专利名称：一种粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物制剂和药物，S卩，涉及粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共轭物(conjugates),尤其涉及G-CSF与聚乙二醇的新的共轭物,其适于医药用途，例如，适于治疗白细胞减少，主要是接受骨髓抑制剂化疗的病人、接受造血干细胞移植的病人、患有慢性中性粒细胞减少症的病人以及患有AIDS和其它感染的病人中的各种中性粒细胞减少症。
背景技术：
G-CSF是一种造血生长因子，其刺激粒细胞的增殖、分化和成熟(Metcalf, 1992)。外源G-CSF的介入导致外周血中性粒细胞迅速、特异性、剂量依赖性的增加(Welte等人,1985; Hartung 等人,1995)。在细菌和哺乳动物细胞中 克隆并表达了人G-CSF基因；由此，开发和纯化了多种不同的重组人 G-CSF (rhG-CSF)变体(Nagata 等人，1986; Souza 等人，1986; Komatsu 等人，1987)。有两种rhG-CSF的变体-非格司亭和来诺拉提，分别来自E.coli和CHO细胞。非格司亭由175个氨基酸组成，其是非糖基化的，并且与天然蛋白质的氨基酸序列相同，但在分子的N-末端含有一个额外的甲硫氨酸残基。来诺拉提由174个氨基酸组成，其是糖基化的，并且其氨基酸序列与天然人G-CSF完全一致。不同的rhG-CSF广品在糖基化和/或蛋白质序列上有所不同，其可用于临床上治疗化疗后的中性粒细胞减少症，自发性、先天性和周期性的中性粒细胞减少症；可以与抗生素联合或在中性白细胞减少的AIDS病人中用于治疗严重感染(Molineux，2004)。但是，rhG-CSF的临床应用已被限制，由于其快速被皮下注射位点所吸收，对蛋白水解不稳定，分布容量大，快速消除、并具有很短的血清半衰期(Mashkovsky, 2006;de Wit等人，1996)。因此，rhG-CSF必须通过每日注射的方式施用于病人才能获得最佳效果。并且要每日监控全外周白细胞计数。可以通过使用具有更长久活性的药物形式来改进G-CSF的疗效，其中天然蛋白分子以化学方法连接到单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。G-CSF的聚乙二醇化改进了药代动力学特性，增加了半衰期，减少了消除，降低了血液中的浓度波动，降低了免疫原性和毒性，增加了体内活性并增强了稳定性(Molineux, 2003;Molineux, 2004)。PEG-G-CSF共轭物的生物学特性很大程度上取决于分子量和使用的活化的mPEG的种类。活化的PEGs的活性官能团可以被附着于蛋白质的特定位点，主要是在一种胺、巯基或其他亲核的基团上。在大多数情况下，优选的修饰位点是赖氨酸的氨基基团和多肽链的N-末端(Kinstler等人，1996, Roberts等人，2002)。大范围的mPEG衍生物已被用于胺的聚乙二醇化，例如:PEG-三嗪、PEG-琥珀酰亚氨基碳酸酯，PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸，PEG三氟乙基磺酸酯，PEG-乙醛，PEG-N-羟基琥珀酰亚胺-活性酯，等)。
