抗vegfr-3抗体组合物的制作方法

专利名称：抗vegfr-3抗体组合物的制作方法
抗VEGFR-3抗体组合物本发明涉及与血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)特异性结合的抗体，特别地本文中提供了抗VEGFR-3抗体的氨基酸序列和核酸序列、药物组合物和所述抗体在治疗VEGFR-3介导的医学疾病的方法中的用途。认为内皮细胞特异性生长因子和受体主要负责刺激内皮细胞生长、分化以及某些细胞功能。一个广泛研究的生长因子家族包括血管内皮生长因子(VEGF)。VEGFR-3是在正常成年组织中的表达主要限于淋巴内皮的唯一受体酪氨酸激酶(RTK)。新生儿VEGF-C和VEGF-D与VEGFR-3特异性结合。这些蛋白质的N端和C端区域的蛋白酶剪切释放了成熟的VEGF-Can,。和VEGF-Dan,。，它们获得增加的VEGFR-3亲和力。这些配体激活VEGFR-3信号传导并且引发淋巴管生成(即新淋巴管从先前存在的淋巴管中形成)。VEGFR-3配体的表达模式显不，它们不仅参与正常血管系统的发育和维持，还参与肿瘤血管生成和淋巴管生成。另外，已经在肿瘤内部的毛细血管上检测到VEGFR-3表达。因此，抑制VEGF-C和/或VEGF-D与VEGFR-3结合的单克隆抗体(mAb)具有抑制肿瘤血管生成的潜力。此外，阻断VEGFR-3活性已经显示抑制VEGF-C增强的肿瘤淋巴管生成。在许多类型的癌症中，第一转移位点是淋巴结并且因此阻断VEGFR-3具有抑制肿瘤转移的潜力。Persaud 等人，J.Cell Science 117:2745-56(2004)描述人抗 VEGFR-3 单克隆抗体的某些特性，但是没有公开任何这类抗体的序列，也没有公开这类抗体可以结合的表位。因此仍需要结合VEGFR-3内部的新表位并且能够阻断配体结合和受体活化的高亲和力抗VEGFR-3抗体。还需要能够针对多种肿瘤类型显示抗肿瘤功效而没有明显不利副作用的抗VEGFR-3 抗体。本发明提供了与人VEGFR-3结合的抗体或其抗原结合部分，其中:a)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Pro-219单突变成Leu减少至少90% ;和b)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Val_175单突变成Ala减少至少50%。优选地，通过以下方式测定该抗体或其抗原结合片段和人或突变VEGFR-3之间的结合水平:将人或突变VEGFR-3的可溶性胞外结构域表达为具有碱性磷酸酶的融合蛋白并且随后使用碱性磷酸酶化学发光测定法确定能够与抗体结合的每种融合蛋白的量。本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂。此外， 本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂并且任选地含有至少一种其他治疗成分。本发明也提供本发明的抗体或其抗原结合部分作为药物使用。本发明额外地提供本发明的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移。
本发明还提供了治疗哺乳动物中卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的方法，所述方法包括向需要这类治疗的哺乳动物施用有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。本发明额外地提供本发明抗体或其抗原结合部分用于制造药物的用途，其中所述药物用于治疗选自卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的癌症。本发明也提供本发明的抗体或其抗原结合部分与选自顺钼、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利钼和多西紫杉醇的其他抗癌药组合，用于在治疗中同时、分别或依次使用。本发明额外地提供了治疗哺乳动物中选自卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本发明抗体或其抗原结合部分和选自顺钼、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利钼和多西紫杉醇的其他抗癌药的治疗有效组合。本发明的抗体结合哺乳动物VEGFR-3的第二免疫球蛋白(Ig)样结构域。人VEGFR-3的第二 Ig样结构域对应于全长受体的残基138至226。见Pajusola等人，CancerRes.52:5738-5743(1992)。术语“哺乳动物/人/小鼠VEGFR-3的第二 Ig样结构域”(及其变种)意在包括天然存在形式的结构域(例如，从正常条件下表达该结构域的细胞纯化)以及重组形式，例如，由天然存在或合成性点突变体或其截短形式编码的重组形式。