在末端与酿酒酵母a MATpre信号肽(alphaMF-pre)融合以将嵌合蛋白靶向分泌途径并从细胞分泌的、密码子优化的成熟人促红细胞生成素(co-hEPO),和(2) zeocin抗性蛋白(ZeocinR)。表达盒在一端侧面是巴斯德毕赤氏酵母启动子(PpAOXl Prom)，在另一端是巴斯德毕赤氏酵母77P/C基因或转录单元(PpTRP2)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列，ScTEF Prom是酿酒酵母7SF7启动子。
附图14显示了质粒pGLY2456的图谱。质粒pGLY2456是靶向TRP2座位而不破坏座位表达的KINKO整合载体，含有编码以下的六个表达盒(I)密码子优化的小鼠CMP唾液酸转运蛋白(CO mCMP-Sia Transp)，(2)密码子优化的人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/#-乙酰甘露糖胺激酶(CO hGNE), (3)巴斯德毕赤氏酵母WPa基因或转录单元，(4)密码子优化的人CMP-唾液酸合酶(CO hCMP-NANA S)，(5)密码子优化的人乙酰神经氨酸_9_磷酸合酶(CO hSIAP S)，和(6)在末端与酿酒酵母前导肽融合的密码子优化的小鼠a-2, 6-唾液酸转移酶催化结构域(comST6-33)。所有的表达盒侧面都是TRP2基因的5’区域和ORF (PpTRP2 5’)和77P/C基因的3’区域(PpTRP2_3’)。PpPMAl prom是巴斯德毕赤氏酵母/*47启动子；PpPMAl TT是巴斯德毕赤氏酵母/*42终止序列；CYC TT是酿酒酵母CTC终止序列；PpTEF Prom是巴斯德毕赤氏酵母72F7启动子；PpTEF TT是巴斯德毕赤氏酵母TEFl终止序列；PpALG3 TT是巴斯德毕赤氏酵母也似终止序列；以及pGAP是巴斯德毕赤氏酵母似启动子。
附图15 显示了质粒 pGLY3411 (pSH1092)的图谱。质粒 pGLY3411 (pSH1092)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含侧翼是IacZ重复UacZ重复)的巴斯德毕赤氏酵母观^基因或转录单元(PpURA5)，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#/￥基因的5’核苷酸序列(PpPBS4 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#/￥基因的3’核苷酸序列(PpPBS4 3’)。附图16 显示了质粒 pGLY3430 (pSH1115)的图谱。质粒 pGLY3430 (pSH1115)是包含表达盒的整合载体，所述表达盒包含核酸分子，其编码与棉阿舒囊霉iAshbya gossypii)TEFl启动子(PTEF)和棉阿舒囊霉TEFl终止序列(TTEF)可操作连接的诺尔丝菌素抗性ORF(NAT)，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#77基因的5’核苷酸序列(PBS1 5’)，在另一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的3’核苷酸序列(PBS1 3’)。附图17 显示了质粒 pGLY4472 (pSH1186)的图谱。质粒 pGLY4472 (pSH1186)含有表达盒，所述表达盒包含核酸分子，其编码与棉阿舒囊霉TEFl启动子(pTEF)和棉阿舒囊霉TEFl终止序列(TRFtt)可操作连接的疋coli潮霉素B磷酸转移酶基因ORF (Hyg)，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的5’核苷酸序列(PpPBS3 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒基因的3’核苷酸序列(PpPBS3 3’)。附图18显示了质粒pGLY2057的图谱。质粒pGLY2057是靶向^座位的整合质粒，含有编码侧翼是重复重复)的巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元(PpURA5)的表达盒。所述表达盒一侧是包含来自基因的5’区域的核苷酸序列的核酸分子(PPADE2-5’)，另一侧是包含来自泛基因的3’区域的核苷酸序列的核酸分子(PpADE2-3，)。附图19显示了质粒pGLY2680的图谱。质粒pGLY2680是可以靶向TRP2iA0Xl座位的整合载体，含有编码以下的表达盒(I)在末端与鸡溶菌酶信号肽(鸡溶菌酶ss)融合的、密码子优化的人成熟促红细胞生成素(co-hEPO)，和(2)没有启动子的巴斯德毕赤氏酵母^基因(PpADE2)。表达盒在一端侧面是巴斯德毕赤氏酵母启动子(PpAOXlProm)，在另一端是巴斯德毕赤氏酵母7 基因或转录单元(PpTRP2)。ScCYC TT是酿酒酵母CTC终止序列。附图20显示了质粒pGLY2713的图谱。质粒pGLY2713是含有邻近于表达盒的巴斯德毕赤氏酵母/W见ORF (PpPNOl 0RF)的整合载体，所述表达盒包含侧翼是重复QacZ重复)的巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(PpURA5)，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母/ 基因的5’核苷酸序列(PpPEP4 5’)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母/ 基因的3’核苷酸序列(PpPEP4 3’)。附图21显示了说明发酵过程流程的示意图。附图22显示了在菌株YGLY3159中产生的rhEPO具有与抗HCA抗体的交叉结合活性。左侧画面显示了 Commassie Blue染色的4_20% SDS-PAGE凝胶，显示了 rhEPO的位置，右侧画面显示了用1:3，OOO稀释度的兔抗-HCA抗体(SL rProA纯化的兔9161)探测的类似凝胶的Western印迹。结合抗-HCA抗体使用PBS中1:5，000稀释度的、与辣根过氧化酶(HRP)轭合的山羊抗兔抗体来检测。结合的二级抗体的检测使用底物3’ 3 二氨基联苯胺(DAB)0附图23显示了当rhEPO使用PNAGase F脱糖基化时，在菌株YGLY3159中生产的rhEPO对抗-HCA抗体的交叉结合活性不被检测出。左侧画面显示了 Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶，显示了糖基化的和脱糖基化形式的rhEPO的位置，右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。附图24显示了野生型巴斯德毕赤氏酵母中以及糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母GS2. O菌株中生产的重组抗体(rhlgG)显示了与抗-HCA抗体的交叉结合活性，在所述巴斯德毕赤氏酵母GS2. O菌株中沒基因被破坏或删除。左侧画面显示了 Commassie Blue染 色的4-20% SDS-PAGE凝胶，右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。GS 2. O是产生主要具有Man5GlcNAc2N-聚糖的糖蛋白的巴斯德毕赤氏酵母菌株。显示的GS 2. O菌株产生具有约5% Man9GlcNAc2N-聚糖的rhlgG。WT是野生型巴斯德毕赤氏酵母。附图25比较了菌株YGLY3159中生产的rhEPO与其他含有复杂糖基化模式、但不是在巴斯德毕赤氏酵母中生产的糖基化蛋白质与抗-HCA抗体的交叉结合活性。上部画面显示了 Commassie Blue染色的4_20% SDS-PAGE凝胶，显示了在巴斯德毕赤氏酵母中产生的糖基化以及脱糖基化形式的rhEPO的位置，以及在酿酒酵母中产生的重组人胎球蛋白、去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin)(除去了末端唾液酸残基的人胎球蛋白)、人血清白蛋白(HSA)和重组LEUKINE的位置，下部画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。S30S库是通过阳离子交换层析纯化的rhEPO。附图26显示了在菌株YGLY3159中生产、以及通过羟磷灰石层析纯化的的rhEPO仍然具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。左侧画面显示了层析洗脱库1、2和3的Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶,显示了 rhEPO (还原的或非还原的)的位置，右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。在画面下方显示了库1、2和3中聚糖的HPLC分析的结果。附图27A显示了来自羟磷灰石库I的在菌株YGLY3159中产生的rhEPO的QSEPHAR0SE FF阴离子层析纯化的层析谱。附图27B显示了夹心ELISA，显示了含有来自Q SEPHAR0SE FF阴离子层析的rhEPO的Q SEPHAR0SE FF库没有与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性，而流通物含有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。捕获抗体是抗-hEPO抗体，用在PBS中1:800起始稀释度下的兔抗-HCA抗体检测交叉结合活性，所述稀释物然后在PBS中I :1连续稀释一排结束于第11个反应孔1:819，200稀释度(反应孔12 :阴性对照)。结合的抗-HCA抗体使用PBS中1:10, 000稀释度的、与碱性磷酸酶(AP)轭合的山羊抗兔抗体来检测。结合的二级抗体的检测使用底物4-甲基伞形酮酰磷酸(4-MUPS)。附图28 显示了在菌株 YGLY6661 ( Zl bmt2、Δ bmt4 和 Zl bmtl)和 YGLY7013 ( Zl bmt2和Z中产生、通过BlueSEPHAROSE 6 FF层析(Blue库)捕获的的rhEPO仍然具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。左侧画面显示了有(+ )和没有(_)PNGase F处理的Blue库的Commassie蓝染色的4-20% SDS-PAGE凝胶。中央画面显示了用1: 1，000稀释度与HRP轭合的抗-hEPO抗体探测的、DAB作为底物的相似凝胶的Western印迹。右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。附图29在检测与抗-HCA抗体交叉结合活性的夹心ELISA中显示了在菌株YGLY6661 i A bmt2、A bmt4 取 Zl 加 (7 )和 YGLY7013 ( Zl 加 泛和 Zl 加 《)中产生、通过 BlueSEPHAR0SE 6 FF 层析捕获的(Blue库)rhEPO仍然具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。ELISA如附图27B中的进行。附图30显示了夹心￡1154，用于检测在菌株￥61^6661(/1加 泛、/1加 4和Abmtl)以及YGLY7013(zl/w泛和中产生的、通过Blue SEPHAR0SE 6 FF层析捕获的、通过羟磷灰石层析纯化的(HA库I)的rhEPO与抗-HCA抗体的交叉结合活性。来自菌株YGLY6661的HA库I中的rhEPO没有与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性。ELISA如附图27B中的进行。附图31显示了在菌株YGLY6661 QA bmt2、A bmt4热Zl/otU )中产生的、通过BlueSEPHAR0SE 6 FF层析捕获的(Blue库)rhEPO仍然具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。左侧画面显示了有(+ )和没有(_) PNGase F处理的Blue库的Commassie Blue染色的4-20%SDS-PAGE凝胶。中间画面显示了用1: 1，000稀释度下与HRP轭合的抗-hEPO抗体探测的、DAB作为底物的类似凝胶的Western印迹。右侧画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。附图32A 显示了从菌株 YGLY7361-7366 (全为 Zl bmt2、A bmt4、A bmtl 和 Zl bmt3)制备的、有(+ )和没有(_) PNGase F处理的Blue Sepaharose 6 FF捕获库(Blue库)的Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶。菌株在500 mL SixFors发酵器中生长。附图32B 显示了从菌株 YGLY7393-7398 (全为 Zl bmt2、A bmt4、A bmtl 和 Zl bmt3)制备的、有(+ )和没有(_) PNGase F处理的Blue Sepaharose 6 FF捕获库(Blue库)的Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶。菌株在500 mL SixFors发酵器中生长。附图33显示了夹心ELISA的结果，其用于检测在菌株YGLY7361-7366 (全为Zl bmt2、A bmt4、A bmtl 和 Zl bmt3)以及 YGLY7393-7398 (全为 Zl bmt2、A bmt4、A bmtl 和Zl中产生的、通过Blue SEPHAROSE 6 FF层析捕获的(Blue库)rhEPO与抗-HCA抗体的交叉结合活性。仅来自菌株YGLY7363和YGLY7365的Blue库中的rhEPO具有与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性。ELISA如附图27B中的进行。附图34以图表形式显示了在从菌株YGLY7361-7366和YGLY7393-7398 (全为A bmt2、A bmt4、A bmtl和/I Zot(J)制备的Blue库中rhEPO上Ar-聚糖的HPLC分析的结果。“双”是指在双分枝聚糖的两个臂上都被唾液酸化的聚糖。“单”是指在双分枝聚糖的仅一条臂上被唾液酸化的聚糖。“中性的”是指不被唾液酸化的聚糖。附图35A 显示了从菌株 YGLY7362、YGLY7366、YGLY7396 和 YGLY7398(全为 Zl bmt2、A bmt4、A bmtl 琳 A bmt3) \)丄及( Zl 加 泛)制备的 Blue SEPHAROSE 6 FF 层析(Blue库)和轻磷灰石纯化库(HA库I)的Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶。附图35B 显示了从菌株 YGLY7362、YGLY7366、YGLY7396 和 YGLY7398(全为 Zl bmt2、A bmt4、A bmtl和Zl bmt3孤R YGLY3159( Zl加 泛)制备的并如附图22中用抗-HCA抗体探测的、Blue SEPHAROSE 6 FF层析(Blue库)和羟磷灰石纯化库(HA库I)的4-20% SDS-PAGE凝胶的Western印迹。附图36 显示了在菌株 YGLY7398 ( Zl bmt2、Δ bmt4、Δ bmtl 和 Zl bmt3)中生产的、用Blue SEPHAROSE 6 FF层析捕获的(Blue库)和通过羟磷灰石层析纯化的(HA库I )rhEP0没有与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性。左侧画面显示了与从菌株YGLY3159制备的rhEPO相比，从菌株YGLY7398制备的Blue库和HA库I的Commassie Blue染色的4-20%SDS-PAGE凝胶。中间画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹。中间画面显示了如附图22中用抗-HCA抗体探测的类似凝胶的Western印迹，只是抗-HCA抗体来自另一种抗体制品(1:2，000的GiF多克隆兔6316)。附图37显示了夹心ELISA的结果，用于检测菌株￥61^7113_7122( Zl bmt2、Δ bmt4、 和zl/OTiJ)中生产的以及通过Blue SEPHAROSE 6 FF层析捕获的(Blue库)rhEPO与
