专利名称：精-鸟二肽合成方法
技术领域：
本发明涉及一种精-鸟二肽合成方法，属于肽类合成领域。
背景技术：
肽类由于其在生物体内具有良好的吸收性，吸收效率比氨基酸和蛋白质都高，具有独特的生理调节功能，因此，肽类化合物特别是短肽类化合物的开发得到了广泛关注。精氨酸、鸟氨酸均是人体必需的氨基酸，在生物体代谢中起重要作用。精氨酸(Arginine，Arg)最初由khlus于1886年从植物羽扇豆苗中分离提取得到，1895年Hedin发现精氨酸存在于哺乳动物的蛋白质中。精氨酸是幼龄哺乳动物的必需氨基酸，是组织蛋白中最丰富的氮载体。精氨酸是碱性氨基酸，在动物体内具备重要的生理生化功能，它不仅是细胞质、核酸蛋白的主要成分，还是向天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、聚胺(腐胺、精脒、精胺)等转换为高能磷酸化合物肌酸磷酸的中间体，是肌酐酸唯一的氨来源；还作为尿素循环的中间体，通过尿素循环解除氨中毒，避免由于氨过量造成的代谢紊乱。在机体的勻质代谢方面起着重要的作用，可用于多种代谢途径，包括精氨酸酶、 一氧化氮合酶、精氨酸/甘氨酸胍基转移酶、精氨酰-tRNA合成酶等。在体内，精氨酸是最丰富的氮运输者，并通过多种代谢途径加以利用。L-鸟氨酸学名为α， δ -二氨基戊酸，分子式为C5H12n2O2,结构式为 nh2-ch2-ch2-ch2-chnh2-cooh。l-鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中，在生物体代谢中起到重要作用，是尿素生成的中间产物，精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，主要参与产尿素的鸟氨酸循环，对体内集聚的氨具有解毒作用，因而鸟氨酸对人体肝脏细胞具有重大意义。在近代医药行业中，L-鸟氨酸除用于制备保肝、护肝、治疗肝病、抗疲劳、抗虚弱等各种复方氨基酸输液外，还常和精氨酸一起用于配制恢复疲劳的发泡饮料。近几年研究发现鸟氨酸还可刺激脑垂体分泌生长激素，促进蛋白质合成及糖与脂肪的分解代谢， 在结合运动情况下摄食鸟氨酸可减少体内脂肪堆积，增强肌肉和体力，起到减肥保健的作用；此外，鸟氨酸能增加聚乙烯胺的合成，促进细胞增殖，在提高免疫功能和抗癌功能上有一定作用；L-鸟氨酸添加在运动员保健品支链氨基酸中，具有脱苦作用。在欧洲，鸟氨酸液作为膳食药物来销售；日本将L-鸟氨酸与L-肉碱、谷氨酸等作为食品调料来看待。L-鸟氨酸因其多功能的保健作用而引起世人的特别关注。二肽是由两个氨基酸残基通过肽键连接形成的肽，在体内二肽可被二肽酶水解而成两个游离氨基酸。在体内肠粘膜细胞上存在着吸收二肽的耗能主动运转体系，因此二肽比氨基酸更易于被吸收。由于以肽形式吸收时，吸收率高，并且具有一定的生理功能，二肽的研究受到了广泛关注，例如丙谷二肽、甘氨酰脯氨酸二肽、谷氨酰胺二肽、赖氨酸谷氨酸二肽等已被开发成为药物或药物前体。但目前还尚未有文献报道关于精-鸟二肽的制备。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能大批量生产，经济合理，操作简单且产品收率和纯度均高的新的二肽化合物精-鸟二肽(Arg-Orn)的合成方法。本发明提供的精-鸟二肽合成方法的具体步骤
1) N端保护的鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应30 miiTlO h，反应温度-5 30 V，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，形成N端保护的鸟氨酸活泼酯；其中N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0. 7(Γ2. 50。2)将1)步中得到的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸，在有机溶剂中反应10 mirTl5 h，反应温度-5 30 °C，形成酰胺键，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层， 旋蒸，真空干燥，得到N端及胍基保护的精-鸟二肽；其中N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸摩尔比为0. 8(Γ3. O。3)将2)步中得到的N端及胍基保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入无机酸， 反应温度10飞0 0C，反应广5 h，脱除胍基保护基，用乙醚沉淀，过滤得到N端保护的精-鸟二肽；其中N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸的摩尔比为0. 5 10。4)将3)步中得到的N端保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入有机碱，室温，反应20 mirTl2 h，反应温度-5 30 °C，反应液水洗，分离有机层，旋蒸，干燥，乙醚研磨，过滤， 得到精-鸟二肽，产率为30、5% ；其中N端精-鸟二肽与有机碱的摩尔比为0. 5^3. O。其中，