本发明的抗体结合人VEGFR-3的第二 Ig样结构域中的表位，其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分。(这些残基的编号与全长人VEGFR-3—致，如上文Pajusola等人和EMBL数据库(登录号X68203)中所报道)。这个研究结果部分地基于以下观察:在人VEGFR-3中包含突变V175A或P219L或L221V (即置换直向同源的鼠VEGFR-3残基)消除或显著地减少本发明抗体与突变体人VEGFR-3的结合。另外，结合人VEGFR-3中表位(其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分)的本发明抗体能够阻断配体VEGF-C与VEGFR-3的结合并且因此抵消该受体的活性。因而，本发明提供了在人VEGFR-3上的新颖中和表位，其允许产生针对人VEGFR-3的新的中性抗体，所述中性抗体能够阻断人VEGF-C与该受体的结合。本发明因此提供人VEGFR-3的表位，其中P219是该表位的主要组分，V175是该表位的从属组分并且L221是该表位的次要组分。本发明也提供了抗体或其抗原结合部分，其结合包含氨基酸残基P219和V175的人VEGFR-3表位。优选地，本发明也提供了抗体或其抗原结合部分，其结合包含氨基酸残基P219、V175和L221的人VEGFR-3表位。这种表位由本发明的抗体(例如抗体I)结合，并且因此，本发明也提供与人VEGFR-3的相同表位反应的抗体或其抗原结合部分，如具有下述轻链和重链的抗体，其中所述轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列，所述重链包含SEQ IDNO:16的氨基酸序列。与人VEGFR-3的相同表位反应的抗体如本发明的某些抗体(例如抗体I)将竞争与人VEGFR-3结合，并且因此，本发明也提供与具有下述轻链和重链的抗体竞争结合至人VEGFR-3的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含SEQ ID N0:15的氨基酸序列，所述重链包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
优选地，本发明的抗体也与具有SEQ ID NO:20中所示序列的突变小鼠VEGFR-3 (其包含突变L219P)和具有SEQ ID NO:21中所示序列的突变小鼠VEGFR-3 (其包含突变A175V)结合，其中与野生型小鼠VEGFR-3(SEQ ID NO:19)的结合相比较时，与具有SEQ ID NO:20中所示序列的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于50倍，并且与野生型小鼠VEGFR-3的结合相比较时，与具有SEQ ID NO:21中所示序列的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于10倍。优选地，通过以下方式测定该抗体或其抗原结合片段和野生型小鼠或突变小鼠VEGFR-3之间的结合水平:将野生型小鼠或突变小鼠VEGFR-3的可溶性胞外结构域表达为具有碱性磷酸酶的融合蛋白并且随后使用碱性磷酸酶化学发光测定法确定能够与抗体结合的每种融合蛋白的量。优选地，本发明的抗体或其抗原结合部分具有针对人VEGFR-3的高亲和力。例如，对人VEGFR-3具有1X10_9M和5.6X 10_nM之间的Kd的抗体或其抗原结合部分，如在BIACORE 2000生物传感器上在20°C通过表面等离子体共振法测量。更优选地，这种抗体或其抗原结合部分对人VEGFR-3具有ΙΧΙΟ,Μ和5.6 X 10_ηΜ之间的Kd，如在BIACORE 2000生物传感器上在20°c通过表面等离子体共振测量。优选地，本发明提供了抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分，其以2nM和1.3nM之间的IC5tl抑制人VEGF-CaNaC与人VEGFR-3结合。优选地，本发明提供了抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分，其以IOnM和5nM之间的IC5tl抑制VEGF-C,n,。刺激的促有丝分裂反应。更优选地，这种抗VEGFR-3抗体或其抗原结合部分在如实施例5中所述的测定法中以8nM和5nM之间、最优选地以6nM和5nM之间的IC5tl抑制VEGF-Can^刺激的促有丝分裂反应。优选地，本发明 提供结合人VEGFR-3并且包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)的抗体或其抗原结合部分，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDRl、LCDR2和LCDR3 并且 HCVR 包含 CDRHCDR1、HCDR2 和 HCDR3，其中 LCDRl 包含 SEQ ID NO:1 的氨基序列，LCDR2 包含 SEQ ID NO:2 的多肽，LCDR3 包含 SEQ ID NO:3 的多肽，HCDRl 包含 SEQ IDNO:6的氨基序列，HCDR2包含SEQ ID NO:7的多肽，并且HCDR3包含SEQ ID NO:8的多肽。