专利名称：杨梅叶原花色素低聚体的超声波制备方法
技术领域：
本发明涉及功能食品领域，特别涉及食品植物化学组分领域。
背景技术：
原花色素是一类黄烷-3-醇类单体及其C4-C8或C4-C6键连接而成聚合体的多羟基酚类化合物，分子骨架为C6-C3-C6，是植物生长过程中的次生代谢产物，因在酸性介质中加热能产生花色素而得名，原花色素具有良好的抗氧化(Kim Y. J.，Yokozawa T. Modulation of oxidative stress and melanogenesis by proanthocyanidins.Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2009，32(7)，1155-1159.)、抗癌(Lu J. M.，Zhang K. Q.，Chen S.A.，Wen W. Grape seed extract inhibits VEGF expression viareducing HIF-Ialpha protein expression. Carcinogenesis. 2009，30 (4)，636-644.)、预防和治疗心血管疾病(Karthikeyan K.，Bai B. R. S.，Devaraj S. N. Cardioprotectiveeffect of grape seed proanthocyanidins on isoproterenol-induced myocardialinjury in rats. International Journal of Cardiology.2007，115，(3)，326-333.)和抗糖尿病及其并发症(Lee Y. A.，Kim Y. J.，Cho E. J. , Yokozawa T. AmeliorativeEffects of Proanthocyanidin on Oxidative Stress and Infl animation inStreptozotocin-Induced Diabetic Rats. Journal of Agricultural and FoodChemistry 2007，55，9395-9400.)等生物活性，已广泛的应用于食品、化妆品和医药等领域。原花色素的生物活性跟其聚合度密切相关，聚合度大于5视为多聚原花色素。因其分子量较大和位阻效应影响了酚羟基的活性，导致其生物活性降低，而天然植物中的原花色素多以多聚体形式存在，因此，原花色素的降解研究受到广泛关注。目前，研究较多的原花色素的降解方法有催化氢、解亚硫酸降解的化学方法(杜晓，唐伟，廖学品.落叶松多聚原花色素的Pd/C催化氢解反应研究.化学研究与应用，2005，17 (4) :456;田亚新，王运来，韩晓云，刘继伟，康传红.亚硫酸法降解沙棘籽原花色素的条件优化，东北林业大学学报，2012，40 (I) =108-113)和微生物降解的方法(王恒永，真菌降解沙棘原花色素的初步研究，黑龙江大学[硕士论文]，哈尔滨2010，5. 7)。经研究发现杨梅叶原花色素含量非常高(约110mg/g Dff)，结构鉴定发现主要为原飞燕草素；没有发现用超声波来制备杨梅叶原花色素低聚体的研究和报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，采用本发明的方法能获得大含量的聚合度< 4的杨梅叶原花色素低聚体。为了解决上述技术问题，本发明提供一种杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，包括以下步骤I)、在容器中加入纯度(即质量含量)> 50%的杨梅叶原花色素提取物和作为溶剂的乙醇，得混合料液；将所述混合料液于-5 50°C的温度、20khz超声频率下超声处理30 80分钟； 纯度> 50%的杨梅叶原花色素提取物与乙醇的用量比为10g纯度> 50%的杨梅叶原花色素提取物/20 40ml乙醇；2)、将步骤I)所得产物经过滤，所得的滤液进行色谱分离，得杨梅叶原花色素低聚体。作为本发明的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法的改进，步骤I)中的超声处理为装有混合料液的容器被置于低温恒温槽中，选用探头式脉冲超声波仪器，探头插入混合料液的液下I L 5cm,混合料液的深度(即液面高度)保持4 8cm，脉冲时间为I 4s，占空比为30% 90%，低温恒温槽中控制温度为-5 50°C，声强为60. 55 544. 59W/cm2，处理时间为30 80分钟。