专利名称：一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体的说，本发明涉及一种促进蛋白类药物透皮给药的方法，本发明还涉及一种包括蛋白类药物表皮生长因子以及透皮增强肽的融合蛋白，以及该融合蛋白的应用。
背景技术：
透皮给药系统或经皮吸收系统(transdermal drug delivery systems/ transdermal thrapeutic systems，简称TDDS/TTS)，指经皮肤贴敷或涂抹方式用药，药物由皮肤吸收进入全身血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防的一种方法。其主要特点(1)透皮给药系统可避免肝脏的首过效应和药物在胃肠道的灭活，药物的吸收不受胃肠道因素的影响.减少用药的个体差异；( 维持恒定有效血药浓度或生理效应，避免口服给药引起的血药浓度峰谷现象，降低毒副反应；C3)减少给药次数，提高治疗效能， 延长作用时间，避免多剂量给药，使大多数病人易于接受；(4)使用方便，患者可以自主用药，也可以随时撤销用药。透皮增强肽TDl (中国专利申请号200610023887. 1，SEQ ID NO. 6)是首创性地将分子生物学的经典技术一 “体内噬菌体展现技术”应用到经皮给药领域，成功地找到的一个由11个氨基酸组成的“透皮增强肽”，能输运多种从前无法有效透皮的药物，包括蛋白质类的高分子亲水性药物。将该肽和胰岛素混和溶解在生理盐水中，共处理链佐霉素诱导的糖尿病大鼠的腹部裸露皮肤，可显著提高大鼠体内的胰岛素水平并降低血糖浓度。该肽亦可促进人生长激素透皮并达到较高的生物利用度。改变单个氨基酸后增强药物透皮的效果基本丧失，显示透皮增强肽高度的序列特异性。初步结果显示此肽可能作用于毛囊，短暂性地打开皮肤屏障，使大分子药物经过毛囊到达循环系统。透皮增强肽对皮肤无刺激无伤害， 不造成皮肤过敏，在已进行的安全性试验中未发现毒副作用。该项研究在世界上第一次显示由特异序列组成的短肽能有效地促进蛋白质类大分子药物透皮，所得到的透皮增强肽有望成为一个全新的透皮技术平台，用于开发多种药物，特别是蛋白质类药物的经皮给药新剂型。表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。EGF同应答细胞表面的特异受体结合。一旦结合，便促进受体二聚化并使其细胞质位点磷酸化。被激活的受体至少可与5种具有不同信号序列的蛋白结合，进行信号转导，在翻译水平上对蛋白质的合成起调节作用，从而促进细胞增殖及存活，它是一种潜在的丝裂原素。目前，表皮生长因子广泛应用于医学美容、皮肤损伤修复领域中。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种促进表皮生长因子透皮给药的方法。本发明的方法包括如下步骤(a)将人、鼠或猪的表皮生长因子DNA序列插入到表达载体上，如原核表达系统、酵母系统和哺乳动物表达系统中，通过发酵获得目的蛋白；(b)通过蛋白纯化系统将目的蛋白进行纯化，获得高纯度目的蛋白；(c)用促细胞增殖、细胞迁移与细胞增殖信号通路等方法进行表皮生长因子活性检测；(d)将不同剂型的药物分别涂抹在动物或人皮肤任意区域上，从上述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中检测表皮生长因子含量。在一个较佳的实施例中，应用本发明的方法证明携带透皮增强肽的表皮生长因子能够持续穿过皮肤屏障并达到血液以及其他组织的能力，且透过皮肤的效率明显高于天然表皮生长因子。本发明的第二个目的在于提供一种具有良好的透皮给药能力的融合蛋白。这类融合蛋白以不同组合方式进行连接，包括透皮增强肽分别与EGF的N端和C端连接，形成含多个透皮增强肽拷贝的融合蛋白。显示这些融合蛋白均有EGF活性以及增强或方便药物透皮或经皮给药能力。任何本领域的技术人员所熟知的这些蛋白质的生产技术，包括但不限于通过诸如重组技术等标准的分子生物学技术来表达蛋白质或者化学合成这些蛋白质等，都包括在本发明的保护范围之内。在一个较佳的实施例中，本发明证明了连接在表皮生长因子N端的TD-1能够提高或便于表皮生长因子通过毛孔渗透的透皮给药效果。本发明的第三个目的在于提供一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。发明中所提到的透皮增强肽 TD-I (ACSSSPSKHCG，SEQ ID N06)、TD-2 (CSSSPSKHC，SEQ ID N07)、 TD-IO (ACSSSSSKHCG, SEQ ID NO :8)、以及 TD1、TD2、TDlO 的同源物及类似物。