更优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其结合人VEGFR-3并且包含SEQID NO:5 的 LCVR 多肽和 SEQ ID NO:10 的 HCVR0更优选地，本发明提供了结合人VEGFR-3并且包含以下轻链和重链的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述重链包含SEQ ID N0:16的多肽。仍更优选地，本发明提供了结合人VEGFR-3并且包含以下两条轻链和两条重链的抗体或其抗原结合部分，其中所述两条轻链包含SEQ ID NO: 15的多肽，所述两条重链包含SEQ ID NO:16 的多肽。优选地，本发明提供了与本发明抗体竞争结合人VEGFR-3的抗体或其抗原结合部分。优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其为人抗体。优选地，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其为人工程化抗体。定义
如本文所用的术语“抗体”意指可以是完全人抗体或人工程化抗体的单克隆抗体，以及其消化片段、指定部分和变体，包括抗体模拟物、模以抗体的结构和/或功能的抗体部分或其指定片段或部分，包括保留与人VEGFR-3的第二 Ig样结构域结合的能力的单链抗体及其片段。例如，由本发明包括的能够特异性结合人VEGFR-3第二 Ig样结构域的抗体片段包括Fab片段(例如，通过木瓜蛋白酶消化)、Facb片段(例如，通过纤溶酶消化)、F(ab' )2片段(例如通过胃蛋白酶消化)和通过分子生物学技术产生的二硫键稳定的可变片段(dsFv)或单链可变片段(scFv)。抗体片段也意在包括，例如，保留与人VEGFR-3第二 Ig样结构域结合的能力的结构域缺失抗体、双体抗体(diabodies)和三体抗体(triabodies)。抗体包括了包含4条多肽链(由二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L))的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR)和重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域:CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区。来自任何脊椎动物物种的抗体轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列划分成两个明显独特的类型(称作K和λ)之一。如本文中所用，表述LCVR意在包括来自K型轻链的可变区(Vk)和来自λ型轻链的可变区(νλ)。轻链恒定区包含一个结构域CL。HCVR和LCVR区包括序列高变区，命名为互补决定区(CDR)，其间插有更保守的区域，命名为构架区(FR)。每个HCVR和LCVR由从氨基端至羧基端按以下顺序:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列的3个CDR和4个FR组成。出于本发明的目的，LCVR CDR 缩写为 LCDRl，LCDR2 和 LCDR3，且 HCVR CDR 缩写为 HCDRl、HCDR2 和 HCDR3。取决于抗体重链恒定域的氨基酸序列，抗体可以划分成不同的“类别”。存在5个主要类别的完整抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中的几种可以进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。与不同抗体类别相对应的重链恒定域分别称作α、Λ、ε、Y和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。本发明包括落入前述类别或亚类(同种型)中任意者范围内的抗体。如本文所用，“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，例如，构成这个群体的各个抗体是基本上相同的，除了可能存在的可能天然存在的突变或少数翻译后变化之外。单克隆抗体是 高度特异的，针对单个抗原位点(也称作决定簇或表位)，如本文中教导，所述抗原位点包含于哺乳动物VEGFR-3的第二 Ig样结构域中。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为通过任何特定方法产生该抗体。