抗-HCA抗体的交叉结合活性。菌株YGLY7118显示了与抗-HCA抗体的非常低的可检测的交叉结合活性。其他菌株都没有显示任何与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性。ELISA如附图27B中的进行。附图38以图表形式显示了在从菌株YGLY7113_7122(全为Λ bmt2、Δ bmt4、Δ bmtl和Z制备的Blue库中的rhEPO上聚糖的HPLC分析结果。“双”是指在双分枝N-聚糖的两个臂上都被唾液酸化的聚糖。“单”是指在双分枝聚糖的仅一条臂上被唾液酸化的聚糖。“中性的”是指不被唾液酸化的聚糖。附图39A 显示了从菌株 YGLY7115、YGLY7117、YGLY7394、YGLY7395 和 YGLY7120(全为 Abmt2、Abmt4、Zl和 Zl ZwiJ)和 YGLY3159 ( Zl 加 泛)制备的 Blue SEPHAROSE 6FF层析(Blue库)和轻憐灰石纯化库(HA库I)的Commassie Blue染色的4-20% SDS-PAGE凝胶。附图39B 显示了从菌株 YGLY7115、YGLY7117、YGLY7394、YGLY7395 和 YGLY7120(全为 Zl bmt2、Δ bmt4、Δ bmtl 和 Zl bmt3)以及 YGLY3159 ( Zl bmt2)制备的并如附图 22 中用抗-HCA抗体探测的、Blue SEPHAROSE 6 FF层析(Blue库)和羟磷灰石纯化库(HA库I)的
4-20% SDS-PAGE 凝胶的 Western 印迹。附图40A显示了 YGLY3159(Z/ 泛)产生的以及通过羟磷灰石柱层析纯化的rhEPO的N-聚糖的HPLC痕迹(S卩，HA库I的分析)。附图40B 显示了 YGLY7117 ( Zl bmt2、Δ bmt4、Δ bmtl 和 Zl bmt3)中产生的已经通过羟磷灰石柱层析纯化的rhEPO的N-聚糖的HPLC痕迹(S卩，HA库I的分析)。发明的详细说明
本发明提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产蛋白质和糖蛋白的方法，所述蛋白质和糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。宿主细胞抗原还可以包括可能被重组蛋白质组合物带出的残余的宿主细胞蛋白质和细胞壁污染物，它们可能是免疫原性的，可以改变治疗蛋白质的治疗效力或安全性。与针对宿主细胞抗原制得的抗体具有交叉反应性的组合物是指该组合物含有某些污染的宿主细胞材料，通常是具有磷酸甘露糖残基或β_甘露糖残基等等的聚糖。巴斯德毕赤氏酵母的野
生型菌株将产生具有这些N-聚糖结构的糖蛋白。针对总宿主细胞蛋白质制得的抗体制品预计将包括针对这些结构的抗体。然而，不含有N-聚糖的蛋白质可能同时包括与针对宿主细胞制得的抗体交叉反应的污染物质(蛋白质等)。所述方法和宿主细胞允许产生重组治疗蛋白质和糖蛋白，与此处公开的未修饰的菌株中生产的相比，其在施用所述重组治疗蛋白质和糖蛋白的个体中具有引发不良反应的降低的风险。不良反应包括在个体中引发不希望的免疫反应，或与个体中的位点不希望的或不适当的结合、在其中聚集、或与之相互作用，其一般不利地影响个体的健康。在施用所述治疗蛋白质或糖蛋白的个体中引发不良反应的风险，对于要长期施用给个体的蛋白质或糖蛋白是特别关注的(例如，意图在延长的时间期上进行的治疗)。根据此处的方法生产的重组治疗蛋白质或糖蛋白没有与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性，因而，具有在施用所述重组蛋白质或糖蛋白的个体中引发不良反应的降低的风险。所述方法和宿主细胞对于生产具有结合清除因子的更低可能性的重组蛋白质或糖蛋白也是有用的。发明人发现，在巴斯德毕赤氏酵母的某些菌株中生产的特定糖蛋白可能具有在其上的或聚糖，其中上面的一个或更多个甘露糖残基是处于￠1,2-连键中。用于治疗用途的并且上面具有一个或更多个P 1，2-连接的甘露糖残基的糖蛋白提供了在施用该糖蛋白的个体中引发不希望的免疫反应的风险。这些￠-连接的甘露糖残基可以使用针对总宿主细胞抗原制得的抗体来检测。由于不能预测哪些治疗糖蛋白将具有包含一个或更多个^ 1，2-连接的甘露糖残基的N-或0-聚糖，以及确实具有上面包含P I, 2-连接的甘露糖残基的或聚糖的治疗糖蛋白是否将在接受该糖蛋白的个体中产生不希望的免疫原性反应，期望的是在巴斯德毕赤氏酵母菌株中产生治疗性糖蛋白，所述菌株已经被遗传工程化以缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合。这样的菌株可以通过删除或破坏巴斯德毕赤氏酵母￠-甘露糖基转移酶(A#r)基因家族中的四种已知的￠-甘露糖基转移酶QBmtV)中的至少三种的活性来产生。如在此显示的，包括至少三种这些及砂基因的删除或破坏的巴斯德毕赤氏酵母菌株提供了可以产生蛋白质或糖蛋白的巴斯德毕赤氏酵母菌株，所述蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合。这些菌株在生产治疗蛋白质和糖蛋白中是有用的。已经展现了和/或0-聚糖上￠-甘露糖结构的存在引发免疫反应。巴斯德毕赤氏酵母和白色念珠菌中￠-甘露糖基转移酶基因的鉴定已经在美国专利 No. 7，465，577 和 Mille et al. , J. Biol. Chem. 283 :9724-9736 (2008)中报道了，其公开了 ￠-甘露糖基化受到被称为AMR2或的￠-甘露糖基转移酶的影响，巴斯德毕赤氏酵母中该基因的破坏或删除产生了能够生产具有降低的￠-甘露糖基化的糖蛋白的重组宿主。该专利还公开了基因的三种同源物，沒#77、沒#7^和沒#7￥。然而，当研究某些糖蛋白制品与针对宿主细胞抗原制得的抗体的交叉结合活性的来源时，发明人发现，交叉结合活性是已经破坏或删除了基因的重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞的某些菌株中存留的残余￠-甘露糖基化的结果。因而，这些重组宿主细胞中产生的异源糖蛋白具有仍然含￠-甘露糖残基的N-聚糖。这些￠-甘露糖残基在获自这些重组宿主细胞的培养物的异源糖蛋白的ELISA和Western印迹中用针对宿主细胞抗原(HCA)制得的抗体是可检测的。抗-HCA抗体是针对野生型巴斯德毕赤氏酵母菌株或NORF菌株产生的多克隆抗体， NORF菌株是以与生产异源糖蛋白的重组宿主细胞相同方式构建的重组宿主细胞，只是编码异源蛋白质的开放阅读框(ORF)被省略了。对于在巴斯德毕赤氏酵母中产生的治疗性糖蛋白，这些残余的￠-甘露糖残基代表了在疾病或病症的治疗中接受该治疗蛋白质的某些个体中引发免疫反应的风险。本发明提供了在巴斯德毕赤氏酵母中生产糖蛋白的方法，所述糖蛋白不含有任何可检测的β-甘露糖基化并且因而不与针对宿主细胞抗原制得的抗体交叉结合。BMTl、ΒΤ2和ΒΜΤ3展现了高度的序列同源性，而ΒΜΤ4是较低程度上同源的，被认为是帽化α-甘露糖基转移酶。然而，家族的所有四个成员看起来涉及具有连接的甘露糖结构的N-和/或O-聚糖的合成。虽然来自删除ΒΜΤ2基因的巴斯德毕赤氏酵母菌株中产生的测试蛋白质的聚糖的MALDI-T0F可能未能检测出β -甘露糖基化，在此基于敏感抗体的分析能够检出」泛菌株中的甘露糖基化。因而，在此教导的基于抗-HCA抗体的检测方法显示了 ,BMTl和ΒΜΤ3基因以及任选的ΒΜΤ4基因的同时的删除或破坏是除去所有可检测的β_甘露糖结构所需的。编码三种β_甘露糖基转移酶的基因的删除或破坏可以通过以下实现(I)基因(包括启动子序列、开放阅读框(ORF)和/或转录终止序列)的完全或部分敲除；(2) ORF中阅读框移位的引入；(3)启动子的失活或调节；(4)通过SiRNA或反义RNA的信息敲低；(5)或使用化学抑制物。结果是产生能够生产缺乏与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性的糖蛋白的宿主细胞。为了例示生产缺乏与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性的糖蛋白的方法，已经被遗传地工程化以缺乏ΒΜΤ2表达或活性、并能够产生具有唾液酸终止的双分枝N-聚糖的重组成熟的人促红细胞生成素(EPO)的巴斯德毕赤氏酵母的菌株，被进一步遗传工程化来缺乏谷#/7和/或谷和/或谷#7￥基因的表达。其中仅谷#7^基因的表达被破坏的菌株产生了具有与抗-HCA抗体的一定可检测的交叉结合活性的重组成熟人ΕΡ0。由于EPO分子上β_连接的甘露糖残基的存在发现了可检测的交叉结合活性(参见附图22-27Β，实施例
6)。当编码m/Π热BMT4的基因在菌株中被破坏或删除时，产生的EPO仍然具有与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性(参见附图28-31)。■，刍丽1、丽2、BMT3取BMT4基因被破坏或删除时，大部分菌株产生了糖基化的重组人ΕΡ0，其缺乏与抗-HCA抗体的可检测的交叉结合活性，因而缺乏可检测的β -甘露糖残基(例如参见附图33和35Β)。因而，本发明进一步提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法涉及构建预期用于生产所述重组蛋白质的宿主细胞以进一步不与显示各种组合的β-甘露糖基转移酶活性。例如，宿主细胞被构建，其不显示对于聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性。缺乏显示β_甘露糖基转移酶2活性的宿主细胞用于生产所述重组蛋白质或糖蛋白，其然后利用针对菌株的NORF版本制备的抗体、通过Western印迹或ELISA来评估。NORF菌株是与宿主菌株相同的菌株，只是它缺乏编码重组糖蛋白的开放阅读框。如果通过所述宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体可检测的结合，则宿主细胞对于生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白是有用的。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则宿主细胞被进一步操纵以不显示对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶I、β -甘露糖基转移酶3或β -甘露糖基转移酶4活性。例如，缺乏β_甘露糖基转移酶2活性的宿主细胞被进一步操纵以缺乏β_甘露糖基转移酶I活性。所述宿主细胞被用于生产重组蛋白质或糖蛋白，其然后使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估。如果通过所述宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体可检测的结合，则宿主细胞对于生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白是有用的。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则宿主细胞被进一步操纵以不展示&-甘露糖基转移酶3活性或P-甘露糖基转移酶4活性。例如，缺乏P-甘露糖基转移酶2活性和P -甘露糖基转移酶I活性的宿主细胞被进一步操纵以缺乏对于聚糖或O-聚糖的3-甘露糖基转移酶3活性。所述宿主细胞被用于生产蛋白质或重组糖蛋白，其然后使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估。如果通过所述宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体可检测的结合，则宿主细胞对于生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体缺乏交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白是有用的。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则菌株被进一步操纵以不展现对于 聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶4活性。宿主细胞被用于生产重组蛋白质或糖蛋
白，其然后使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估，以确 认重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测结合。通过进一步的实例，构建了巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中不同组合的BMT基因被删除或破坏。例如，构建巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其具有沒基因的破坏或删除。J如泛宿主细胞被用于生产重组蛋白质或糖蛋白，其然后使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估。NORF菌株是与宿主菌株相同的菌株，只是它缺乏编码重组糖蛋白的开放阅读框。如果通过所述宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体可检测的结合，则删除或破坏足以允许宿主细胞生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则宿主细胞被进一步操纵以具有沒#/7、沒#7^ *BMT4基因的删除。例如，具有BMT2基因的破坏或删除的宿主细胞被进一步操纵以具有BMTl基因的删除或破坏。Abmt2Abmtl宿主细胞被用于生产重组蛋白质或糖蛋白，其然后通过使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估。如果Z bmt2A bmtl宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的结合，则沒#77和沒删除或破坏足以允许宿主细胞产生缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则宿主细胞被进一步操纵以具有或沒#/￥基因的删除。例如，具有沒#77和沒基因的破坏或删除的宿主细胞被进一步操纵以具有沒基因的删除或破坏。」bmt2A bmtlAbmt3宿主细胞被用于生产蛋白质或重组糖蛋白，其然后通过使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估。如果z宿主细胞产生的重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的结合，则BMTl、BMT2和谷删除或破坏足以允许宿主细胞产生缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性的重组蛋白质或糖蛋白。然而，如果检测到可检测的交叉结合活性，则宿主细胞被进一步操纵以具有沒#7￥基因的删除。」bmt2A bmtl Abmt3A bmt4宿主细胞被用于生产重组蛋白质或糖蛋白，其然后使用针对菌株的NORF版本制得的抗体通过Western印迹或ELISA来评估，以确认重组蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测结合。本发明进一步提供了重组甲基营养型酵母宿主细胞例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中所述宿主细胞不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性，不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶I活性或β -甘露糖基转移酶3活性的至少一种，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的方面中，本发明提供了重组宿主细胞，其不展现对于聚糖或聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性、β -甘露糖基转移酶3活性和β -甘露糖基转移酶4活性，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。本发明进一步提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，包括提供重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2 活性，不展现对于聚糖或O-聚糖的选自β -甘露糖基转移酶I活性和β_甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞缺乏对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β -甘露糖基转移酶3活性。在进一步的方面中，本发明提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性、β -甘露糖基转移酶3活性和β -甘露糖基转移酶4活性，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。本发明进一步提供了重组甲基营养型酵母宿主细胞例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中编码对于聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性的基因已经被删除或破坏，编码对于聚糖或O-聚糖的β_甘露糖基转移酶I活性或β_甘露糖基转移酶3活性的至少一种基因已经被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，编码对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β -甘露糖基转移酶I活性和β_甘露糖基转移酶3活性的基因已经被删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了重组宿主细胞，编码对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性、β-甘露糖基转移酶I活性、β -甘露糖基转移酶3活性和β-甘露糖基转移酶4活性的基因被删除或破坏，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。