如 TD1、TD2、 TDlO的部分的分离的核苷酸、同系物或者类似物，或者在严格条件下杂交为编码TD-1、 TD-2、TD-10或者是他们的部分所示的氨基酸序列通过GGGGS或者(GGGGS)n与人、鼠或猪的表皮生长因子的核苷酸序列连接，都具有透皮给药增强功能。本发明的第四个目的在于提供所述融合蛋白表达纯化系统的选择。利用标准分子生物学技术来表达蛋白质，在大肠杆菌系统、酵母系统、哺乳动物细胞系统中进行表达。并使用不同纯化方法，如包括采用HIS纯化系统与halotag纯化系统的亲和纯化、离子交换树脂、疏水层析以及分子筛等技术。显示获得的高纯度蛋白均有透皮给药增强功能本发明的第五个目的在于提供所述融合蛋白的应用。将融合蛋白与表皮生长因子标准品相比，通过本发明的融合蛋白可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体或者含有任何可接受的物质的赋形剂，和/或一种或多种本领域熟知的添加剂。本发明的融合蛋白液可以制成溶液和/或适于局部和/或透皮给药的剂型，和/或透皮贴片方式。本发明还提供了一种增强了药物和一种透皮给药的药物给药系统，该药物给药系统包括(a)至少一个含有一种药物和一种透皮给药增强剂的药库，该透皮给药增强剂的量能够一定数量的所属药物穿透皮肤或身体表面，以达到治疗效果而不会造成伤害；(b) 一个工具，用于维持所述系统中药物和透皮给药增强剂向皮肤或机体表面的输送关系，并且形成机体表面-系统接触面；(c) 一个衬底层，用于在所述工具的使用过程中作为外表面。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现本发明的促进蛋白类药物透皮给药的方法，包括将所述蛋白类药物与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。根据本发明，所述融合是通过采用Linker将所述蛋白类药物与所述透皮增强肽连接。根据本发明的一个优选实施例，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF;所述透皮增强肽为TD1，其序列如SEQ ID NO. 6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID NO. 7所示；或所述透皮增强肽为TD10，其序列如SEQ ID NO. 8所示；以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。优选的，所述Linker的序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示。本发明的具有良好的透皮给药能力的融合蛋白，由至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽构成。根据本发明，所述至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽通过Linker连接。根据本发明的一个优选实施例，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF;所述透皮增强肽为TD1，其序列如SEQ ID N0. 6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID N0. 7所示；或所述透皮增强肽为TD10，其序列如SEQ ID N0. 8所示；以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。优选的，所述Linker的序列如SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示。根据本发明，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。本发明的编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。本发明的融合蛋白的可用于提高蛋白类药物的透皮输运能力。本发明的有益效果本发明通过将蛋白类药物与透皮增强肽融合组成融合蛋白，显著提高了蛋白类药物的透皮输运能力，同时，此种融合蛋白与传统经皮的蛋白类药物活性相当，且无毒性。