如本文中所用，“人抗体”指这样的抗体，它们具有与人种系免疫球蛋白序列相对应的可变区和恒定区(如 Kabat 等人,(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (目的免疫蛋白质的序列)，第 5 版，U.S.Department of Health and HumanServices, NIH Publication N0.91-3242中所述)。如本文所用，术语“人抗体”不意在包括其中从另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系衍生的CDR序列已经移植到人构架序列上的抗体。本发明的范围内包括对如本文中公开的抗体I的氨基酸序列的修饰，特别地与改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性相联系的情况下。在本上下文中，如本文所用，术语“人工程化抗体”指额外的抗体，所述抗体具有与抗体I相似的功能特性(例如在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)并且具有基本上是人的或完全是人的衍生自抗体I的在CDR周围的构架区。在本发明的情境下，基本上人的构架是与抗体I的构架区具有至少80%序列同一性的那些。优选地，这类基本上的人构架与抗体I的构架区具有至少约85%、约90%、约95%或约99%序列同一性。WO 2007/044411中描述了人种系序列。例如，种系轻链构架可以选自:A11、A17、A18、A19、A20、A27、A30、L1、L11、L12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02 和 08 并且种系重链构架区可以选自:VH2_5、VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VH1-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VH1-18、VH1-69、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-51。衍生自抗体I的人工程化抗体可以包括从抗体I的序列内部缺失残基和/或将残基插入该序列和/或置换该序列中的残基。然而，最终构建体必须保留抗体I的所需功能特征(例如，在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)。可以使用几种不同的方法产生与抗体I具有相似功能特性的人工程化抗体，其中每种方法始于抗体I (即，具有分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:10中所示LCVR和HCVR序列的抗体)作为模板或亲本抗体以产生额外的抗体。在第一方法中，将抗体I的CDR移植入与抗体I构架区具有高度序列同一性的不同人构架。新构架的序列同一性通常将与抗体I中的相应构架至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一。这种移植可以导致与抗体I相比结合亲 和力降低。如果情况是这样，可以基于由Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88,2869(1991)发表的特定标准，将这个构架在某些位置回复突变成抗体I的构架。可以如下实施考虑用于回复突变的残基的鉴定:当氨基酸落入以下标准的任一项时，正在使用的人种系序列的构架氨基酸(接纳体构架)由来自抗体I构架(供体构架)的构架氨基酸替换:(a)对于人构架在这个位置，接纳体构架的人构架区中的氨基酸是不常见的，而对于人构架在这个位置，抗体I中的相应氨基酸是常见的。(b)该氨基酸的位置紧邻于⑶R之一；或(c)构架氨基酸的任一侧链原子处于三维免疫球蛋白模型中CDR氨基酸的任一原子的约5-6埃(中心至中心)范围内。当接纳体构架的人构架区中的每一氨基酸和抗体I构架中的相应氨基酸对于人构架在那个位置处均是不常见时，这个氨基酸可以由对于人构架在那个位置常见的氨基酸替换。这些回复突变标准能够恢复抗体I的活性。在第二方法中，可以通过突变抗体I的⑶R(随机方式或以偏倚方式以避开氨基酸代码简并性)，同时保留抗体I的构架区而产生衍生自抗体I的保留抗体I的功能特性(例如在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗体。优选地，与抗体I的CDR序列相比较时，在衍生自抗体I的人工程化抗体CDR的氨基酸序列中的突变(缺失、插入和/或置换)限于人工程化抗体的CDR序列中最多3个突变、更优选地2个突变或最优选地单个突变。在多于一个突变存在的情况下，突变可以按多种不同方式在CDR序列分布。例如，全部突变可以在单个CDR序列(例如LCDR1)中出现，每个突变可以处于不同的CDR序列中或两个突变可以存在于一个CDR序列中并且第三突变存在于另一个CDR序列中。