本发明进一步提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中编码对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶2活性的基因被删除或破坏，以及编码选自对于聚糖或O-聚糖的β -甘露糖基转移酶I活性和3-甘露糖基转移酶3活性的活性的至少一种基因被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及 从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。在进一步的实施方式中，编码对于聚糖或&聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性、^-甘露糖基转移酶I活性和P-甘露糖基转移酶3活性的基因被删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中编码对于聚糖或聚糖的@ -甘露糖基转移酶2活性、P -甘露糖基转移酶I活性、P -甘露糖基转移酶3活性和@ -甘露糖基转移酶4活性的基因被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。本发明进一步提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中沒基因与沒#77基因和基因的至少一个被删除或破坏，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，基因、基因和基因被删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中BMTl基因、沒基因、沒基因和基因被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。本发明进一步提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中BMT2基因与现/77基因和沒基因的至少一个被删除或破坏，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。在进一步的实施方式中，基因、S#77基因和基因被删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了生产重组蛋白质或糖蛋白的一般方法，所述重组蛋白质或糖蛋白缺乏与抗宿主细胞抗原抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中沒#/7基因、沒基因、沒基因和BMT4基因被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子；在对表达所述重组蛋白质或糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基中回收所述重组蛋白质或糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的所述重组蛋白质或糖蛋白。本发明进一步提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中沒基因与沒#77基因和基因的至少一个被删除或破坏，并且其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。在进一步的实施方式中，基因、基因和基因被删除或破坏。在进一步的方面中，本发明提供了重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其中BMTl基因、沒基因、沒基因和基因被删除或破坏，以及其包括编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子。一般地所述重组蛋白质或糖蛋白是治疗性糖蛋白。期待的治疗性糖蛋白的实例包括但不限于促红细胞生成素(EPO);细胞因子，例如干扰素α、干扰素β、干扰素Y和干扰素ω ;以及粒细胞-集落刺激因子(GCSF) ;GM-CSF;凝血因子，例如因子VIII、因子IX和人蛋白质C ;抗凝血酶III ;凝血酶；可溶的IgE受体α -链；免疫球蛋白，例如IgG、IgG片段、IgG融合物和IgM ;免疫粘附素和其他Fe融合蛋白，例如可溶的TNF受体-Fe融合蛋白；RAGE-Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；胃促胰酶；和脲胰蛋白酶抑制物；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；annexin V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子_2 ；骨髓祖代抑制因子-I ;护骨素(osteoprotegerin) ； α -I-抗胰蛋白酶；a -feto蛋白质；DNase II ;人血纤蛋白溶解酶原的kringle 3 ;葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白I ;促滤泡激素；细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 - Ig ;跨膜激活物和韩调节物和亲环蛋白(cyclophilin)配体；胰高血糖素样蛋白I ;和IL-2受体激动剂。 在本发明的特定的方面中，编码重组蛋白质或糖蛋白的核酸分子是密码子优化的，以增强宿主细胞中所述重组蛋白质或糖蛋白的表达。例如，如实施例中所示，编码人促红细胞生成素的成熟形式的核酸分子被密码子优化，为了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母菌株中增强的表达，所述酵母已经被遗传工程化以产生包含双分枝聚糖的促红细胞生成素变体，其中主要的糖形式包含两个都被末端唾液酸化的分枝。本发明进一步提供了包含一种或更多种蛋白质或糖蛋白的组合物，所述蛋白质或糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性，所述宿主细胞抗原是使用此处的方法以及在此处描述的宿主细胞中产生的。所述组合物可以进一步包括药学上可接受的载体和盐。适合的宿主细胞包括任何下述宿主细胞，其包含巴斯德毕赤氏酵母沒#/7、BMT2.BMT3和/ iBMT4基因的同源物。当前，这样的宿主细胞的实例包括白色念珠菌和甲基营养型酵母巴斯德毕赤氏酵母。因而，在本发明的特别的方面中，宿主细胞是甲基营养型酵母，例如巴斯德毕赤氏酵母，以及其突变体和其遗传工程化的变体。期待用于本发明的甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母可以被遗传地修饰，从而它们表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的或人源化的。照这样，可以生产糖蛋白组合物，其中特定的期望糖形式在组合物中是主要的。如US2004/0018590中描述的，这可以通过消除选定的内源糖基化酶、和/或遗传工程化宿主细胞、和/或提供外源的酶以模拟全部或部分哺乳动物糖基化途径来实现。如果希望，可以进行糖基化的其他遗传工程化，从而可以有或者没有核心岩藻糖基化地产生糖蛋白。低等真核宿主细胞的使用是进一步有益的，在于这些细胞能够产生高度同质的糖蛋白组合物，从而糖蛋白的主要糖形式可以在组合物的糖蛋白中以大于三十摩尔百分比存在。在特别的方面中，主要糖形式可以以组合物中存在的糖蛋白的大于四十摩尔百分比、五十摩尔百分比、六十摩尔百分比、七十摩尔百分比，以及最优选的大于八十摩尔百分比存在。这可以如Gerngross等，美国专利No. 7，029，872和美国专利No. 7，449，308所描述的通过消除选定的内源糖基化酶和/或提供外源的酶来实现。例如，可以选择或工程化宿主细胞来耗尽1，6-甘露糖基转移酶活性，不然其将在糖蛋白的
聚糖上添加甘露糖残基。在一个实施方式中，宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的α 1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向信号肽通常不与所述催化结构域相连，并且被选择以将α ，2-甘露糖苷酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如，主要包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利No. 7，029, 872、美国专利No.7,449，308和美国公开的专利申请No. 2005/0170452公开了能够生产包含Man5GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。在进一步的实施方式中，紧接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的乙酰葡糖氨基转移酶KGlcNAc转移酶I或GnT I)催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将GlcNAc转移酶I活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAcMan5GlCNAC2糖形式的重组糖蛋白，例如，主要包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利No. 7，029，872、美国专利No. 7，449，308和美国公开的专利申请No. 2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAcMan5GlCNAC2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞中生产的糖蛋白可以用氨基己糖苷酶体外处理，来产生包含Man5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，紧接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽 融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选 择以将甘露糖苷酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAcMan3GlCNAC2糖形式的重组糖蛋白，例如，主要包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。美国专利No. 7，029，872和美国公开的专利申请No. 2004/0230042公开了表达甘露糖苷酶II酶、并且能够生产主要具有GlcNAc2Man3GlCNAC2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞中生产的糖蛋白可以用氨基己糖苷酶体外处理，来产生包含Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，紧接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的乙酰葡糖氨基转移酶II (GlcNAc转移酶II或GnT II)催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将GlcNAc转移酶II活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含GlcNAc2Man3GlCNAC2糖形式的重组糖蛋白，例如,主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白组合物。例如，美国专利No. 7，029, 872和美国公开的专利申请No. 2004/0018590和2005/0170452公开了能够生产包含GlcNAC2Man3GlCNAC2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞中生产的糖蛋白可以用氨基己糖苷酶体外处理，来产生包含Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，紧接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的 ER 或高尔基体产生了包含 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 或 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，或其混合物，例如，主要包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白组合物。美国专利No. 7，029，872和美国公开的专利申请No. 2006/0040353公开了能够生产包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。上述细胞中生产的糖蛋白可以用半乳糖苷酶体外处理，来产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白，例如主要包含GlcNAc2Man3GlCNAC2糖形式的重组糖蛋白组合物。在进一步的实施方式中，紧接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了主要包含NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或其混合物的重组糖蛋白。对于低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌，有用的是所述宿主细胞进一步包括提供CMP-唾液酸用于向聚糖转移的手段。美国公开的专利申请No. 2005/0260729公开了遗传工程化低等真核生物以具有CMP-唾液酸合成途径的方法，美国公开的专利申请No. 2006/0286637公开了遗传工程化低等真核生物来生产唾液酸化的糖蛋白的方法。上述细胞中生产的糖蛋白可以用神经氨酸酶体外处理，来产生主要包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形式或GalGlcNAc2Man3GlcNAc 2糖形式或其混合物的重组糖蛋白。前述宿主细胞的任一种可以进一步包括选自由GnT III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX构成的组的一种或更多种GIcNAc转移酶，以生产具有二分的(GnT III)和/或多触角的(GnT IV、V、VI和IX)的聚糖结构的糖蛋白，例如在美国公开的专利申请No.2004/074458 和 2007/0037248 中公开的。在进一步的实施方式中，产生主要具有GlcNAcMan5GlCNAC2N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将半乳糖基转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了主要包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。在进一步的实施方式中，产生主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2N_聚糖的糖蛋白的直接地前述的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域，所述信号肽通常不与该催化结构域相连，并且被选择以将唾液酸转移酶活性靶向宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白穿过宿主细胞的ER或高尔基体产生了包含NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖形式的重组糖蛋白。在进一步的方面中，前述宿主细胞的任一项，所述宿主细胞进一步被修饰以包括岩藻糖基转移酶，以及产生岩藻糖并转运岩藻糖进入ER或高尔基体的途径。修饰巴斯德毕赤氏酵母以使得它能够生产其中一个或更多个聚糖被岩藻糖基化的糖蛋白的方法的实例在PCT国际申请NO. PCT/US2008/002787中公开了。在本发明的特别的方面中，巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞被进一步修饰以包括岩藻糖基化途径，其包含⑶P-甘露糖_4，6-脱水酶、⑶P-酮基-脱氧-甘露糖-差向异构酶/OTP-酮基-脱氧-半乳糖-还原酶、⑶P-岩藻糖转运蛋白和岩藻糖基转移酶。在特定的方面中，所述岩藻糖基转移酶选自由岩藻糖基转移酶构成的组，所述岩藻糖基转移酶选自由α 1，2-岩藻糖基转移酶、α I, 3_岩藻糖基转移酶、α 1，4-岩藻糖基转移酶和α 1，6-岩藻糖基转移酶构成的组。各种前述宿主细胞进一步包括一种或更多种糖类转运蛋白，例如UDP-GlcNAc转运蛋白(例如，乳酸克鲁维酵母和小家鼠(量/5· musculus) UDP-转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如，果蚬melanogaster) UDP-半乳糖转运蛋白)和CPM-唾液酸转运蛋白(例如，人类唾液酸转运蛋白)。由于低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌缺乏上述转运蛋白，优选的是低等真核生物宿主细胞例如酵母和丝状真菌被遗传工程化以包括上述转运蛋白。