图 1、TDl-EGF 的 PCR 片段克隆到 pFN18A halotag7 flex vector 中，替换掉 barnase基因的示意图。实例中利用N端NcoI和C端BamHI两个酶切位点处理PCR片段和载体质粒，获得含有两个不同粘性末端的DNA片段，经过粘性末端互补配对以及连接酶作用，使得PCR获得的TDl-EGF基因和pFN18A halotag7 flex vector相互连接，形成所需的重组质粒。后经PCR、酶切、测序等方法进行序列的检定。图2、纯化的TD1-EGF，EGF和购买的标准品EGF考马斯亮蓝染色。实例中分别纯化了 TDl与EGF融合的TDl-EGF蛋白，以及不含TDl的EGF蛋白，并与商业化的EGF进行比较。通过考马斯亮蓝染色对其分子量进行了初步检定，证明TDl-EGF要比EGF的分子量大一些，约8kd左右。图3、精细纯化前后TDl-EGF纯度与标准品EGF。TDl-EGF具有分子量小的特点，使用凝胶排阻技术，有效的将蛋白按照不同分子量进行分离，从而获得高纯度蛋白，图中显示最终纯化蛋白的纯度大于95%。图4、western检定TD1-EGF，分别使用TDl抗体、hEGF抗体对纯化的TD1-EGF、纯化的EGF以及商业化EGF进行检定，从图上显示使用TDl抗体进行鉴定，只有TDl-EGF条带被胶片曝光，使用EGF抗体进行鉴定，三种EGF条带胶片曝光。图5、动态光散射检测蛋白的均一度；TDl-EGF与阳性对照EGF测出的粒径大小分别为2. Inm与2. Onm,分子粒径大小相差很小，且测出的分子量均是理论分子量的两倍，分别为19KD与16KD，说明二者可能在水溶液中以二聚体形式存在。而TDl-EGF的均一度不如阳性对照，数值为12.7%。图6、蛋白的热稳定性试验；非变性检测显示TDl-EGF在24h和4 时在胶上的位置与Oh相同，说明其高级结构在高温下放置长时间并不发生改变。TDl-EGF与EGF的稳定性类似，具有良好的热稳定性图7、western鉴定融合蛋白激活细胞ERK信号通路；用TD1-EGF激活hlb/c细胞的ERK信号通路，再用ERK1/2抗体进行Wfestern Blotting检测P-ERK1/2的激活情况。 (如图)，TDl-EGF在lOng/ml时明显刺激了 ERK1/2的磷酸化，且25ng/ml时激活程度更高。 TDl-EGF对ERK1/2激活的浓度作用趋势与其对细胞的促生长活性浓度作用趋势相当。在使用相同给药浓度(lOng/ml)的TD1-EGF、阳性对照1、阳性对照2及用相同方法纯化的EGF处理细胞时，ERK1/2均被明显磷酸化，而阴性对照(Ong/ml)几乎无ERK1/2的激活。图8、MTT法检测TDl-EGF促进kibe 3T3细胞增殖(标准品作为对照)。如图， 阴性对照(Ong/ml)细胞生长处于很低的水平。但随着浓度的提高，检测到的细胞数也随着升高，并且TDl-EGF在lOng/ml时表现出明显的促细胞生长活性，且随着浓度的升高其促进作用保持稳定，在lOOng/ml时细胞数有所下降。相对于阳性对照，二者的促生长曲线基本一致，说明TDl-EGF同普通的EGF具有类似的促生长活性。图9、不同浓度TDl-EGF促进kilbc 3T3细胞迁移影响；随着TD1-EGF浓度的提高， 划线空白区段的面积也变小，在lOng/ml时表现出明显的细胞迁移现象。而阴性对照(Ong/ ml)只有极少量的细胞向空白区移动。说明TDl-EGF具有促细胞发生迁移的活性。图10、TDl-EGF与不同标准品促进balbc 3T3细胞迁移比较。图11、融合蛋白大鼠体内透皮实验；TDl-EGF组随着时间的延伸，鼠血清中的EGF 量也在升高，且45min时便比EGF组的量大，说明TDl已经发挥促透作用；而EGF组的鼠血清中EGF量一直保持在很低的水平。图12、融合蛋白大鼠体外透皮实验；在4h时TDl-EGF是EGF的4倍，表现出一定的促透效果；1 时为16倍，促透效果显著增大，二者间存在显著性差异。而在池时尚未检测到透过的EGF。因此，TDl的促透作用具有时间依赖性。图13、温度对透皮效率的影响；在4°C时TDl-EGF约是EGF的4倍，表现出一定的促透效果；37°C时约为23倍，促透效果显著增大，二者间存在显著性差异。图14、不同浓度融合蛋白的透皮量；TDl-EGF组随着给药浓度的提高，检测到的 EGF量也在升高，且前后两浓度间存在显著性差异；而EGF组则一直保持在很低的水平。因此，TDl的促透效果具有浓度依赖性。图15、融合蛋白在猪体内的透皮效果。图16、融合蛋白在人皮系统中的透皮效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验室手册》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。