这导致产生人工程化抗体的组合文库,其中CDR序列在如上文所述的一个或多个位置突变，同时保留抗体I的构架区。可以对该文库筛选与抗体I相比具有相似或改进功能特性的额外变体。又一种产生衍生自抗体I (并且保留抗体I的功能特性，例如，在包含P219和V175的表位结合人VEGFR-3的能力)的人工程化抗体的方法是组合上文描述的两种方法并且在构架和⑶R 二者中产生变化。换而言之，将抗体I的⑶R移植入不同构架后，除了在⑶R中产生变化之外，还可以将特定构架残基回复突变。在Wu等人.(1999)，J.Mol.Biol.294:151-162中描述这种方法学的一般原理。氨基酸变化也可以改变人工程化抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。可以通过置换抗体I的一个或多个高变区残基产生置换变体。这样一种用于产生此类置换性变体的方法已知为使用噬菌体展示的亲和力成熟法。将几个高变区位点(例如6-7个位点)突变以便在每个位点产生全部可能的氨基酸置换。将如此产生的抗体变体以单价形式从丝状噬菌体粒子中展示为与每个粒子内部包装的M13的基因III产物的融合物。随后如本文中所公开那样，对噬菌体展示的变体筛选它们的生物学活性(例如结合亲和力)。本文中公开的测定法可以用来筛选衍生自抗体I的人工程化抗体以鉴定那些具有如本文中公开的具有体外和体内功能的抗体。本发明的抗体可以是分离的抗体。分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化
^ 口 PFt ο如本文所用，术语“表位 ”指抗原表面上的特定分子区域，所述分子区域能够引发免疫反应并且与这种反应产生的特异性抗体结合。表位可以是线性表位(即由均含于单一短序列段内部的连续氨基酸残基组成)或它可以是构象表位(即由这样的氨基酸残基组成，所述氨基酸残基处于抗原的线性序列的不同部分中，但是一旦抗原采取其适宜的二级和三级结构时被聚拢以形成抗体结合位点)。通常，表位由少数(例如2至5个)关键氨基酸残基构成，并且这些残基的破坏(例如通过突变成不同的氨基酸残基)导致抗原和该表位之间的结合明显减少或甚至完全消除。与本文中公开的分子“竞争”的抗体或其抗原结合片段是在与本发明分子结合的位点相同或重叠的位点结合人VEGFR-3的那些抗体或其抗原结合片段。可以例如通过抗体竞争测定法鉴定竞争性人工程化抗体或其抗原结合片段。例如，纯化或部分纯化的人VEGFR-3的样品与固相支持物结合。随后添加本发明的抗体和测试单克隆抗体或抗原结合片段，其中测试抗体或本发明的抗体是经标记的。如果标记的抗体和未标记的抗体与VEGFR-3上独立和分开的位点结合，则标记的抗体将以相同的水平结合，不论疑似的竞争抗体是否存在。然而，如果相互作用位点是相同或重叠的，则未标记的抗体将竞争并且与抗原结合的标记抗体的量将减少。如果未标记的抗体过量存在，则标记的抗体将不结合。出于本发明的目的，竞争性人工程化抗体或其抗原结合片段是减少本发明抗体的结合约50%、约60%、约70%、约80%、约85%、约90%、约95%或约99%的那些。用于实施这类竞争测定法的方法的细节是本领域熟知的并且可以在例如Harlow和Lane (1988) Antibodies:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, NewYork，第567-569页，ISBN 0-87969-314-2中找到。此类测定法可以通过使用纯化的抗体定量地进行。通过针对自身滴定一种抗体建立标准曲线，即，将相同的抗体用作标记物和竞争物。滴定未标记的竞争性单克隆抗体或其抗原结合片段抑制标记分子与平板结合的能力。将结果作图并且比较为实现所需结合抑制程度而必需的浓度。人VEGFR-3以两种形式存在，这由长度不同的mRNA转录物产生。与较短转录物编码的蛋白质相比较时，较长的转录物编码在C末端含有65个额外氨基酸残基的蛋白质，而较长的蛋白质是组织中检测到的主要形式。这两种变体在它们的N端胞外结构域是相同的。除非另外声明，否则术语“人VEGFR-3”指衍生自备选mRNA转录物的野生型人VEGFR-3的两种变体(即 SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18)。抗体I的LCVR区的核酸和相应的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NOS:4和5。抗体I的HCVR区的核酸和相应的氨基酸序列在本文中分别命名为SEQ ID NOS:9和10。抗体I的轻链的核酸和相应的氨基酸序列在本文中分别命名为SEQ ID NOS:11和