宿主细胞进一步包括巴斯德毕赤氏酵母，其被遗传工程化以消除具有磷酸甘露糖残基的糖蛋白，通过删除或破坏磷酸甘露糖基转移酶基因/W(97和(参见，例如，美国专利No. 7，198，921和7，259，007)之一或两者，其在进一步的方面中还可以包括删除或破坏基因。破坏包括破坏编码特定酶的开放阅读框，或破坏开放阅读框的表达，或利用干扰RNA、反义RNA等取消编码一种或更多种3 -甘露糖基转移酶和/或磷酸甘露糖基转移酶的RNA的翻译。宿主细胞可以进一步包括被修饰以产生特定聚糖结构的前述宿主细胞的任一种。宿主细胞进一步包括低等真核生物细胞(例如，酵母，例如巴斯德毕赤氏酵母)，其被遗传修饰以控制糖蛋白的糖基化，通过删除或破坏一种或更多种蛋白质0-甘露糖基转移酶(Dol-P-Man:Protein (Ser/Thr)甘露糖基转移酶基因)(PMTs)(参见美国专利No.5，714，377)，或在存在Pmtp抑制物和/或a -甘露糖苷酶的情况下生长，如在公开的国际申请No. WO 2007061631中公开的，或这两者。破坏包括破坏编码Pmtp的开放阅读框，或破坏开放阅读框的表达，或利用干扰RNA、反义RNA等取消编码一种或更多种Pmtps的RNA的翻译。宿主细胞可以进一步包括被修饰以产生特定聚糖结构的前述宿主细胞的任一种。Pmtp抑制物包括但不限于苯亚甲基噻唑烷二酮。可以使用的苯亚甲基噻唑烷二酮的实例有5-[ [ 3，4-二 (苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；5-[[3-(I-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸；和5-[ [ 3- (I-苯基-2-羟基)乙氧基)-4- (2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸。在特定的实施方式中，至少一种内源的PMT基因的功能或表达被降低、破坏或删除。例如，在特定的实施方式中，选自由PMT1、PMT2、PMT3和PMT4基因构成的组的至少一种内源的PMT基因的功能或表达被降低、破坏或删除；或宿主细胞在存在一种或更多种PMT抑制物的情况下培养。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞包括一种或更多种PMT基因删除或破坏，以及所述宿主细胞在存在一种或更多种Pmtp抑制物的情况下培养。在这些实施方式的特定方面中，所述宿主细胞还表达分泌的a -I, 2-甘露糖苷酶。/Wf删除或破坏和/或Pmtp抑制物通过降低0-糖基化占用来控制0-糖基化；也就是通过降低被糖基化的糖蛋白上糖基化位点的总数量。细胞分泌的a-1，2-甘露糖酶的进一步添加通过降低糖蛋白上聚糖的甘露糖链长度来控制0-糖基化。因而，与分泌的a - 1，2-甘露糖苷酶的表达组合PMT删除或破坏和/或Pmtp抑制物通过降低占用和链长度控制0-糖基化。在特别的情况下，PMT删除或破坏、Pmtp抑制物以及a -I, 2_甘露糖苷酶的特定组合经验性地确定，因为特定的异源糖蛋白(例如抗体)可能以不同的效率程度表达和通过高尔基体转运，因而可能需要PMT删除或破坏、Pmtp抑制物以及a -I, 2_甘露糖苷酶的特定组合。在另一个方面，编码一种或更多种内源的甘露糖基转移酶的基因被删除。这种删除可以与提高分泌的a-1，2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制物组合，或可以代替提供分泌的a -I, 2-甘露糖苷酶和/或PMT抑制物。因而，0-糖基化的控制对于在此处公开的宿主细胞中以更好的总产量生产特定糖蛋白，以及在正确组装的糖蛋白的产率方面是有用的。糖基化的降低或消除看起来对于糖蛋白例如完整抗体的组装和转运具有有益的效果，因为它们穿越分泌途径，并被转运到细胞表面。因而，在0-糖基化被控制的细胞中，相对于在0-糖基化不被控制的宿主细胞、中获得的产量，正确组装的糖蛋白例如抗体片段的产量被提高了。糖蛋白的产量在某些情况下可以通过过量表达编码哺乳动物或人侣伴蛋白的核酸分子，或用编码一种或更多种哺乳动物或人侣伴蛋白的核酸分子替换编码一种或更多种内源侣伴蛋白的基因来改善。此夕卜，哺乳动物或人侣伴蛋白在宿主细胞中的表达看起来也控制细胞中的O-糖基化。因而，进一步包括的是此处的宿主细胞，其中编码侣伴蛋白的至少一种内源基因的功能被降低或消除，编码至少一种侣伴蛋白的哺乳动物或人同源物的载体在所述宿主细胞中表达。还包括的是宿主细胞，其中表达内源的宿主细胞侣伴蛋白以及哺乳动物或人侣伴蛋白。在进一步的方面中，低等真核宿主细胞是酵母或丝状真菌宿主细胞。在PTC国际申请NO. PCT/US2009/033507中已经公开了宿主细胞的侣伴蛋白的运用的实例，其中人侣伴蛋白被导入以改善产量以及降低或控制重组蛋白质的O-糖基化。如同上述 的，进一步包括的是低等真核宿主细胞，其中，除了如上所述用编码一种或更多种哺乳动物或人侣伴蛋白的核酸分子替换编码一种或更多种内源侣伴蛋白的基因、或过量表达一种或更多种哺乳动物或人侣伴蛋白之外，编码蛋白质O-甘露糖基转移酶(PMT)蛋白的至少一种内源基因的功能或表达被降低、破坏或删除。在特定的实施方式中，选自由PMT1、PMT2、PMT3和PMT4基因构成的组的至少一种内源PMT基因的功能被降低、破坏或删除。因此，在此公开的方法可以使用被遗传修饰以产生糖蛋白的任何宿主细胞，在所述糖蛋白中主要聚糖选自由复合聚糖、杂合聚糖和高甘露糖聚糖构成的组，其中复合聚糖选自由 Man3GlcNAc2, GlcNAC (1-4) Man3GlcNAc2, Gal(1-4) GlcNAc (l-4)Man3GlcNAc2 和 NANA (1-4) Gal (1-4) Man3GlcNAc2 构成的组；杂合 N-聚糖选自由 Man5GlcNAc2, GlcNAcMan5GlcNAc2, GalGlcNAcMan5GlcNAc2 和NANAGalGl cNAcMan5GlcNAc2构成的组；以及高甘露糖N-聚糖选自由Man6GlcNAc2,Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2和Man9GlcNAc2构成的组。聚糖结构的实例包括但不限于 Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、 GlcNAc4Man3GlcNAc2、 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、 Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、 Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、 Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、 Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANA3Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2 和 NANA4Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2。可以用于构建重组宿主细胞的酵母选择性标记包括药物抗性标志物和遗传学功能，其容许酵母宿主细胞合成关键的细胞营养物，例如，氨基酸。通常在酵母中使用的药物抗性标志物包括氯霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤、G418 (geneticin)、Zeocin,等等。容许酵母宿主细胞合成关键细胞营养物的遗传功能与在相应的基因组功能方面具有营养缺陷突变的可获得的酵母菌株一起使用。常见的酵母可选择标记物提供了合成亮氨酸色氨酸(77 /^和77P/C)、脯氨酸O0TtW)、尿嘧啶(_又URA5、_们、组氨酸07/5^)、赖氨酸(Z752)、腺嘌呤*ADE2、等的遗传功能。其他酵母选择性标记包括来自酿酒酵母的ARR3基因，其赋予了在存在亚砷酸盐的情况下生长的酵母细胞的亚砷酸盐抗性(BobiOWiczet al. , Yeast, 13:819-828C1997)；ffysocki et al. , J. Biol. Chem. 272:30061-30066(1997))。许多适合的整合位点包括在美国专利No. 7，479，389中例举的那些，包括酿酒酵母和其他酵母或真菌已知座位的同源物。将载体整合到酵母中的方法是公知的(参见，例如美国专利No. 7，479，389美国专利No. 7，514，253、美国公开的申请No. 2009012400和W02009/085135)。插入位点的实例包括但不限于毕赤氏酵母'基因；毕赤氏酵母TKd(包括TRPl到7 )基因；毕赤氏酵母#以基因；毕赤氏酵母67#基因；毕赤氏酵母/ °基因；毕赤氏酵母/ 基因；和毕赤氏酵母以Z/基因。毕赤氏酵母和4 基因已经在LinCereghino et al.，Gene 263:159-169(2001)和美国专利 No. 4，818，700 中描述，"/幻和77 /^ 基因已经在 Cosano et al.，Yeast 14:861-867 (1998)中描述，"/货已经在 GenBankAccession No. X56180 中描述。本发明进一步提供了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述酵母主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。所述方法包括提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸终止的双分枝N-聚糖，实中至少BMTl、BMT2和基因被删除或破坏，并且其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含与信号肽融合的成熟的人促红细胞生成素EPO的融合蛋白，所述信号肽靶向ER或高尔基体，并且当所述融合蛋白处于ER或高尔基体中时被除去；在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在特定的方面中，编码成熟的人促红细胞生成素的核酸分子是密码子优化的，为了在甲基营养型酵母例如巴斯德毕赤氏酵母中最佳的表达。如在实施例中所不的,成熟的人促红细胞生成素作为融合蛋白被编码，其中EPO在促红细胞生成素的成熟形式的末端与信号肽的C-末端融合，所述信号肽将融合蛋白靶向分泌途径用于加工，包括糖基化。信号肽的实例包括但不限于酿酒酵母a MATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。可以使用其他信号序列代替在此公开的那些，例如，黑曲霉a-淀粉酶信号肽以及人血清白蛋白(HSA)信号肽。在一个实施方式中，第一核酸分子编码下述融合蛋白，其中成熟的促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，第二核酸分子编码下述融合蛋白，其中成熟的促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽鸡溶菌酶信号肽。所述信号肽可以通过接头肽融合到成熟的人促红细胞生成素，所述接头肽可以含有一个或更多个蛋白酶裂解位点。在进一步的方面中，宿主细胞包括表达盒的二到十二个之间的拷贝，所述表达盒编码包含成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白。在某些方面中，所述宿主细胞包括表达盒的约八个到十一个之间的拷贝，所述表达盒编码包含成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白。在其他方面，所述宿主细胞包括约三到四个拷贝的第一核酸，以及五到七个拷贝的第二核酸。宿主细胞被遗传工程化以生产唾液酸终止的双分枝N-聚糖，其中至少沒#77、BMT2和谷基因被删除或破坏。这样的宿主细胞进一步包括至少OCHl、PM)1、MNN4和MNN4L1基因删除或破坏。宿主细胞进一步包括编码至少以下的嵌合的糖基化酶的一种或更多种核酸分子与细胞靶向肽融合的a 1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体；与细胞靶向肽融合的GlcNAc转移酶I催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体；与细胞靶向肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体；与细胞靶向肽融合的GlcNAc转移酶II催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体；与细胞靶向肽融合的β 1，4-半乳糖基转移酶催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体；以及与细胞靶向肽融合的α 1，2-唾液酸转移酶催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向宿主细胞的ER或高尔基体。选择这些糖基化酶以在它们被靶向的ER或高尔基体中的位置处是有活性的。选择糖基化酶并为了最佳的活性将酶靶向ER或高尔基体的特定区域的方法已经在美国专利No. 7，029, 872和7，449，308，和公开的美国申请Nos.2006/0040353和2006/0286637中描述。宿主细胞被进一步修饰以包括如在公开的美国申请No. 2006/0286637中公开的途径的酶，以生产CMP-唾液酸，并且以包括GlcNAc和半乳糖转运蛋白和UDP-半乳糖-4-差向异构酶。最后，宿主进一步包括核酸分子，其编码与细胞靶向肽融合的真菌α 1，2-甘露糖苷酶催化结构域，所述细胞靶向肽将所述催化结构域靶向分泌途径用于分泌，并且其引起聚糖占用和链长度的降低。与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的检测可以在夹心ELISA中或在Western印迹中测定。
在进一步的方面中，回收成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤和/或羟磷灰石层析步骤和/或阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。在一个实施方式中，成熟的人促红细胞生成素的回收包括阳离子交换层析步骤和随后的羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝
聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。任选地，成熟的人促红细胞生成素的回收包括阴离子层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要地包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。进一步提供的是包含成熟的人促红细胞生成素和药学上可接受的盐的组合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述抗原是如在此公开的获得的。在特定的实施方式中，约50到60%的Ar-聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基；在进一步的实施方式中，大于70%的Ar-聚糖包含位于两个分枝上的唾液酸残基。在进一步的方面中，小于30%的N-聚糖是中性的N-聚糖(即，在N-聚糖的非还原末端处的至少一个末端上不是唾液酸化的)。在再进一步的方面中，小于20%的N-聚糖是中性的N-聚糖。在特定的方面中，成熟的人促红细胞生成素与亲水性聚合物轭合，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述亲水性聚合物在特定的实施方式中是聚乙二醇聚合物。与聚乙二醇聚合物轭合的、主要包含唾液酸终止的双分枝N-聚糖的成熟的人促红细胞生成素的实例已经在共同拥有的美国公开申请No. 2008/0139470中描述了。聚乙二醇聚合物(PEG)基团可以是任何方便的分子量，可以是线性的或分枝的。PEG的平均分子量优选的从约2千道尔顿(“kD”)到约100 kDa;更优选的从约5 kDa到约60 kDa，更优选的从约20 kDa到约50 kDa ;最优选的从约30 kDa到约40 kDa。这些PEG可以由任何商业上的供应商提供，包括NOF公司(Tokyo, Japan)>Dow Pharma (ChiroTechTechnology, Cambridge, UK)、Nektar (San Carlos, CA)和 SunBio (Anyang City, SouthKorea)。适合的PEG部分包括，例如，40 kDa的甲氧基聚(乙二醇)丙醛；60 kDa的甲氧基聚(乙二醇)丙醛；31 kDa的a-甲基-W- (3_氧基丙氧基)，聚氧乙烯；30 kDa的PEG :30kDa的甲氧基聚(乙二醇)丙醒和45 kDa的2，3_ 二(甲基聚氧乙稀基-氧)_1_[ (3-氧基丙基)聚氧乙烯-氧]-丙烷。PEG基团一般经由酰化或还原性氨基化作用通过PEG部分上的反应基团(例如，醛、氨基、硫醇或酯基)到蛋白质或目标多肽上的反应基团(例如，醛、氨基或酯基)连接于促红细胞生成素。例如，PEG部分可以直接地或通过接头连接到促红细胞生成素的N-末端氨基酸残基。对于合成肽的PEG化的有用 的策略包括通过在溶液中形成共轭键来组合合成肽和PEG部分，其各自带有针对对方相互反应性的特定官能团。肽可以用常规的固相合成(参见，例如，实施例4)来容易地制备。肽是在特定位点与合适的功能基团“预先活化的”。在与PEG部分反应之前，纯化前体并完全表征。肽与PEG的连接通常在水相中发生，可以通过反相分析HPLC容易地监视。PEG化的肽可以通过制备型HPLC容易地纯化，通过分析HPLC、氨基酸分析和激光脱附质谱法来表征。以下实施例意图促进本发明的进一步理解。实施例I