(I)所述的有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、1，2_ 二氯乙烷、二甲基亚砜或氯仿中的一种。(II)步骤1)中所述的N端保护的鸟氨酸为Fmoc-Orn-OH或Fmoc-Orn(Boc)-0H。(III)步骤1)中所述的N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的反应优选时间范围为广6 h，优选反应温度-5 10 °C。(IV)步骤2)中所述的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸反应的优选时间范围为;Γ7 h，优选反应温度-5 10 °C。( V)步骤3)中所述的N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸反应的优选时间范围为2 3 h,优选反应温度为2(T40 °C。(VI)步骤4)中所述的N端精-鸟二肽与有机碱的反应优选时间为1.5飞1!，优选反应温度为-5 10 °c。(ΥΠ)步骤3)中所述的无机酸选自盐酸、三氟乙酸、含氯化氢的冰乙酸溶液、含溴化氢的冰乙酸溶液、含氯化氢的二氧六环溶液或含溴化氢的二氧六环溶液中的一种。(VDI)步骤4)中所述的有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、 三甲胺、三乙胺或异丙胺中的一种。本发明的优点及有益效果
本发明首次采用化学合成方法得到精鸟二肽，并且该工艺合成路线短，生产工艺合理， 成本低，有良好的应用价值。
图1是精-鸟二肽的液相分析及质谱，
(A)液相分析，分析条件乙腈水=8515 ；流速1 mL/min ；检测波长:254nm
(B)质谱正离子模式[M+H]+= 288. 90， [M+Na]+= 310. 80(C)质谱负离子模式[Μ-ΗΓ = 286.75。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1
1、Fmoc-Orn (boc)-OH 50 mmol 用 20 mL 二氯甲烷溶解，加入 NHS 35 mmol,室温反应1小时，反应结束后，水洗，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn (boc)-NHS。产率95%。2、将Arg(Pbf)-OH 20 mmol,Fmoc-OrnCboc)-NHS 16 mmol 溶于 30mL氯仿，于 10°C 反应过夜，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn (boc)-Arg (Pbf)-0H。产率 80%。3、将 Fmoc-Orn (boc)-Arg(Pbf)-OH 7 mmol 溶于 20 mL 二氧六环，滴力口 3 mL 三氟乙酸，室温反应2小时，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到Fmoc-Orn-Arg-OH。 产率65%。4、将 Rnoc-Orn-Arg-OH 5 mmol 溶于 15 ml 甲醇中，滴加 7. 5 mL 哌啶，_5°C下反应5小时，反应结束后，加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg。产率50%。实施例2
1、Fmoc-Orn (boc) -OH 40 mmol 用 40 mL 乙酸乙酯溶解，加入 NHS 65 mmol, 20°C反应2. 5 h，反应结束后，水沉，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn (boc)-NHS。产率85%。2、将 Arg (Pbf) -OH 20 mmol, Fmoc-Orn (boc) -NHS 32 mmol 溶于 50 mLl，2_ 二氯乙烷，30°C反应4 h，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf)-0H。产率 70%。3、将 Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf) -OH 15 mmol 溶于 40mL 乙腈，滴力口 10 mL 溴化氢/冰乙酸溶液，室温反应3 h，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到 Fmoc-Orn-Arg-OH。产率 75%。4、将 Fmoc-Orn-Arg-OH 10 mmol 溶于 35 mL N，N-二甲基甲酰胺(或二甲基亚砜)中，滴加15 mL环己胺，室温反应4 h，反应结束后，加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg。产率60%。实施例3
UFmoc-Orn-OH 60 mmol 用 100 mL 二氧六环溶解，加入 NHS 129 mmol,室温反应 2 h, 反应结束后，水沉，析出固体，过滤，得白色固体Fmoc-Orn (boc)-NHS0产率95%。2Arg (Pbf)-OH 40 mmol,Fmoc-Orn (boc)-NHS 106 mmol 溶于 50 mL 乙腈，室温反应过夜，反应结束后，水洗，收集有机相，旋蒸，得淡黄色泡状固体Fmoc-Orn (boc)-Arg (Pbf)-0H。产率 75%。3、将 Fmoc-Orn (boc) -Arg (Pbf) -OH 15 mmol 溶于 40mL 甲醇中，滴力口 60 mL 氯化氢/ 二氧六环溶液，室温反应过夜，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到 Fmoc-Orn-Arg-OH。产率 65%。4、将 Fmoc-Orn-Arg-OH 20 mmol 溶于 30 mL 中二氯甲烧，滴加 40 mL 甲胺， 室温反应1 h，反应结束后加入乙醚，析出白色固体，抽滤，得到精-鸟二肽Orn-Arg (1HNMR(DMSo), 400MHz) δ 2. 93 (2Η, t, J=7. 302), 1. 32 (2H, tt, J=7. 302, J=6. 960),