12。SEQ ID NO: 12的氨基酸残基1-19构成从多种哺乳动物宿主细胞系中表达和提取轻链是有用的，但在成熟抗体中不存在的分泌序列。抗体I的成熟轻链的氨基酸序列在本文中命名为 SEQ ID NO:15o抗体I的重链的核酸和相应的氨基酸序列分别命名为SEQ ID NOS:13和14。如轻链的序列那样，SEQ ID NO:14的氨基酸残基1-19构成从多种哺乳动物宿主细胞系中表达和提取重链是有用的，但在成熟抗体中不存在的分泌序列。抗体I的成熟重链的氨基酸序列在本文中命名为SEQ ID NO:16ο可以基于亲和力和/或亲合力确定抗体的特异性。亲和力，由抗原与抗体的解离平衡常数(Kd)代表，度量抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度。亲合力是抗体与其抗原之间结合作用强度的度量。亲合力与表位和抗体上其抗原结合位点之间的亲和力及抗体的价态有关，其 中所述的价态指特定表位的抗原结合位点数目。Kd的值越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合强度越强。本发明也提供了编码本发明抗体的重链的多核苷酸(例如抗体1-SEQ ID NO:13)或包含本发明抗体(例如抗体I)的任一个VH区或其部分或任一个VH CDR(包括其任何变体)的多核苷酸。本发明也提供了编码本发明抗体的轻链的多核苷酸(例如抗体1-SEQ IDNO:11)或包含本发明抗体(例如抗体I)的任一个VL区或其部分或任一个VH⑶R(包括其任何变体)的多核苷酸。本发明也包括表达载体，其包含本文所述的任一多核苷酸。示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、病毒和噬菌体核酸或能够在原核或真核宿主如细胞(例如，哺乳动物细胞)中复制的其他核酸分子。常见的表达载体含有用于调节本发明核酸分子的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。载体可以也含有遗传表达盒，所述遗传表达盒含有独立的终止子序列、允许载体在真核生物和原核生物二者中的复制的序列(即，穿梭载体)和用于原核和真核系统的选择标记。载体一般含有标记物以提供用于选择转化宿主的表型性状，如赋予抗生素(如氨苄青霉素或新霉素)耐药性。合适的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。代表性表达控制序列/启动子包括Iac系统、trp系统、tac系统、trc系统、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母糖酵解启动子，例如，3-磷酸甘油酸激酶启动子、酵母酸性磷酸酶启动子(例如，Pho5)、酵母α交配因子的启动子、源自人巨细胞病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺瘤病毒启动子、罗斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒和猿猴病毒的启动子(例如，SV40早期和晚期启动子)。本发明也包括含有本发明多核苷酸或载体的非人宿主如细胞。“宿主”意指非人类多细胞生物或“宿主细胞”，其指向其中导入本发明多核苷酸或载体的细胞或细胞群体。本发明的宿主细胞可以是真核细胞或细胞系，如植物、动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿类、小鼠、灵长类或人细胞或细胞系。合适的真核细胞包括酵母和其他真菌、昆虫细胞、植物细胞、人细胞和动物细胞，包括哺乳动物细胞，如杂交瘤系、COS细胞、NSO细胞和CHO细胞。“宿主细胞群”意指可以将本发明多核苷酸或载体向其中导入并表达的培养的细胞群落。构想了将支持从本发明多核苷酸或载体中表达的任何宿主细胞。本发明的宿主也可以是原核的。合适的原核宿主包括例如大肠杆菌(E.coli)，如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus),如枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)和链霉菌属(Streptomyces)。本发明也包括产生本发明抗体的方法，所述方法需要培养宿主细胞，所述宿主细胞表达编码本发明抗体的一个或多个多核苷酸，并且从培养基中回收抗体。可以使用本发明的抗体作为人类医学中的药物，通过多种途径施用。最优选地，包含本发明抗体的药物组合物用于肠胃外施用。这类药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备(见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版(1995),A.Gennaro等人,Mack Publishing C0.)并且包含如本文中公开的抗体和可药用载体、稀释剂或赋形剂。如本文所用，就本发明抗体的生物活性而言，术语“抑制”或“中和”意指基本上拮抗、禁止、防止、阻止、减慢、破坏、消除、停止、减少或逆转人VEGFR-3的生物活性(包括但不限于如本文实施例4或5中所度量的人VEGFR-3生物活性)的能力。 