遗传工程化的巴斯德毕赤氏酵母菌株YGLY3159是产生带有唾液酸化的N-聚糖的重组人红细胞生成素(rhEPO)的菌株。菌株的构建已经在美国公开的申请No. 20080139470中描述，在附图I中示意地说明。简要地，菌株如下构建。菌株YGLY3159是利用早先描述的方法从野生型巴斯德毕赤氏酵母菌株NRRL-Y11430构建的(参见，例如，美国专利No. 7，449，308 ;美国专利No. 7, 479, 389 ；美国公开的专利申请No. 20090124000 ;公开的PCT申请No. W02009085135 ；Nett andGerngross, Yeast 20:1279(2003);Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5022(2003) ；Hamilton et al., Science 301:1244 (2003))。所有质粒利用标准的分子生物学操作在PUC19质粒中制造。对于为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而优化的核苷酸序列，天然的核苷酸序列通过GENEOPTIMIZER软件(GeneArt, Regensburg, Germany)分析,结果用于产生密码子为了巴斯德毕赤氏酵母表达而优化的核苷酸序列。通过电穿孔转化酵母菌株(使用电穿仪BioRad的厂家建议的标准技术)。质粒pGLY6 (附图2)是靶向座位的整合载体，含有包含酿酒酵母转化酶基因或转录单元(5hSZ/<G ;SEQ ID NO: I)的核酸分子，其一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母做基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :59)的核酸分子，另一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:60)的核酸分子。质粒pGLY6被线性化，线性化的质粒转化到野生型菌株NRRL-Yl 1430中以产生多个菌株，在其中ScSUC2基因通过双交叉同源重组插入到URA5座位中。菌株YGLYI-3从所产生的菌株中选出，是对尿苷营养缺陷的。质粒pGLY40 (附图3)是靶向OCHl座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元(SEQ ID NO :61)的核酸分子，其侧翼是包含重复(SEQ ID NO:62)的核酸分子，随后在一侧是包含来自OCHl基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 64)的核酸分子，另一侧是包含来自OCHl基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 65)的核酸分子。质粒PGLY40用Sfi\线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY1-3中以产生多个菌株，在其中侧翼是hcZ重复的基因通过双交叉同源重组插入到OCHl座位中。菌株YGLY2-3从所产生的菌株中选出，是对做^原养型的。菌株YGLY2-3在存在5-氟乳清酸(5-F0A)的情况下反选择以产生多个菌株，在其中基因已经丧失，在况好2座位中仅留下hcZ重复。这使得菌株是对尿苷营养缺陷的。选出菌株YGLY4-3。质粒pGLY43a (附图4)是靶向沒座位的整合载体，含有包念乳酸克鲁维酵母UDP-#-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)转运蛋白基因或转录单元0T7麗汉 -之SEQ ID N0:3)的核酸分子，其邻近于侧翼是包含hcZ重复的核酸分子的、包含巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元的核酸分子。所述邻近的基因一侧是包含来自基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :66)的核酸分子，另一侧是包含来自沒基因的3’区域的核苷酸序列(SEQID NO :67)的核酸分子。质粒pGLY43a用5/ Ι线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY4-3中 以产生多个菌株，在其中Kl丽N2-2基因和侧翼是重复的基因通过双交叉同源重组插入到沒座位中。沒基因已经在Mille ei a7.，J. Biol. Chem. 283: 9724-9736(2008)和美国专利No. 7，465，557中公开。菌株YGLY6-3从产生的菌株中选出，是对尿苷原养型的。菌株YGLY6-3在存在5-F0A的情况下反选择以产生多个菌株，在其中做基因已经丧失，仅留下重复。这使得菌株是对尿苷营养缺陷的。选出菌株YGLY8-3。质粒pGLY48 (附图5)是靶向麗#也7座位的整合载体，含有表达盒，所述表达盒包含编码m)P-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(SEQ ID NO 17)开放阅读框(ORF)的核酸分子，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母似启动子(SEQ ID N0:53)的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC终止序列(SEQ ID N0:56)的核酸分子，邻近于侧翼是hcZ重复、包含巴斯德毕赤氏酵母基因的核酸分子，其中表达盒在一起的一侧是包含来自巴斯德毕赤氏酵母麗#也7基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 76)的核酸分子，另一侧是包含来自麗#也7基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:77)的核酸分子。质粒PGLY48用Sfil线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY8-3中以产生多个菌株，在其中编码小鼠m)P-GlcNAc转运蛋白和做^基因的表达盒通过双交叉同源重组插入3\MNN4L1座位中。MNN4L1基因(也称为#Μ￥Β)已经在美国专利No. 7，259，007中公开。菌株YGLY10-3从产生的菌株中选出，然后在存在5-F0A的情况下反选择以产生多个菌株，在其中基因已经丧失，仅留下7acZ重复。选出菌株YGLY12-3。质粒pGLY45 (附图6)是靶向/W(97/#M￥座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元的核酸分子，其侧翼是包含重复的核酸分子，随后在一侧是包含来自PNOl基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 74)的核酸分子，另一侧是包含来自MNN4基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 75)的核酸分子。质粒pGLY45用Sfil线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY12-3中以产生多个菌株，在其中侧翼是
重复的做基因通过双交叉同源重组插入到#麗￥座位中。PNOl基因已经在美国专利No.7，198,921中公开，#屬￥基因(也称为##Λ￥Β)已经在美国专利No. 7, 259, 007中公开。菌株YGLY14-3从产生的菌株中选出，然后在存在5-F0A的情况下反选择以产生多个菌株，在其中做^基因已经丧失，仅留下7acZ重复。选出菌株YGLY16-3。质粒pGLY247 (附图7)是靶向歷776座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元的核酸分子，其侧翼是包含hcZ重复的核酸分子，随后在一侧是包含来自量776基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :84)的核酸分子，另一侧是包含来自歷TW基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :85)的核酸分子。质粒pGLY247用线性化,线性化的质粒转化到菌株YGLY16-3中以产生多个菌株，在其中侧翼是7acZ重复的做^通过双交叉同源重组插入到量T76座位中。选出菌株YGLY20-3。质粒pGLY248 (附图8)是靶向做^座位的整合载体，含有包含巴斯德毕赤氏酵母量776基因(SEQ ID NO :86)的核酸分子，其一侧是包含来自基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :59)的核酸分子，另一侧是包含来自基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:60)的核酸分子。质粒PGLY248线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY20-3中以产生多个菌株，在其中被插入到座位中的ScSUC2基因通过双交叉同源重组被量T76基因替换。菌株YGLY22-3被选出，然后在存在5-F0A的情况下反选择以产生多个菌株，在其中插入到歷座位中的做基因已经丧失，仅留下7acZ重复。选出菌株YGLY24-3。质粒pGLY582(附图9)为靶向扭分座位的整合载体，含有串联的四个表达盒，其编码(I)酿酒酵母m)P-葡萄糖差向异构酶(2)在末端融合到酿酒酵母幻前导肽(33)将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的人半乳糖基转移酶I (MGalT)催化结构域，(3)侧翼是7acZ重复的巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元，以及(4)黑腹果蝇UDP-半乳糖转运蛋白编码的表达盒包含编码ORFCSEQ ID NO :21)的核酸分子，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母/*42启动子(SEQ ID N0:45)的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母/*42转录终止序列(SEQ ID N0:46)的核酸分子可操作连接。编码嵌合的半乳糖基转移酶I的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码催化结构域的核酸分子(SEQ ID N0:23)，其在5’末端融合到编码前导区33的核酸分子(SEQ ID N0:13)，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母似/ //启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子。■表达盒包含核酸分子,其包含侧翼是包含重复的核酸分子的巴斯德毕赤氏酵母基因或转录单元。鹏DmUGT的表达盒包含编码
(SEQ ID NO :19)的核酸分子，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母况好2启动子(SEQ IDN047)的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母ALG12转录终止序列(SEQ ID NO :48)的核酸分子可操作连接。所述四个串联的盒一侧是包含来自扭分基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :87)的核酸分子，另一侧是包含来自扭分基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:88)的核酸分子。质粒pGLY582线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY24-3中以产生多个菌株，在其中四个串联的表达盒通过同源重组插入到扭分座位中。选出菌株YGLY58,是对组氨酸营养缺陷的，以及对尿苷原养型的。质粒pGLY167b (附图10)靶向4^7座位的整合载体，含有串联的三个表达盒，其编码(I)在末端融合到酿酒酵母麗呢 前导肽(53)以将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域(KD)，(2)巴斯德毕赤氏酵母/ZZ分基因或转录单元，和
(3)在末端融合到酿酒酵母麗呢 前导肽(54)以将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的大鼠N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)转移酶II催化结构域(TC)。编码KD53的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码黑腹果蝇甘露糖苷酶II催化结构域的核酸分子(SEQ ID N0:33)，其在5’末端融合到编码麗汉？前导区53的核酸分子(SEQ ID NO 5), 其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母似/ //启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子。HISl表达盒包含核酸分子，其包含巴斯德毕赤氏酵母扭分基因或转录单元(SEQ ID N0:89)。编码TC54的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码大鼠GIcNAc转移酶II催化结构域的核酸分子(SEQ ID N0:31)，其在5’末端融合到编码麗汉？前导区54的核酸分子(SEQ ID NO:
7)，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母·2启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母·7转录终止序列的核酸分子。所述三个串联的盒一侧是包含来自似基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :79)的核酸分子，另一侧是包含来自他价基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:80)的核酸分子。质粒pGLY167b用5/ Ι线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY58中以产生多个菌株(在其中三个串联的表达盒通过双交叉同源重组插入到WP似座位中。菌株YGLY73从产生的菌株中选出，是对精氨酸营养缺陷的，并对尿苷和组氨酸原养型的。菌株然后在存在5-F0A的情况下反选择，以产生现在对尿苷营养缺陷的多个菌株。选出菌株YGLY1272。 质粒pGLY1430(附图11)是靶向ADEl座位而不破坏座位表达的KINKO整合载体，含有串联的四个表达盒，其编码(I)在末端融合到巴斯德毕赤氏酵母前导区肽(10)以将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的人GlcNAc转移酶I催化结构域(NA)，(2) UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物(!!!!!^，^彡在^-末端融合到酿酒酵母^^^^前导肽“彡以将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域(FB)，和(4)巴斯德毕赤氏酵母做^基因或转录单元。KINKO (很少或没有敲除的敲入)整合载体允许将异源DNA插入到靶点座位而不破坏在靶点座位处基因的表达，已经在美国公开的申请No. 20090124000中描述了。编码NAlO的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码人GlcNAc转移酶I催化结构域的核酸分子(SEQ ID N0:25)，其在5’末端融合到编码5￡^7之前导区10的核酸分子(SEQ ID N0:11)，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母PMAl启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母转录终止序列的核酸分子。编码MmTr的表达盒包含编码UDP-GlcNAc转运蛋白的小鼠同源物ORF的核酸分子，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母SEC4启动子(SEQ ID NO :49)的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母况好2终止序列(SEQ ID N0:50)的核酸分子可操作连接。编码FB8的表达盒包含编码小鼠甘露糖苷酶IA催化结构域的核酸分子(SEQID N0:27)，其在5’末端融合到编码前导区8的核酸分子(SEQ ID N0:15)，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母汾启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子。表达盒包含核酸分子，其包含侧翼是包含重复的核酸分子的巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元。四个串联的盒在一侧是包含来自ADEl基因的5’区域和完整ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO :82)的核酸分子，随后是巴斯德毕赤氏酵母也似终止序列(SEQ ID NO :54)，在另一侧是包含来自ADEl基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:83)的核酸分子。质粒pGLY1430用线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY1272中以产生多个菌株，在其中四个串联的表达盒通过双交叉同源重组紧跟着ADEl ORF插入到ADEl座位中。菌株YGLY1305从产生的菌株中选出，是对精氨酸营养缺陷的，并且现在对尿苷、组氨酸和腺嘌呤原养型的。菌株然后在存在5-F0A的情况下反选择，以产生现在对尿苷营养缺陷的多个菌株。菌株YGLY1461被选出，能够产生主要具有半乳糖终止的聚糖的糖蛋白。质粒pGFI165 (附图12)是靶向PROl座位而不破坏座位表达的KINKO整合载体，含有表达盒，其编码(I)在末端融合到酿酒酵母aMATpre信号肽(aMATTrMan)以将嵌合的蛋白靶向分泌途径并从细胞分泌的李氏木霉a-1，2-甘露糖苷酶催化结构域，和(2)巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元。编码aMATTrMan的表达盒包含编码李氏木霉催化结构域的核酸分子(SEQ ID N0:29)，其在5’末端融合到编码酿酒酵母a MATpre信号肽的核酸分子(SEQ ID N0:9)，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母汾启动子的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子。URA5衰达盒包含核酸分子，其包含侧翼是包含hcZ重复的核酸分子的巴斯德毕赤氏酵母_5基因或转录单元。两个串联的盒在一侧是包含来自PROl基因的5’区域和完整ORF的核苷酸序列(SEQ ID NO :90)的核酸分子，随后是巴斯德毕赤氏酵母也似终止序列，在另一侧是包含来自PROl基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO 91)的核酸分子。质粒pGFI165用Sfil线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY1461中以产生多个菌株，在其中两个表达盒通过双交叉同源重组紧跟着PROl ORF插入到PROl座位中。菌株YGLY1703从产生的菌株中选出，是对精氨酸营养缺陷的，并对尿苷、组氨酸、腺嘌呤和脯氨酸原养型的。这种菌株能够生产具有降低的0-糖基化的糖蛋白(参见公开的美国申请No. 20090170159)。质粒pGLY2088 (附图13)是靶向TRP2或座位的整合载体，含有表达盒，其编码(I)在Ar-末端融合到酿酒酵母a MATpre信号肽(alpha MF_pre)以将嵌合的蛋白祀向分泌途径并从细胞分泌的成熟的人促红细胞生成素(EP0)，以及(2)ze0cin抗性蛋白(Sh ble或ZeocinR)。编码EPO的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码成熟的人EPO的核酸分子(SEQ ID N0:92)，其在5’末端融合到编码酿酒酵母a MATpre信号肽的核酸分子，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母启动子(SEQ IDNO :55)的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子。ZeocinR表达盒包含编码Sh ble ORF (SEQ ID NO :58)的核酸分子，其在5’末端可操作连接到酿酒酵母72F7启动子(SEQ ID N0:57)，在3’末端可操作连接到酿酒酵母CTC终止序列。两个串联的盒在一侧是包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包含7 基因(SEQ ID N0:78)。质粒pGLY2088在PmeI位点线性化，转化到菌株YGLY1703中来产生多个菌株，在其中两个表达盒通过单交叉同源重组中的滚动插入到座位中，其引起EPO表达盒的多个拷贝插入到座位中而不破坏座位。菌株YGLY2849从产生的菌株中选出，是对精氨酸营养缺陷的，并现在对尿苷、组氨酸、腺嘌呤和脯氨酸原养型的。通过测量分离自菌株的DNA的测序数据的强度来测出的，菌株含有约三个到四个拷贝的EPO表达盒。在ER和高尔基体中嵌合EPO的加工期间，前导肽被除去。因而，产生的rhEPO是EPO的成熟形式。质粒pGLY2456 (附图14)是靶向7 座位而不破坏座位表达的KINKO整合载体，含有六个表达盒，其编码(I)小鼠CMP-唾液酸转运蛋白(mCMP-Sia Transp), (2)人UDP-GlcNAc 2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(hGNE)，(3)巴斯德毕赤氏酵母4^2基因或转录单元，(4)人CMP-唾液酸合酶(hCMP-NANA)，(5)人乙酰基神经氨酸_9_磷酸
合酶(hSIAP S)，(6)在末端融合到酿酒酵母幻BS 前导肽(33)以将嵌合的酶靶向ER或高尔基体的小鼠a _2，6-唾液酸转移酶催化结构域(mST6)，以及巴斯德毕赤氏酵母4^2基因或转录单元。编码小鼠CMP-唾液酸转运蛋白的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码mCMP Sia Transp ORF的核酸分子(SEQ ID N0:35)，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母·7启动子的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母转录终止序列的核酸分子可操作连接。编码人UDP-GlcNAc 2—差向异构酶/#-乙酰甘露糖胺激酶的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码hGNE ORF的核酸分子(SEQ ID N0:37)，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母似启动子的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子可操作连接。编码巴斯德毕赤氏酵母WPa基因的表达盒包含(SEQ ID N0:81)。编码人CMP-唾液酸合酶的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码hCMP-NANA S ORF的核酸分子(SEQ ID N0:39)，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母GPDAH启动子的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含酿酒酵母CTC转录终止序列的核酸分子可操作连接。编码人乙酰基神经氨酸-9-磷酸合酶的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码hSIAP S ORF的核酸分子(SEQ ID N0:41)，其在5’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母启动子的核酸分子可操作连接，在3’末端与包含巴斯德毕赤氏酵母转录终止序列的核酸分子可操作连接。编码嵌合小鼠α-2，6-唾液酸转移酶的表达盒包含为在巴斯德毕赤氏酵母中表达而密码子优化的、编码mST6催化结构域的核酸分子(SEQ ID NO:43)，其在5’末端融合到编码酿酒酵母^7 没信号肽的核酸分子，其在5’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母TEF启动子(SEQ ID NO :51)的核酸分子，在3’末端可操作连接到包含巴斯德毕赤氏酵母TEF转录终止序列(SEQ ID N0:52)的核酸分子。六个串联的盒在一侧是包含来自编码Trp2p的ORF的5’区域、以终止密码子结束的核苷酸序列(SEQ ID NO 98)的核酸分子，随后是巴斯德毕赤氏酵母JZ似终止序列，在另一侧是包含来自TRP2基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID N0:99)的核酸分子。质粒pGLY2456用线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY2849中以产生多个菌株，在其中六个表达盒通过双交叉同源重组紧跟着TRP2 ORF插入到TRP2座位中。菌株YGLY3159从产生的菌株中选出，现在对尿苷、组氨酸、腺嘌呤、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin有抗性，并含有约三个到四个拷贝的EPO表达盒。菌株产生rhEPO ;然而，使用实施例5中的方法，rhEPO具有与针对HCA制得的抗体的交叉反应性结合(参见实施例6)。虽然在此处的实例中各种表达盒被整合到巴斯德毕赤氏酵母基因组的特定座位中，要理解的是，本发明的操作与用于整合的座位是无关的。与此处公开的座位不同的座位可以用于表达盒的整合。许多适合的整合位点包括在美国公开的申请No. 20070072262中例举的那些，包括酿酒酵母和其他酵母或真菌已知的座位的同源物。实施例2
实施例1中的菌株YGLY3159进一步遗传工程化以破坏和基因，如下。菌株YGLY3159在存在5-F0A的情况下反选择来产生菌株YGLY3225，其现在是对尿苷营养缺陷的。质粒pGLY3411 (pSH1092)(附图15)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含侧翼是重复的巴斯德毕赤氏酵母基因，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#7￥基因的5’核苷酸序列(SEQ ID NO :72)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#7￥基因的3’核苷酸序列(SEQID NO :73)。质粒pGLY3411线性化，线性化的质粒转化到YGLY3159中以产生多个菌株，在其中URA5表达盒通过双交叉同源重组插入到BMT4座位中。菌株YGLY4439从产生的菌株中选出，是对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸原养型的。菌株对Zeocin有抗性，并含有约三个到四个拷贝的rhEPO表达盒。菌株具有BMT2和BMT4基因的破坏或删除。质粒pGLY3430 (pSH1115)(附图16)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含编码诺尔丝菌素抗性(NATk)ORF的核酸分子(原本来自pAG25，其来自EROSCARF，ScientificResearch and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a, D—61352 Bad Homburg,Germany，参见 Goldstein et al. , Yeast 15 : 1541 (1999))0RF (SEQ ID N0:102)，与棉阿舒囊霉启动子(SEQ ID NO :105)和棉阿舒囊霉72F7终止序列(SEQ ID NO :106)可操作地连接，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#/7基因的5’核苷酸序列(SEQ ID N0:68)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#/7基因的3’核苷酸序列(SEQ ID N0:69)。质粒pGLY3430线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY4439中以产生多个菌株，在其中NATk表达盒通过双交叉同源重组插入到沒#/7座位中。菌株YGLY6661从产生的菌株中选出，对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin和诺尔丝菌素有抗性，并含有约三 个到四个拷贝的EPO表达盒。菌株具有沒#77、沒#7^和沒#/￥基因的破坏或删除。也选出了菌株YGLY7013 ;然而，这个菌株仅有谷#77基因的部分破坏。这个菌株被指定为具有谷#77、BMT2和BMT4基因的破坏或删除。质粒pGLY4472 (pSH1186)(附图17)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含编码尤凝磨潮霉素B磷酸转移酶基因(办/) ORF (SEQ ID NO : 103)的核酸分子，与棉阿舒囊霉TEFl启动子(SEQ ID NO :105)和棉阿舒囊霉TEFl终止序列(SEQ ID NO :106)可操作地连接，一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的5’核苷酸序列(SEQ ID N0:70)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母基因的3’核苷酸序列(SEQ ID N0:71)。质粒pGLY3430线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY6661中以产生多个菌株，在其中办/表达盒通过双交叉同源重组插入到座位中。从产生的菌株中选出菌株YGLY7361到YGLY7366和菌株YGLY7393到YGLY7398，其是对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸原养型的。菌株对Zeocin、诺尔丝菌素和潮霉素有抗性，并含有约三个到四个拷贝的EPO表达盒。菌株具有BMTl、BMT2, BMT3和BMT4基因的破坏或删除，并产生缺乏与针对宿主细胞抗原(HCA)制得的抗体的交叉反应性结合的rhEPO。实施例3
实施例I中的菌株YGLY3159进一步遗传工程化以产生其中沒#77、BMT3取BMT4基因被破坏或删除的菌株，以及包括几个拷贝的表达盒，所述表达盒编码与鸡溶菌酶前导肽融合的成熟的人EP0。简要地，自YGLY3159开始的这些菌株的构建在附图I中显示，下文中简要地描述。菌株YGLY3159在存在5-F0A的情况下反选择来产生菌株YGLY3225，其现在是对尿
苷营养缺陷的。质粒pGLY2057 (附图18)是靶向ADE2座位的整合载体，含有编码侧翼是重复的巴斯德毕赤氏酵母_5基因的表达盒。所述表达盒一侧是包含来自基因的5’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :100)的核酸分子，另一侧是包含来自基因的3’区域的核苷酸序列(SEQ ID NO :101)的核酸分子。质粒pGLY2057用Sfil线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY3225中以产生多个菌株，在其中做^盒通过双交叉同源重组插入到