已有数种已知的PEG-G-CSF共轭物。美国专利US2007/0014762描述了 PEG-G-CSF共轭物的生产，使用不同的具有5000Da分子量的活化mPEG，特别是mPEG-琥珀酰亚胺基丁醇，mPEG-琥珀酰亚胺基丙酸，mPEG-琥珀酰亚胺基a-甲基丁醇。要获得共轭物，使用了来源于CHO细胞的rhG_CSF，其含有数个不同位点的氨基酸取代。偶联反应在PH7 9下进行。生成的PEG-G-CSF共轭物由数个位点异构体组成；每个异构体由赖氨酸残基的ε氨基基团和N-氨基酸的α氨基基团与一个PEG5000在不同的位点偶联。PEG-G-CSF共轭物在SP-琼脂糖柱上通过离子交换色谱纯化。该专利中没有关于获得的共轭物的活性和纯度数据。生成的共轭物的缺点如下:1、偶联到G-CSF的mPEG分子量小；2、形成数种位点异构 体，其中PEG通过不同的赖氨酸残基和N-末端氨基酸的自由氨基基团被偶联到G-CSF分子；欧洲专利EP0401384描述了 PEG-G-CSF共轭物，其使用分子量为4，500 10，OOODa的线性和分支结构的mPEG，通过不同的活性基团(琥珀酰亚胺琥珀酸，氯_s_三嗪，聚氧乙烯二氨)激活而得到。这些PEG-G-CSF共轭物在体内有更长时间的效果，延长的程度取决于偶联的PEG的分子量。具有PEG10000和未改性G-CSF的PEG-G-CSF共轭物的半衰期分别为7.05和1.79小时。产生的共轭物的缺点是:琥珀酰亚胺琥珀酸-PEG通过mPEG与琥珀酸酐反应，随后将羧酸激活形成琥珀酰亚胺酯而制备。该多聚体的骨架含有第二个酯链，其在与一种蛋白质发生偶联反应后保留。该酯链在多聚体被附着于蛋白质后高度易水解。这种水解不但导致PEG附着的减少，而且水解后保留与蛋白质上的琥珀酸酯标签可作为半抗原起作用，并导致剩余蛋白的免疫原性(Roberts, 2002)。1、氯-S-三嗪mPEG衍生物能够与赖氨酸和半胱氨酸残基的官能团发生偶联，其导致许多异构体的出现，其中有一些的特征是具有不稳定的键。并且，由于具有高毒性，目前三嗪mPEG衍生物并未得到应用(Veronese&Pasut, 2005)。欧洲专利EP0335423描述了 G-CSF与具有300 30000Da的分子量的三嗪mPEG的衍生物的共轭物。这些PEG-G-CSF共轭物具有更长时间的活性，其特异活性是未修饰的G-G-CSF 活性的 11% 到 60%。产生的共轭物的缺点是:1、低特异活性；2、使用mPEG-三嗪的衍生物，产生了大量的位点异构体，其中一些的特征是具有不稳定的键。并且，由于具有高毒性，目前mPEG-三嗪衍生物并未得到应用(Veronese&Pasut, 2005)。作为本发明的原型，选择一种描述与美国专利US5，824，784实施例2的PEG-G-CSF共轭物。该专利描述了来源于E.coli的rhG-CSF与具有6，000到25000分子量的线性mPEG的还原烧基化反应，所述mPEG具有活化的丙醒基(ALD-mPEG)。聚乙二醇化反应在pH5下进行。在酸性条件下，乙醛对N-末端α-胺具有很大程度的选择性，这是由于α-胺与其他亲核物质相比具有更低的PK值。乙醛偶联是通过希夫碱进行原位还原以获得稳定的仲胺健(Kinstler 等人,1996)。用PEG20kDa对rhG-CSF的N-末端聚乙二醇化的这种制备方法被用于开发聚乙二醇非格司亭("Neulasta")，用于治疗和预防不同的中性白细胞减少症状。单-mPEG-G-CSF共轭物通过使用SP琼脂糖凝胶HP柱的离子交换色谱进行分离。产生的纯化PEG-G-CSF共轭物的生物活性为天然G-CSF活性的68%。产生的共轭物中未修饰的G-CSF的含量不超过5%。该共轭物的药代动力学参数比未修饰的G-CSF更好。动物实验已表明，PEG-G-CSF共轭物的注射导致白细胞计数的增加，该PEG-G-CSF共轭物相对于未修饰的G-CSF延长了有效期。当使用单剂量的G-CSF PEG-共轭物，动物白细胞的含量在注射I天后达到最大值，该水平在当天保持稳定，随后在注射4天后白细胞的水平降低到基线水平。随着未修饰G-CSF的注射，在注射I天后可观察到动物血液中的粒细胞的最高水平，随后粒细胞含量迅速下降。产生的共轭物的缺点:1、获得的共轭物的特异活性低(未修饰的G-CSF活性的68%)；2、在共轭物中存在未修饰的G-CSF。