如本文所用，术语“治疗”或“疗法”指治疗性治疗，其中目的是防止或减缓(减轻)与疾病或病症相关的不想要的生理学变化。有益或所需的临床结果包括症状减轻、疾病或病症的程度减弱、疾病或病症的稳定(即，其中疾病或病症没有加重)、延迟或减缓疾病或病症的进展、疾病或病症的改善或缓和、疾病或病症的消退(无论是局部或总体消退)，无论是可检测的或不可检测的。“治疗”也可以意指与如果没有接受治疗的预期存活相比，延长存活。那些需要治疗的患者包括已经患有这种疾病或病症的那些以及易于患有这种疾病或病症的那些患者。本发明的组合物可以包含“治疗有效量”的本发明抗体。“治疗有效量”指以需要的剂量和时间段有效实现所需治疗结果的量。抗体的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量和抗体或抗体部分在个体中引发所需反应的能力而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体部分的任何有毒或有害作用被治疗有益作用超过。疗法可以是“一线的”，即，作为未曾接受过先前抗癌治疗的患者中的初始治疗，其单独或与其他治疗组合；或“二线的”，作为已经接受过先前抗癌治疗方案的患者中的治疗，其单独或与其他治疗组合；或 作为“三线”、“四线”治疗等，其单独或与其他治疗组合。疗法可以给予已经接受过先前治疗的患者，所述治疗已经部分获得成功，但是对于这个特定治疗是不耐受的。疗法可以也作为辅助治疗给予，即，以防止癌症在当前未检测到疾病或在手术摘除肿瘤后的患者中复发。由本发明治疗的癌包括原发肿瘤和已经通过淋巴系统转移的继发性或转移性肿瘤(包括从肺、乳腺或前列腺转移的那些)。可以治疗的癌包括未血管化或基本上未血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌可以包含非实体瘤(如白血病和淋巴瘤)或可以是实体瘤。待用本发明抗体治疗的癌症的类型包括卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌和结肠癌。另外，鉴于VEGF-C/VEGFR-3途径在促进淋巴管生成中的作用并且鉴于对大部分类型的癌症而言，第一转移部位是淋巴结，故阻断VEGF-C/VEGFR-3途径预期将抑制淋巴结转移，例如从乳腺癌、胰腺癌、胃癌或结直肠癌转移(Roberts等人，Cancer Res.，66(5)，2650-2657(2006))。抗体可以单独施用(单药疗法)或与一种或多种治疗有效的药物或疗法组合(联合疗法)。其他治疗有效的药物可以与抗体缀合、并入与抗体相同的组合物或可以作为分别的组合物施用。其他治疗有效的药物或疗法可以在施用抗体之前、在其期间和/或在其后施用。可以施用其他治疗·有效的药物以增进抗体的治疗作用或以减弱抗体的不利副作用。本文中所述的治·疗方法可以用来治疗任一合适的哺乳动物，包括灵长类如猴和人、马、奶牛、猫、犬、兔和啮齿类如大鼠和小鼠。在一个实施方案中，待治疗的哺乳动物是人。通过参考以下实施例将看到，抗体I结合人VEGFR-3上的表位，所述表位包含P219作为表位的主要组分，包含V175作为表位的从属组分并且包含L221作为表位的次要组分。另外，可以见到，抗体2 (针对鼠VEGFR-3产生的参比大鼠单克隆抗体)结合鼠VEGFR-3上包含残基L219和V221的表位。此外，这些实施例也显示抗体I对人VEGFR-3具有高亲和力(56pM)，能够阻断配体VEGF-C与VEGFR-3结合，能够阻断VEGF-C刺激的促有丝分裂反应并且在卵巢癌和HEL的体内异种移植模型中有效。最后，也可以见到，抗体2在头颈癌、乳腺癌、肺癌、RCC、胰腺癌和结肠癌的异种移植模型中有效。实施例1可以使用本领域熟知的多种合适的方法产生并纯化本发明的抗体。例如，将适宜的宿主细胞(如HEK 293EBNA或CH0)用分泌抗体的使用最佳的预定轻链对重链载体比率的表达系统或编码轻链(例如对于抗体I，SEQ ID NO: 12)和重链(对于抗体I，SEQ ID NO:14)的单一载体系统瞬时或稳定转染。使用许多常见技术中的任一技术纯化其中已经分泌有抗体的澄清培养基。例如，可以将培养基便利地施加至蛋白A或G琼脂糖凝胶FF柱，所述柱已经用相容性缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4))平衡。洗涤所述柱以除去非特异性结合组分。洗脱结合的抗体，例如，借助PH梯度(如0.1M磷酸钠缓冲液pH6.8至0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.5)进行。检测抗体级分，如通过SDS-PAGE，并且随后合并抗体级分。取决于预期用途，进一步纯化是任选的。可以使用常见技术，将抗体浓缩和/或无菌过滤。可以通过常见技术，包括大小排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石层析有效地移除可溶性聚集物和多聚体。经这些层析步骤后，抗体的纯度大于99%。可以将产物立即在_70°C冷冻或可以冻干。下文提供抗体I的CDR和可变区氨基酸序列(使用Kabat方法测定)。表1.轻链⑶R氨基酸序列