座位中。菌株YGLY3229从产生的菌株中选出，是对腺嘌呤营养缺陷的，并对尿苷、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin有抗性，并含有约三个到四个拷贝的EPO表达盒。质粒pGLY2680 (附图19)是可以靶向TRP2或JAT7座位的整合载体，含有表达盒，其编码(I)包含人成熟促红细胞生成素(EPO)的嵌合ΕΡ0，其在末端与鸡溶菌酶信号肽融合以将嵌合蛋白质靶向分泌途径并从细胞分泌，和(2)没有启动子的巴斯德毕赤氏酵母
基因。基因是从隐藏启动子不良地转录的。因而，在没有补充腺嘌呤的培养基中，用该载体转化的酵母菌株的选择需要多个拷贝载体整合到基因组中，以使得对于腺嘌呤是重组原养型的。由 于载体进一步包括EPO表达盒，重组酵母也将包括整合到基因组中的多个拷贝的EPO盒。这种载体和方法已经在公开的PCT申请W02009085135中描述。编码鸡溶菌酶信号肽的DNA序列在SEQ ID NO :94中示出，编码成熟的人EPO的密码子优化的ORF在SEQ ID NO 92中示出，没有其启动子、但是包括其终止序列的巴斯德毕赤氏酵母基因在SEQ ID Ν0:96中示出。嵌合EPO与JAT7启动子和酿酒酵母CTC终止序列可操作连接。两个串联的盒在一侧是包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列包含TRP2基因。质粒pGLY2680在PmeI位点线性化，转化到YGLY3229中来产生多个菌株，在其中两个表达盒通过单交叉同源重组中的滚动插入到座位中，其引起EPO表达盒的多个拷贝插入到座位中而不破坏JAT7座位。从产生的菌株中选出菌株YGLY4209。通过测量被插入到座位中、分离自菌株的DNA的测序数据的强度来测出的，这个菌株有约5-7个拷贝的EPO表达盒。该菌株对于腺嘌呤、尿苷、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株含有总共约八到i^一个拷贝的EPO表达盒。在ER和高尔基体中嵌合EPO的加工期间，前导肽被除去。因而，产生的rhEPO是EPO的成熟形式。菌株YGLY4209在存在5’ -FOA的情况下反选择，以产生对尿嘧啶为营养缺陷的多个菌株。从产生的转化体中选出菌株YGLY4244。质粒pGLY2713 (附图20)，靶向巴斯德毕赤氏酵母/基因(SEQ ID N0:104)的整合载体，含有巴斯德毕赤氏酵母0RF,其邻近于表达盒，所述表达盒包含侧翼是重复的巴斯德毕赤氏酵母_5基因，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母产万作基因的5’核苷酸序列，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母产万作基因的3’核苷酸序列。质粒pGLY2713用Sfil线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY4244中以产生多个菌株，在其中/W(97 ORF和做^表达盒表达盒通过双交叉同源重组插入到PEP4座位中。菌株YGLY5053从产生的菌株中选出，然后在存在5-F0A的情况下反选择以产生多个菌株，在其中基因已经从基因组中缺失。菌株YGLY5597从产生的菌株中选出，是对腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸原养型的。菌株对Zeocin有抗性，并含有约八个到i^一个拷贝的rhEPO表达盒。质粒pGLY3411 (pSH1092)(附图15)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含侧翼是重复的巴斯德毕赤氏酵母基因，其一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#/￥基因的5’核苷酸序列(SEQ ID N0:72)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#7￥基因的3’核苷酸序列(SEQ ID N0:73)。质粒pGLY3411线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY5597中以产生多个菌株，在其中表达盒通过双交叉同源重组插入到沒#7￥座位中。菌株YGLY5618从产生的菌株中选出，对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin和诺尔丝菌素有抗性，并含有约八个到i^一个拷贝的rhEPO表达盒。菌株具有沒
和基因的破坏。
质粒pGLY3430 (pSH1115)(附图16)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含编码诺尔丝菌素抗性(NATk)ORF的核酸分子(原本来自pAG25，其来自EROSCARF, ScientificResearch and Development GmbH, Daimlerstrasse 13a， D—61352 Bad Homburg,Germany，参见 Goldstein et al.，Yeast 15 : 1541 (1999)) ORF (SEQ ID N0:102)，与棉阿舒囊霉TEFl启动子和棉阿舒囊霉TEFl终止序列可操作地连接，在一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#77基因的5’核苷酸序列(SEQ ID NO :68)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒#77基因的3’核苷酸序列(SEQ ID N0:69)。质粒pGLY3430线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY5618中以产生多个菌株，在其中NATk表达盒通过双交叉同源重组插入到沒#77座位中。菌株YGLY7110从产生的菌株中选出，对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin和诺尔丝菌素有抗性，并含有约八个到十一个拷贝的rhEPO表达盒。菌株具有BMTl、BMT2和BMT4基因的破坏。质粒pGLY4472 (pSH1186)(附图17)是含有表达盒的整合载体，所述表达盒包含编码大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因(ZZ7Z)ORF (SEQ ID NO : 103)的核酸分子，与棉阿舒囊霉TEFl启动子和棉阿舒囊霉TEFl终止序列可操作地连接，一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒基因的5’核苷酸序列(SEQ ID NO :70)，另一侧是巴斯德毕赤氏酵母沒基因的3’核苷酸序列(SEQ ID N0:71)。质粒PGLY3430线性化，线性化的质粒转化到菌株YGLY7110中以产生多个菌株，在其中办/表达盒通过双交叉同源重组插入到BMT3座位中。菌株YGLY7113到YGLY7122从产生的菌株中选出，对尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、脯氨酸、精氨酸和色氨酸是原养型的。菌株对Zeocin、诺尔丝菌素和潮霉素有抗性，并含有约八个到十一个拷贝的EPO表达盒。菌株具有BMTl、BMT2, BMT3和BMT4基因的破坏，并产生缺乏与针对HCA制得的抗体的可检测的交叉反应性结合的rhEPO。实施例4
实施例I到3中的几种菌株被用于生产rhEPO，如下文所述，在附图21中示意地显示。简要地，通过用来自工作细胞库的细胞接种含有培养基的摇瓶开始生产，继续通过一系列接种、孵育，以及扩展的培养物转移到大小增加的容器中，直到足够的生物质可用来接种生产生物反应器。甘油是分批阶段中的主碳源，然后通过甘油和盐的饲喂维持培养物生长。当甘油被耗尽时，通过转变为甲醇饲喂，诱导细胞表达rhEPO蛋白质。在诱导时添加抑制物以最小化0-糖基化(例如，PMTi 3、5-[ [ 3- (I-苯基乙氧基)-4- (2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代2-硫代-3-噻唑烷乙酸，(参见公开的PCT申请No. WO 2007061631))和最小化蛋白水解作用。在阶段的末期再次添加蛋白水解作用的抑制物以最小化蛋白水解作用。培养物冷却到约4°C并收获。菌株的实验室规模培养一般使用以下操作在500 mL SixFors和3L发酵器中进行。生物反应器筛选(SIXF0RS)在0. 5L容器(Sixfors多发酵系统，ATR Biotech, Laurel,MD)中使用以下条件进行pH值6. 5，24°C，0. 3 SLPM和550 rpm的起始搅拌速度，350 mL起始工作体积(330 mL BMGY培养基和20mL接种物)。在接种一小时后，IRIS多发酵器软 件(ART Biotech, Laurel, MD)用于在10小时内线性地将搅拌子速度从550 rpm提高到1200 rpm。种子培养物(在IL挡板烧瓶中200 mL的BMGY)直接从琼脂平板接种。种子烧瓶在24°C孵育72小时来达到95到100之间的光密度(0D600)。发酵器用200 mL稳定期烧瓶培养物接种，所述培养物是通过离心浓缩到20 mL的。分批期在初始进料甘油(18-24h)发酵完成时结束，继之以第二分批期，其通过添加17 mL的甘油给料溶液(50% [w/w]甘油，5mg/L 生物素，12. 5ml/L PMTi 盐(65 g/L FeS04. 7H20, 20 g/L ZnCl2, 9 g/L H2S04,6 g/L CuS04. 5H20, 5 g/L H2S04, 3 g/L MnS04. 7H20, 500 mg/L CoCl2. 6H20, 200 mg/L NaMo04. 2H20, 200 mg/L 生物素，80 mg/L NaI, 20 mg/L H3B04))来启动。在由溶解氧中的尖峰所指示的第二分批期完成时，通过以O. 6 g/h饲喂甲醇给料溶液(100% MeOH 5mg/L生物素，12. 5 mL/L PMTi) 32-40小时来启动诱导期。通过离心收获培养物。生物反应器培养(3L)在3L (Applikon, Foster City , CA)和 15L (Applikon,Foster City , CA)玻璃生物反应器以及40L(Applikon, Foster City , CA)不锈钢的、在适当位置有蒸汽的生物反应器中进行。种子培养物通过直接用冷冻的储备小瓶以1%体积比接种BMGY培养基来制备。种子烧瓶在24 °C孵育48小时以获得20 ± 5的光密 度(0D600 )以确保细胞在转移时指数地生长。培养基每升含有40 g甘油、18. 2 g山梨醇、2. 3 g K2HP04、11. 9 g KH2P04U0 g 酵母提取物(BD, Franklin Lakes, NJ),20 g 蛋白胨(BD, FranklinLakes, NJ)、4X1CT3 g生物素和 13. 4 g Yeast Nitrogen BaseCBD, Franklin Lakes, NJ)。生物反应器用种子与初始培养基10%的体积比来接种。培养在以下条件下以进料-分批方式进行温度设置在24±0. 5°C, pH值用NH40H控制到6. 5±0. 1，通过级联添加02时的搅动率将溶解氧维持在I. 7±0. I mg/L。空气流速维持在0.7 vvm。在初始进料甘油(40 g/L)耗尽之后，含有12. 5 mL/L PTMl盐的50% (w/w)甘油溶液在最大生长速度的50%时指数地饲喂八小时，直到达到250g/L的湿细胞重量。诱导在30分钟的饥饿期之后启动，此时指数地饲喂甲醇以维持0. OltT1的比生长速率。当达到150 mM/L/h的氧吸收率时，甲醇进料速度保持恒定以避免氧限制。通过离心收获培养物。通过离心和微过滤来澄清之后，滤液通过超滤浓缩10X，通过使用蓝染料-亲和性和羟磷灰石的两个层析步骤的顺序来纯化rhEPO蛋白质。初次澄清通过离心进行。整个细胞发酵液转移到1000 mL离心瓶中，在4°C在13，000 Xg下离心15分钟。可以对更大的发酵器采用超滤步骤(10L到40L以及更大)。这个步骤可以使用孔径大小10K的Sartorious扁平片层进行到五倍浓度。捕获步骤使用Blue SEPHAROSE 6 Fast Flow(Pseudo-Affinity)层析进行。BlueSEPHAROSE 6 fast Flow (FF)柱(GE Healthcare)用 50 mM MOPS,pH 7.0 平衡。培养物上清液调节到100 mM NaCl,在加载到柱上之前通过终端滤器(Whatman, Polycap TC)。在加载后用3倍柱体积(CV)洗涤，留存时间维持在约10分钟。洗脱是50 mM MOPS, pH 7. O中的I M NaCl的4 CV的梯级洗脱。EPO在I M NaCl下洗脱。中间步骤使用轻磷灰石(HA)层析进行。Macr^-prep陶瓷轻磷灰石I型40 μ m(BifRad)在捕获步骤之后使用。这个柱用平衡溶液来平衡50 mM MOPS,pH 7.0，含有I MNaCl和10 mM CaCl2 在加载之前，约10 mM的CaC12添加到来自blue柱的集中的rhEPO中。柱洗涤用3 CV的平衡溶液进行，随后是MP0S，pH 7. O中12. 5 mM磷酸钠下10 CV的梯级洗脱，以提供含有rhEPO的HA库I。阳离子交换层析步骤可以用于进一步纯化rhEPO。在羟磷灰石层析步骤之后集中的样品(例如，HA库I)相对于50 mM乙酸钠，pH 5. O在4°C透析过夜，Source 30S柱或Poros阳离子交换柱(GE Healthcare)用相同的缓冲液平衡。透析的样品施加到柱上,施加O到750 mM NaCl的10 CV线性梯度，rhEPO在350到500 mM NaCl之间洗脱，提供rhEPO。纯化的rhEPO分子的Ar-末端可以通过还原的氨基化(PEG化)轭合到40_kDa线型聚乙二醇(PEG)0活化的PEG以I :10的蛋白质PEG比例添加到pH 5. 2的50 mM乙酸钠缓冲液中的rhEPO样品中(浓度约I mg/mL)。通过向反应混合物添加10 mM氰基硼氢钠并搅动过夜,反应在还原条件下在室温下进行。通过添加10 mM Tris, pH 6. 0来停止反应。单聚乙二醇化的rhEPO产物使用阳离子交换层析步骤纯化，之后渗滤到最终的制剂缓冲液中(20 mM磷酸钠，120 mM氯化钠，0.005%聚山梨酯20 (w/v)，pH 7.0)。最终产品稀释到适合于填充的浓度，无菌过滤到药物贮藏容器中。聚乙二醇化的rhEPO可以保存在2-8°C直到填充，此时它们被无菌地填充到玻璃小瓶中，然后用橡皮塞和招盖密封。蛋白质的商业配方是已知的，并可以使用。实例包括但不限于ARANESP :聚山梨酸酯溶液每ImL含有0. 05 mg聚山梨酯80,用2. 12 mg磷酸二氢钠一水合物、0. 66 mg无水磷酸氢二钠和8. 18 mg氯化钠在注射用水中配置为pH 6. 2±0. 2，USP (到I mL)。白蛋白溶液每I mL含有2. 5 mg白蛋白(人),用2. 23 mg磷酸二氢钠一水合物、0. 53 mg无水磷酸氢二钠和8. 18 mg氯化钠在注射用水中配置为pH 6. 0±0. 3,USP (到I mL)。EPOGEN 在等渗的氯化钠/柠檬酸钠缓冲溶液或氯化钠/磷酸钠缓冲溶液中配制为无菌的、无色液体，用于静脉内的(IV)或皮下的(SC)施用。单剂量的、无防腐剂的小瓶每I ml的溶液含有处在注射用水的2000、3000、4000或10，000单位的阿法依伯汀(Epoetin alfa)，2. 5 mg白蛋白(人)，5. 8 mg柠檬酸钠，5. 8 mg氯化钠和0.06 mg柠檬酸，USP (pH 6. 9±0. 3)。这种制剂不含有防腐剂。保存的小瓶含有1%苯甲醇。实施例5
用于分析宿主细胞抗原(HCA)的存在或缺乏的方法包括Western印迹分析以及夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)。宿主细胞抗原(HCA)抗体使用来自NORF菌株培养物的上清液在兔中制备。NORF菌株与YGLY3159是遗传上相同的，只是它缺乏编码人成熟EPO的0RF。在完全弗氏佐剂中制备的NORF囷株发酵上清液注射到兔中，其然后用弗氏不完全佐剂中制备的发酵上清液强化三次。在45天之后，兔子进行放血，使用标准方法制备针对HCA的多克隆抗体，例如，兔多克隆IgG 9161 R)72208-S，其是SLr蛋白A纯化的，以及GiF2多克隆兔6316完整兔血清。GIF2抗体不是蛋白A纯化的。用于检测巴斯德毕赤氏酵母HCA的Western印迹如下进行。含有纯化的聚乙二醇化或非聚乙二醇化rhEPO的样品在样品加载缓冲液中还原，其中I U L然后添加到4-20%聚丙烯酰胺SDS Tris-HCl (4-20% SDS-PAGE)凝胶(Bio RAD)的孔中，在150 V电泳约60分钟。在100V下，分辨的蛋白质电转移到硝化纤维素膜上持续约60分钟。在转移之后，用1%阻断溶液(Roche Diagnostics)阻断膜一小时。在阻断之后，膜用1:3000稀释的兔抗-HCA多克隆抗体(初级抗体)探测。以后，洗涤膜，兔抗-HCA抗体的检测用1:5000稀释度的、轭合到辣根过氧化酶(HRP)的山羊-抗-兔IgG (H+L) (Pierce #_31460, Lot #H51015156) 二级抗体进行。在洗涤膜之后，结合的二级抗体的检测使用3，3’ - 二氨基联苯胺(DAB)。为了检测EPO蛋白质，初级抗体是在1:1000稀释度下使用的EPO (B_4)HRP_轭合的抗体(SC5290 Lot# A0507, Santa Cruz Biotechnology)。不使用二级抗体。常规地，EPO样品与已经用PNGaseF处理脱糖基化的rhEPO样品并行地电泳。脱糖基化使用50 y L样品进行，向其中添加500单位/ y L的I ii L的PNGaseF酶。在37°C下孵育2小时之后，样品在样品加载缓冲液中还原，除去I UL等分量并施加到上述SDS凝胶上。