实施例1 重组质粒halotag-TDl-EGF的构建本实施例通过分别扩增Linker以及编码透皮增强肽序列TDl，并通过Linker连接 TDl和表皮生长因子EGF，然后插入到pFN18A halotag7 Flexi vector，构建了用于表达融合蛋白TDl-EGF的重组质粒halotag-TDl-EGF。1. UPCR 扩增 Linker 以pCR-4-TOPO-hEGF(武汉三鹰)为模板，以下列引物对为正反向引物，PCR扩增 Linker GGGGS前向引物(Primer-I-F)5' -AAGCATTGTGGGGGTGGTGGTGGTTCTAATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTC-3' ；(SEQ ID NO. 1)反向引物(Primer-R)5 ‘ -CGCGGATCCCTAGCGCAGTTCCCACCACTTC-3‘ (SEQ ID N0. 2)。PCR反应体系和条件
H20 ExTAQ反应条件
预变性温度变性温度 94 °C 退火温度 51°C 延伸温度 72 °C 30个循环(Linker 序列为 GGGGS (SEQ ID N0. 4)或 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Ν0· 5)。)1· 2、PCR 扩增 TDl 以第一轮PCR产物为模板，以下列引物对为引物，PCR扩增透皮增强肽序列TDl :g cttgttcttcttccccatctaagcattgtggg(SEQ ID NO. 6)0发明中所提到的透皮增强肽TD-I (ACSSSPSKHCG, SEQ ID N06)、TD-2 (CSSSPSKHC, SEQ ID N07) ,TD-10 (ACSSSSSKHCG, SEQ ID NO :8)、或者是它们的部分的分离的核苷酸、同系物或者类似物，或者在严格条件下杂交为为编码TD-l、TD-2、TD-10或者是他们的部分所示的氨基酸序列通过GGGGS或者(GGGGS)n与人、鼠或猪的表皮生长因子的核苷酸序列连接， 都具有透皮给药增强功能。本实施例仅以TD-I为例。
7
6.7ul O.lul
10分钟 45秒 45秒 75秒
前向引物(Primer-2-F)5' -CATG CCATGGCTTGTTCTTCTTCCCCATCTAAGCATTGTGGGGGTGGTG-3‘ ； (SEQ ID NO. 3)反向引物(Primer-R)5 ‘ -CGCGGATCCCTAGCGCAGTTCCCACCACTTC-3‘(SEQ. ID. NO. 2)。PCR反应体系和条件反应体系和条件与第一轮(1. 1)相同用2 %琼脂糖凝胶检测PCR结果。1. 3、卩0 产物克隆至？卩附8六1^1(^38 7 Flexi vectorPCR产物(TDl-EGF)经2%琼脂糖凝胶151V电压电泳30min后，用DNA胶回收试剂盒纯化(AXYGEN公司)。于37°C水浴，用NcoI和BamHI (TAKARA公司)分别酶切PCR获得的TDl-EGF基因和pFN18A halotag 7 Flexi vector (Promega公司，具有氨卞抗性基因)的N端和C端，酶切过夜；将酶切完毕的DNA用DNA胶回收试剂盒回收。酶切IOul 体系如下10 X K bufferIulPCR 产物8. 8ulNcoI0. IulBamH I0. Iul(更大体系，按照IOul体系进行扩大)将回收到的TDl-EGF和载体片段按9 1的比例混合，加入连接buffer和连接酶 (NEB公司)，于16°C连接过夜，以将TDl-EGF插入到pFN18Ahalotag7 flex vector载体中， 替换掉载体中的barnase基因(图1所示)，得到的重组质粒命名为halotag-TDl-EGF。IOul 连接体系如下10X ligase bufferIulTDl-EGF GENE8ulpFN 18A halotag7 flex vector 0. 9ulT4DNAligase0. Iul1.4、重组质粒1^1(^38-10146 转化11^赂5α感受态将重组质粒halotag-TDl-EGF转化TRANS 5 α感受态，具体过程如下3μ 1重组质粒加入到50μ 1 Trans 5 α感受态(天根生物公司)，冰上孵育 30min,立即放入42°C水浴热激90秒，再放入冰上2分钟。加入200 μ 1无抗生素新鲜培养基，在37°C摇床培养1小时。将转化好的细胞涂在含有氨苄抗生素的培养板上，37°C培养过夜。1. 5、重组质粒 halotag-TDl-EGF 的鉴定挑取在含有氨苄抗生素的培养板上长出的单克隆，加入到培养基中培养过夜后， 利用质粒抽提试剂盒(Axygen公司)提取质粒，分别用凝胶电泳、酶切、PCR、序列测定方法鉴定克隆质粒，以确定得到的重组质粒为正确。