发明内容
本发明的目的是获得一种新的稳定的高度纯化的聚乙二醇化G-CSF共轭物，其具有高活性，更长的有效期，提高的稳定性，改进的药代动力学参数，具有理想的PEG分子量与特异活性的参数组合，具有高纯度且适于医用，以及基于要求保护的共轭物的适于药用的组合物。问题的解决是通过创造一种新的PEG-G-CSF的功能性活性分子，其具有G-CSF活性，其中具有30000Da分子量的线性PEG分子与G-CSF严格通过N-末端氨基酸(甲硫氨酸，methionine)的α氨基形成稳定的键而偶联,产生具有如下通式(I)的化合物:
权利要求
1.一种人粒细胞集落刺激因子与聚乙二醇的共轭物，其特征在于，具有如下结构式
2.根据权利要求1所述的共轭物，其特征在于:其中聚乙二醇的平均分子量是从30到40kDa。
3.根据权利要求2所述的共轭物，其特征在于:其中聚乙二醇的分子量是30kDa。
4.根据权利要求1所述的共轭物，其特征在于:其中的m是整数4或6。
5.根据权利要求1所述的共轭物，其特征在于:其中的N-末端基团是甲硫氨酸残基(Met)0
6.一种药物组合物，其特征在于:具有相应于粒细胞集落刺激因子的活性，含有有效量的权利要求1所述的共轭物和药学可接受的辅料。
7.权利要求6所述的药物组合物用于治疗中性粒细胞减少症的药物用途。
8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于:含有有效量的权利要求1所述的共轭物、吐温、甘露醇、三水乙酸钠、醋酸和注射用水。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于:其中的pH值是3到5。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于:其中的pH值为4。
11.一种药用试剂，其特征在于:具有相应于粒细胞集落刺激因子的活性，含有权利要求I所述的共轭物。
12.权利要求11所述的药用试剂用于治疗中性粒细胞减少症的用途。
13.—种权利要求1所述共轭物的用途，其特征在于:用于制备具有相应于粒细胞集落刺激因子活性的药用试剂。
14.一种权利要求1所述共轭物的用途，其特征在于:施用有效量的共轭物用于预防或治疗中性粒细胞减少症。
15.—种在无菌环境下密封的容器,其特征在于:含有权利要求6-11中任一项所述的液态药物组成。
16.根据权利要求15所述的容器，其特征在于:所述容器是预载药的注射器、玻璃瓶或自动注射器。
17.—种试剂盒，其特征在于:包括权利要求15所述的容器和处方信息。
全文摘要
本发明涉及药物制剂和药物，即，涉及具有通式(I)的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新的生理活性的共轭物其中n为681到1000的整数；m为≥4的整数；NαH-G-CSF为具有G-CSF活性的天然或重组多肽。本发明还涉及含有所要求的通式(I)共轭物的药物，药物组合物，通式(I)共轭物在以粒细胞集落刺激因子作为活性成分用于预防或/和治疗中性粒细胞减少症的药物中的应用，含有药物组合物的容器。
文档编号C07K14/535GK103140499SQ201180044089
公开日2013年6月5日 申请日期2011年7月19日 优先权日2010年8月13日
发明者大菊阿纳·伟尼阿迷诺夫娜·茄尔锘夫斯卡娅, 德迷特例·瓦连吉诺维奇·莫罗佐夫, 列夫·阿列克三渡罗维奇·杰尼琐夫, 耶列娜·吉尔吉耶夫娜·橹邓郭, 耶列娜·列欧尼多夫娜·莫罗唑娃 申请人:Biocad股份有限公司