51. 39 (2H, tt, J=7. 365, J=6. 960), 1. 82 (2H, tt, J=7. 434, J=7. 427), 2. 73 (2H, t,
J=7.427), 1.67 (2H, dt,
1. 87 (2H, dt, J=7. 517, J=7. 434);
J=7. 567, J=7. 365):
3. 45 (1H, t, J=7. 567)，4. 22 (1H, t, J=7. 517), 10. 83 (1H, s)。产率 50%。产品液相分析及质谱见附图。
权利要求
1.精-鸟二肽合成方法，其特征在于该方法的步骤为1)N端保护的鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺在有机溶剂中反应30 miiTlO h，反应温度-5 30 V，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，形成N端保护的鸟氨酸活泼酯；其中N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0. 7(Γ2. 50 ；2)将1)步中得到的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸，在有机溶剂中反应10 mirTl5 h，反应温度-5 30 °C，形成酰胺键，反应结束后，水洗，分离有机溶剂层，旋蒸，真空干燥，得到N端及胍基保护的精-鸟二肽；其中N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸摩尔比为0. 80 3· O ；3)将2)步中得到的N端及胍基保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入无机酸，反应温度1(T60 °C，反应广5 h，脱除胍基保护基，用乙醚沉淀，过滤得到N端保护的精-鸟二肽； 其中N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸的摩尔比为0. 5^10 ；4)将3)步中得到的N端保护的精-鸟二肽溶于有机溶剂中，加入有机碱，室温，反应 20 mirTl2 h，反应温度-5 30 °C，反应液水洗，分离有机层，旋蒸，干燥，乙醚研磨，过滤，得到精-鸟二肽，产率为3(Γ85% ；其中N端精-鸟二肽与有机碱的摩尔比为0. 5^3. O。
2.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于所述的有机溶剂选自二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、1，2_ 二氯乙烷、二甲基亚砜或氯仿中的一种。
3.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤1)中所述的N端保护的鸟氨酸为 Fmoc-Orn-OH 或 Fmoc-Orn (Boc) -0H。
4.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤1)中所述的N端保护鸟氨酸与N-羟基琥珀酰亚胺的反应优选时间范围为广6 h，优选反应温度-5 10 °C。
5.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤2)中所述的N端保护的鸟氨酸活泼酯与胍基保护的精氨酸反应的优选时间范围为;Γ7 h，优选反应温度-5 10 "C。
6.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤3)中所述的N端及胍基保护的精-鸟二肽与无机酸反应的优选时间范围为纩3 h,优选反应温度为2(T40 °C。
7.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤4)中所述的N端精-鸟二肽与有机碱的反应优选时间为1.5飞h，优选反应温度为-5 10 °C。
8.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤3)中所述的无机酸选自盐酸、三氟乙酸、含氯化氢的冰乙酸溶液、含溴化氢的冰乙酸溶液、含氯化氢的二氧六环溶液或含溴化氢的二氧六环溶液中的一种。
9.如权利要求1所述的精-鸟二肽合成方法，其特征在于步骤4)中所述的有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、乙二胺、甲胺、乙胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺或异丙胺中的一种。
全文摘要
精-鸟二肽合成方法，涉及一种含氨基酸的二肽合成方法。合成步骤为N端保护的鸟氨酸在N-羟基琥珀酰亚胺作用下生成活性酯；活性酯与胍基保护的精氨酸在碱作用下反应形成肽键；随后分别用酸、碱脱去保护基团得到精-鸟二肽。本发明首次提供了一种合成工艺和设备简单、成本低、产率高、产物容易分离提纯的精-鸟二肽合成方法，该方法具有良好的应用价值。
文档编号C07K5/068GK102190705SQ201110073099
公开日2011年9月21日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者侯洁, 高智慧 申请人:天津启仁医药科技有限公司