1. 6、重组质粒 halotag-TDl-EGF 转化 KRX 感受态把克隆正确的质粒halotag-TDl-EGF转化到KRX感受态(Promega公司)中，具体转化过程如下3 μ 1重组质粒加入到50 μ 1 Trans 5 α感受态细胞(KRX感受态Promega公司) 中，冰上孵育8min，立即放入42°C水浴热激18秒，再放入冰上2分钟；加入200 μ 1无抗生素新鲜培养基，在37°C摇床培养1小时；将转化好的细胞涂在含有氨苄抗生素的培养板上， 37°C培养过夜。与前面转化方法不同的是，第一步冰上孵育8分钟，水上热激18秒，其他步骤同上。实施例2 =Halotag-TDl-EGF 诱导表达挑取转化到KRX感受态上的单克隆菌落于液体LB培养基于37°C培养过夜。将菌液按1 100接种到TB培养基中，同时加入葡萄糖和鼠李糖至终浓度为0.05%。在摇床中 25°C诱导表达18小时。诱导完毕后，收集菌液，在4°C下，8000转离心10分钟，弃上清。用Ifepes Buffer 重悬菌体。用高压破碎仪破碎菌体。在4°C下，12000rpm转离心30分钟，收集上清(融合蛋白TDl-EGF存在于上清液中)。实施例3 =TDl-EGF融合蛋白的纯化及鉴定3. 1、纯化将 Halotag Resin (Promega 公司)用 20 倍体积 H印es Buffer (50mMHEPES, 150mM NaCl, PH7.5)平衡，加入细胞裂解液上清，在4°C条件下旋转孵育过夜。完毕后，用!fepes Buffer冲洗珠子，以去除非特异性结合。加入TEV蛋白酶，在4°C条件下旋转酶切过夜。完毕后，2000转离心收集酶切上清(见图2)。将G75分子筛预装柱(GE公司)用H印es Buffer平衡120min，加入酶切上清液， 在5ml/min流速下洗脱，收集第二个峰的蛋白液(见图幻。经测序融合蛋白(TDI-EGF蛋白)的核苷酸序列为(SEQ. ID. NO. 10)GCTTGTTCTTCTTCCCCATCTAAGCATTGTGGGGGTGGTGGTGGTTCTAATAGTGACTCTGAATGTCC CCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAAC TGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC,其氨基酸序列 (SEQ. ID. NO. 11)ACSSSPSKHCGGGGGSNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWEL R。现有EGF 的核苷酸序列为(SEQ. ID. NO. 9)AATAGTGACT CTGAATGTCC CCTGTCCCACGATGGGTACT GCCTCCATGA TGGTGTGTGC ATGTATATTGAAGCATTGGA CAAGTATGCA TGCAACTGTG TTGTTGGCTACATCGGGGAG CGATGTCAGT ACCGAGACCT GAAGTGGTGGGAACTGCGC。3. 2、鉴定蛋白检测及鉴定方法用BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物公司)测定蛋白浓度，将纯化好的蛋白分别稀释10倍、100倍、1000倍，取20ul加入到96孔平板中，然后将标准品蛋白分别稀释到终浓度为 Oug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、 400ug/ml、500ug/ml，在所有孔中加入200ul BCA试剂(A B = 50 1)，在37°C培养箱中培养30分钟，利用酶标仪在570nm波长下读数，经数据经过统计分析，制作出标准曲线，计算出蛋白浓度；用Tricine-SDS-PAGE方法检定蛋白纯度，去纯化的蛋白质40ul，加入变性的上样缓冲液，混合，在100°c水浴中加热10分钟。取5ul样品加入到蛋白胶的孔洞中，分别利用80V电压压缩条带，利用120V电压分离条带，待溴酚蓝刚跑出胶板时停止电泳，剥下胶块， 用考马斯亮蓝进行染色10分钟，再用甲醇脱色液进行脱色，至清晰分辨出蛋白条带；Western blot方法检定蛋白质(图4)，将Tricine-SDS-PAGE完毕后的胶块取下放入电转缓冲液中，按照夹心法方法铺好胶块以及PVDF膜，装入电转装置，在100V电压， 250mA电流下运行55分钟。电转完毕后用5%脱脂奶粉封闭1小时。之后，孵育TDl或者 EGF抗体(1 5000用)，37°C孵育2小时，完毕后用TBST清洗3次，每次10分钟。