权利要求
1.与人VEGFR-3特异性结合的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID N0:2的IXDR1、SEQ ID NO:2 的 LCDR2、SEQ ID NO:3 的 LCDR3、SEQ ID NO:6 的 HCDRl，SEQ ID NO:7 的HCDR2 和 SEQ ID NO:8 的 HCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO:5的轻链可变区和SEQ ID NO:10的重链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQID NO:15的轻链和SEQ ID NO:16的重链。
4.根据权利要求3所述的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含SEQID N0:15的两条轻链和SEQ ID NO:16的两条重链。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中 a)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Pro-219单突变成Leu减少至少90%;和 b)所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Val_175单突变成Ala减少至少50%。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与人VEGFR-3的结合因人VEGFR-3的Leu-221单突变成Val减少至少50%。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其也与SEQID N0.20的突变小鼠VEGFR-3和SEQ ID N0.21的突变小鼠VEGFR-3结合，其中与野生型小鼠VEGFR-3 (SEQ ID N0.19)的结合相比较时，与SEQ ID N0.20的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于50倍，并且与野生型小鼠VEGFR-3的结合相比较时，与SEQ ID N0.21的突变小鼠VEGFR-3的结合增加多于10 倍。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体对人VEGFR-3 具有 I X KT9M 至 5.6 X 1(ΓηΜ 的 Kd，如在BIACORE 2000 生物传感器上于 20°C通过表面等离子体共振法所测量的那样。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以2nM至1.3nM 的 IC50 抑制人 VEGF-CΔΝΔc (SEQ ID NO:22)与人 VEGFR-3 结合。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体以IOnM至5nM的IC5tl抑制VEGF-C^,。刺激的促有丝分裂反应。
11.药物组合物，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分和可药用载体、稀释剂或赋形剂。
12.权利要求11中所述的药物组合物，其中所述组合物任选地含有至少一种其他治疗成分。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，用作药物。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，用于治疗卵巢癌、人红白血病、头颈癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和淋巴结转移。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，其与选自顺钼、5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利钼和多西紫杉醇的其他抗癌药组合，用于在治疗中同时、分别或依次使用。
全文摘要
本发明提供了抗VEGFR-3单克隆抗体、含有所述抗体的药物组合物和所述抗体在治疗疾病中的用途。
文档编号C07K16/28GK103080133SQ201180043057
公开日2013年5月1日 申请日期2011年9月1日 优先权日2010年9月7日
发明者B·皮托夫斯基, K·佩尔绍德, N·扎耶克 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司