用于检测巴斯德毕赤氏酵母HCA的夹心ELISA如下进行。96孔ELISA平板的反应孔用I μ g/孔的小鼠抗hEPO单克隆抗体包被。然后反应孔用磷酸盐缓冲盐水(PBS)阻断30分钟。浓缩到约200 ng/mL、约100 μ L含有纯化的非聚乙二醇化rhEPO的样品添加到反应孔。初级检测使用PBS中1:800起始稀释度的兔抗-HCA多克隆抗体，其然后一排地连续I :1在PBS中稀释，到第11个反应孔以1:819，200稀释度结束。第12个反应孔充当阴性对照。ELISA的标准物是从YGLY3159纯化的rhEPO。在60分钟之后，反应孔用PBS洗涤三次。兔抗-HCA抗体的检测使用PBS中1:10，000稀释度的与碱性磷酸酶(AP)轭合的山羊抗兔抗体。60分钟之后，反应孔用PBS洗涤三次，结合的二级抗体的检测使用4-甲基伞形酮酸基憐酸(4-MUPS)。ELISA平板使用Tecan Genios Multidetection微量培养板读取器在340 nm激发波长和465 nm发射波长下读取。
实施例6
这个实施例显示了 YGLY3159产生具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性(CBA)的rhEPO，交叉结合活性是由于rhEPO上至少部分聚糖上β -I, 2-甘露糖残基(α -I, 2_甘露糖苷酶抗性)的存在，即使rhEPO是在β -I, 2-甘露糖基转移酶基因沒被删除或破坏的菌株中产生的。rhEPO通过三步骤层析分离从糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母生产菌株YGLY 3159的发酵上清液中回收，由SDS-PAGE、RP-HPLC和SEC-HPLC所测定的显示了约95%的蛋白质纯度。单聚乙二醇化的rhEPO通过阳离子交换层析步骤从它的超聚乙二醇化和未聚乙二醇化轭合物中分离，具有通过SDS-PAGE凝胶测定的约96%纯度。然而，针对YGLY3159菌株的HCA的抗体检测到从该菌株产生的rhEPO制品中的糖蛋白，其在Western印迹上与rhEPO共同迁移。附图22显示了抗-HCA抗体鉴定出在4-20% SDS-PAGE凝胶上与rhEPO共同迁移的蛋白质。从rhEPO上除去唾液酸不能消除交叉结合活性；然而，使用PNGase F从rhEPO上除去整个Ar-聚糖产生了 rhEPO的脱糖基化的形式,其在使用抗-HCA抗体探测的Western印迹中是不可检出的。这在附图23中显示了，其显示了仅rhEPO的脱糖基化的形式缺乏与抗-HCA抗体的交叉结合活性。为了确定该交叉结合活性是否是rhEPO特异性的，或是否可在来自其他重组巴斯德毕赤氏酵母菌株的纯化的糖蛋白制品中鉴定到，分离了其他菌株中产生的糖蛋白，通过4-20% SDS-PAGE凝胶分辨，凝胶转移到硝化纤维素膜。对于在重组巴斯德毕赤氏酵母中产生的重组人完整抗体(rhlgG)来说，在野生型巴斯德毕赤氏酵母(在N和糖基化区域中都是超甘露糖基化的)产生的、以及在重组GS2. O菌株中产生的蛋白质制品中检测到交叉结合活性，所述重组GS2. O菌株主要产生Man5GlcNAc2N-聚糖，并且也含有α -I, 2-甘露糖苷酶抗性的可检测的Man9GlcNAc2N-聚糖(附图24，箭头)。然而，来自野生型巴斯德毕赤氏酵母的rhlgG制品含有大于rhlgG的表观分子量的交叉结合活性，表明制品含有污染的宿主细胞糖蛋白。交叉结合活性未能通过PNGase F消化除去(附图24中的圆圈)。附图25显示了在YGLY3159中产生的糖基化rhEPO具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性，但是人胎球蛋白、人去唾液酸胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)和LEUKINE (在酿酒酵母中产生的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhu GM-CSF)不具有与抗-HCA抗体的交叉结合活性。胎球蛋白是重度糖基化的血液糖蛋白，其在肝脏中产生，分泌到血流中。它们属于调节血流中各种货物物质的转运和可用性的结合蛋白质的大类。这些载体蛋白的公知的代表是血清白蛋白，是成年动物的血浆中最丰富的蛋白质。胎球蛋白在胎儿血液中是更为丰富的，由此得名“胎球蛋白(fetuin)”(来自拉丁语fetus)。胎牛血清含有比白蛋白更多的胎球蛋白，而成年血清含有的白蛋白比胎球蛋白更多。去唾液酸胎球蛋白是一类胎球蛋白，N-和O-聚糖上的末端唾液酸通过轻微的水解或神经氨酸酶处理被除去。当前，在酿酒酵母中没有￠-连接的甘露糖的报道。HSA不是糖基化的蛋白质。实验室规模的数据展现了，利用羟基磷灰石(HA) I型40i!m树脂自BlueSEPHAROSE 6 FF捕获库中纯化rhEPO的中间层析步骤，可以从具有高甘露糖型聚糖的rhEPO (HA库2和3)中分离几乎不具有可检测的交叉结合活性的rhEPO (HA库I)。HA库 I含有约90. 40 %双唾液酸化的聚糖(期望的聚糖形式)和小于3. 5%的中性的N-聚糖。相比之下，自0到100 mM磷酸钠的线性梯度洗脱显示了更晚的洗脱级分(HA库2和3)含有高甘露糖型N-聚糖，以及在Western印迹中提高的与抗-HCA抗体的交叉结合活性。这可以在附图26中显示的HPLC N-聚糖分析和4-20% SDS-PAGE凝胶的Western印迹中看出。还测试了利用Q SEPHAROSE FF或Source 30Q阴离子树脂的阴离子柱层析。组合HA库1-3，并在4°C下相对于pH 5.0的50 mM乙酸钠透析过夜。透析的样品施加到柱上，施力口 0到750 mM NaCl的10 CV线性梯度，rhEPO在350到500 mM NaCl之间洗脱，提供rhEPO。附图27A显示了 rhEPO的Q SEPHAROSE FF纯化的实例。数据显示了，当在夹心ELISA中分析结合和未结合的材料时，显示了更高交叉结合活性的高甘露糖型聚糖(Man6，7，8，9，>9，大部分是a 1，2甘露糖苷酶抗性的)不结合阴离子交换树脂(附图27B)。表I显示了结合的级分(Q琼脂糖FF库I)和流通级分(Q SEPHAROSE FF流通物)中rhEPO的N-聚糖含量的HPLC分析结果。表2显示了表I中显示的中性的N-聚糖的N-聚糖含量。
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为了将β -连接的甘露糖型N-聚糖的存在降低到不可检测的水平，基因被破坏，分析rhEPO中α -I, 2_甘露糖苷酶抗性聚糖的存在。菌株YGLY6661和YGLY7013如实施例2描述的构建，使用抗-HCA抗体分析α-1,2-甘露糖苷酶抗性聚糖的存在。菌株YGLY7013是取bmt4Λ的，菌株YGLY6661 是 bmt2A、bmt4Λ 和 bmtlA 的。菌株产生的 rhEPO 经历 Blue SEPHAROSE 6FF层析，Blue SEPHAROSE 6FF捕获库的等分量用PNGase F velnon处理。处理的和未处理的等分量在SDS-PAGE上电泳，凝胶转移到硝化纤维素膜，用抗EPO抗体或抗-HCA抗体探测膜。附图28显示了 Blue SEPHAROSE 6 FF捕获库的等分量的4-20% SDS-PAGE凝胶的Western印迹中，每一个菌株产生的rhEPO仍然具有与抗-HCA抗体交叉反应的α -I, 2-甘露糖苷酶抗性Ar-聚糖。表3和4显示了来自发酵和SixFors培养物的Blue Sepaharose 6 FF捕获库中rhEPO中聚糖种类的分布。如表格中所示的，两种菌株都产生了相当数量的中性的N-聚糖，其部分对体外α I, 2-甘露糖苷酶消化有抗性。
权利要求
1.一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产重组糖蛋白的方法，所述重组糖蛋白缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括 (a)提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其不展现对于聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性，不展现对于聚糖或O-聚糖的选自P -甘露糖基转移酶I活性和^ -甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，并且其包括编码所述重组糖蛋白的核酸分子； (b)在对表达所述重组糖蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；和 (c)从所述培养基中回收所述重组糖蛋白，以产生缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性的重组糖蛋白。
2.权利要求I的方法，其中所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性、3-甘露糖基转移酶I活性和3-甘露糖基转移酶3活性。
3.权利要求I的方法，其中所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或聚糖的￠-甘 露糖基转移酶4活性。
4.权利要求I的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在夹心ELISA中测定。
5.权利要求I的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在Western印迹中测定。
6.权利要求I的方法，其中所述重组糖蛋白是治疗性糖蛋白。
7.权利要求5的方法，其中所述治疗性糖蛋白选自由促红细胞生成素(EPO);细胞因子例如干扰素a、干扰素P、干扰素Y和干扰素《 ;以及粒细胞-集落刺激因子(GCSF)；GM-CSF ;凝血因子例如因子VIII、因子IX和人类蛋白质C ;抗凝血酶III ;凝血酶；可溶的IgE受体a链；免疫球蛋白例如IgG、IgG片段、IgG融合物和IgM ;免疫粘附素和其他Fe融合蛋白，例如可溶的TNF受体-Fe融合蛋白；RAGE-Fc融合蛋白；白细胞介素；尿激酶；胃促胰酶；和脲胰蛋白酶抑制物；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；annexin V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子-2 ;骨髓祖代抑制因子-I ;护骨素；a -I-抗胰蛋白酶；ct -feto蛋白；DNase II ;人类血纤蛋白溶解酶原的kringle 3 ;葡糖脑苷脂酶；TNF结合蛋白I ;促滤泡激素；细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 - Ig ;跨膜激活物和钙调节物和亲环蛋白配体；高血糖素样蛋白质I ;和IL-2受体激动剂构成的组。
8.权利要求I的方法，其中所述宿主细胞被遗传工程化以生产具有人类样N-聚糖的糖蛋白。
9.权利要求I的方法，其中所述宿主细胞被遗传工程化以生产主要具有选自以下的 Ar-聚糖的糖蛋白=Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2,GlcNAcMan3GlcNAc2,GlcNAc (H)Man3GlcNAc2、Gal (1_4)G1cNAc (1_4)Man3GlcNAc2 和 NANA (1_4)Gal (1_4)GlcNAc (:1_4)Man3GlcNAc2。
10.一种包含通过权利要求I的方法获得的一种或更多种重组糖蛋白的组合物。
11.一种在巴斯德毕赤氏酵母中生产成熟的人促红细胞生成素的方法，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖，并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性，所述方法包括 Ca)提供重组巴斯德毕赤氏酵母宿主细胞，其被遗传工程化以生产唾液酸终止的双分枝聚糖，不展现对于聚糖或0-聚糖的P -甘露糖基转移酶2活性，并且不展现选自对于聚糖或O-聚糖的P -甘露糖基转移酶I活性和P -甘露糖基转移酶3活性的至少一种活性，以及其包括两种或更多种核酸分子，各自编码包含融合到信号肽的成熟的人促红细胞生成素的融合蛋白，所述信号肽靶向ER并且当所述融合蛋白处于ER中时被除去； (b)在对表达和加工所述第一和第二融合蛋白有效的条件下在培养基中生长所述宿主细胞；以及 (c)从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素，来产生所述成熟的人促红细胞生成素，其主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
12.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞不展现对于聚糖或聚糖的￠-甘露糖基转移酶2活性、3-甘露糖基转移酶I活性和3-甘露糖基转移酶3活性。
13.权利要求12的方法，其中所述宿主细胞进一步不展现对于聚糖或O-聚糖的& -甘露糖基转移酶4活性。
14.权利要求11的方法，其中所述信号肽是酿酒酵母aMATpre信号肽或鸡溶菌酶信号肽。
15.权利要求11的方法，其中至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽，以及至少一种核酸分子编码下述融合蛋白，其中促红细胞生成素融合到酿酒酵母a MATpre信号肽、鸡溶菌酶信号肽。
16.权利要求11的方法，其中编码促红细胞生成素的核酸分子的核酸序列的密码子为了在巴斯德毕赤氏酵母中表达而被优化。
17.权利要求11的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在夹心ELISA中测定。
18.权利要求11的方法，其中与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性在Western印迹中测定。
19.权利要求11的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阳离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
20.权利要求11的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括羟磷灰石层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
21.权利要求11的方法，其中从所述培养基回收所述成熟的人促红细胞生成素包括阴离子交换层析步骤，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
22.—种包含获自权利要求18的方法的成熟的人促红细胞生成素和药学上可接受的盐的组合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖以及没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
23.权利要求22的组合物，其中所述成熟的人促红细胞生成素轭合到亲水性聚合物，所述成熟的人促红细胞生成素主要包含唾液酸终止的双分枝聚糖并且没有与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测的交叉结合活性。
24.权利要求23的组合物，其中所述亲水性聚合物是聚乙二醇聚合物。
全文摘要
描述了在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原制得的抗体的可检测交叉结合活性的蛋白质和糖蛋白的方法。特别地，描述了下述方法，其中不展现对于N-聚糖或O-聚糖的β-甘露糖基转移酶2活性以及不展现选自β-甘露糖基转移酶1、3和4活性的至少一种活性的重组巴斯德毕赤氏酵母菌株来生产重组蛋白质和糖蛋白。这些重组巴斯德毕赤氏酵母菌株可以产生这样的蛋白质和糖蛋白，所述蛋白质和糖蛋白缺乏在其上的可检测的α-甘露糖苷酶抗性β-甘露糖残基，因而，缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的交叉结合活性。进一步描述的是在巴斯德毕赤氏酵母中生产缺乏与针对宿主细胞抗原的抗体的可检测的交叉结合活性的双唾液酸化人促红细胞生成素的方法。
文档编号C07K14/00GK102648286SQ201080057790
公开日2012年8月22日 申请日期2010年10月11日 优先权日2009年10月16日
发明者H.李, N.塞图拉曼, P.多布罗维奇, S.哈密尔顿, S.戈马蒂纳亚加姆, S.维尔德特, T.A.斯塔黑姆 申请人:默沙东公司