然后以兔抗作为二抗在室温下孵育1小时，用TBST清洗3次，每次10分钟。最后将PVDF膜上加入显色底物，曝光5分钟。紫外分光光度计对蛋白吸收峰进行检定(图幻将纯化的TDl-EGF与阳性对照 EGF稀释至浓度均约为50ug/ml，上样约20ul进入动态光散射仪中进行分子粒径与均一度的测定。如图5，TDl-EGF与阳性对照EGF测出的粒径大小分别为2. Inm与2. Onm,分子粒径大小相差很小，且测出的分子量均是理论分子量的两倍，分别为19KD与16KD，说明二者可能在水溶液中以二聚体形式存在。而TDl-EGF的均一度不如阳性对照，数值为12.7%。用质谱ID-LC-MS对蛋白质鉴定。用紫外分光光度计对蛋白吸收峰进行检定。检定结果经过最后一步精纯化后，蛋白纯度达到95%以上，与标准品EGF纯度相当，达到《2010药典》要求(如图3所示)。质谱鉴定出三条多肽片段与EGF序列相同，可以确定表达的正确性，具体参数如下表1和表2所示。表1、主要测试参数
权利要求
1.一种促进蛋白质类药物透皮给药的方法，其特征在于，包括将所述蛋白类药物与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合是通过采用Linker将所述蛋白类药物与所述透皮增强肽连接。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述透皮增强肽为TDl，其序列如SEQ ID NO. 6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID NO. 7所示；或所述透皮增强肽为 TD10，其序列如SEQ ID NO. 8所示；以及TD1、TD2、TDlO的同源物及类似物。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Linker的序列如SEQID NO. 4和SEQ ID NO. 5 所示。
6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽构成。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述至少一种蛋白类药物以及至少一种透皮增强肽通过Linker连接。
8.根据权利要求6或7所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白类药物为表皮生长因子EGF。
9.根据权利要求6或7所述的融合蛋白，其特征在于，所述透皮增强肽为TD1，其序列如SEQ ID NO. 6所示；或所述透皮增强肽为TD2，其序列如SEQ ID NO. 7所示；或所述透皮增强肽为TD10，其序列如SEQ ID NO. 8所示；以及TD1、TD2、TD10的同源物及类似物。
10.根据权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述Linker的序列如SEQID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5 所示。
11.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11 所示。
12.编码权利要求6-11中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQID NO. 10所示。
14.权利要求6-11中任一项所述的融合蛋白的应用，其特征在于，用于提高蛋白类药物的透皮输运能力。
全文摘要
本发明公开了一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，一种具有良好的透皮给药能力的表皮生长因子融合蛋白，所述融合蛋白的应用，以及一种编码所述融合蛋白的核苷酸序列。本发明的促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法，包括将所述表皮生长因子与一种透皮增强肽融合组成融合蛋白。本发明通过融合透皮增强短肽达到提高表皮生长因子蛋白透皮输运的能力，同时，此种融合透皮增强短肽的药物与传统药物活性相当，无毒性。
文档编号C07K19/00GK102247603SQ20111015777
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月13日 优先权日2011年6月13日
发明者张力, 汪昌丽, 温龙平, 王姗姗, 金佩佩, 阮仁全, 魏鹏飞 申请人:中国科学技术大学