作为本发明的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法的进一步改进，步骤2)中的色谱分离为液相色谱仪为Agilent llOOSeries，检测器为UV检测器，检测波长为280nm，色谱柱为 Luna Silica(250X4. 6mm, i. d. 5- u m, Phenomenex Inc. , Darmstadt, Germany),进样量为lOiiL，流速(梯度洗脱的流速)为lmL/min，柱温为37°C ；流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，流动相C为乙酸与水按I : I的体积比混合而得；梯度洗脱中流动相C的体积浓度恒定为4% ；0 20min时，流动相B的体积浓度为14 23. 6% ；20 50min时，流动相B的体积浓度为23. 6 40% ;50 55min时，流动相B的体积浓度为40 86% ；55 60min时,流动相B的体积浓度为86% ；60 65min时，流动相B的体积浓度为86 14% ；收集30 60min时间段内的洗脱液冷冻干燥至恒重后，得杨梅叶原花色素低聚体。作为本发明的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法的进一步改进探头的直径为10_，容器为深色不透明容器(目的是避免光照引起的氧化)。作为本发明的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法的进一步改进当低温恒温槽中控制温度为-5V、声强为200W/cm2、处理时间为60分钟时，所得的杨梅叶原花色素低聚体以聚合度为2的为主；当低温恒温槽中控制温度为40°C、声强为lOOW/cm2、处理时间为70分钟时，所得的杨梅叶原花色素低聚体以聚合度为4的为主。在本发明中，洗脱液冷冻干燥的条件为-45 -55 °C,时间一般为20 28小时。本发明的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，不同低聚体含量可以通过温度、声强、作用时间得到有效控制。在本发明中，聚合度采用NP-HPLC-DAD的方法进行检测。
在本发明中，探头式脉冲超声波仪器的功率变化范围为0-950W。本发明所用的纯度(质量含量)> 50%的杨梅叶原花色素提取物，例如可按照已经公开发表的 Yang, HH ；Ye, XQ ；Liu, DH ；Chen, JC ；Zhang, JJ ；Shen, Y ；Yu, DCharacterization of Unusual Proanthocyanidins in Leaves of Bayberry (Myricarubra, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011, 59 (5) : 1622-1629 进行制备。
本发明具有如下优点及效果I、可用于不同品种杨梅叶子中的原飞燕草素(即不同品种的杨梅所得的杨梅叶原花色素提取物)的低聚体的制备；2、具有环保、方便、易控制降解比率的优点。3、所得低聚体可用于不同聚合度原飞燕草素的生物活性功效的评价。
具体实施例方式实施例I、一种杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，依次进行以下步骤I)、称取IOmg纯度(质量含量)彡50%的杨梅叶原花色素提取物；加入到装有30ml乙醇的棕色样品玻璃管中；得混合料液。上述杨梅叶原花色素提取物是从荸荠品种的杨梅叶中获取的，经酸催化降解后采用HPLC法事先检测平均聚合度为8.0，主要为聚合度为2的占22%，聚合度为3的占21%，聚合度为4的18%，聚合度大于4的占39%。装有混合料液的棕色样品玻璃管置于低温恒温槽中，选用探头式脉冲超声波仪器(超声频率为20khz)，探头(探头的直径为IOmm)插入混合料液的液下lcm(即探头的顶端距液面为Icm)，混合料液的深度保持4cm，脉冲时间为2s，占空比为66. 7%，低温恒温槽中控制温度为_5°C，处理时间为60分钟，声强为180W/cm2 (即超声波仪器的功率为180W)。2)、将步骤I)所得产物经过滤，所得的滤液进行色谱分离，色谱分离条件具体为液相色谱仪为Agilent llOOSeries，检测器为UV检测器，检测波长为280nm，色谱柱为 Luna Silica(250X4. 6mm, i. d. 5- u m, Phenomenex Inc. , Darmstadt, Germany),进样量为10iiL，流速(梯度洗脱的流速)为lmL/min，柱温为37°C，流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，流动相C为乙酸与水按I : I的体积比混合而得；梯度洗脱中流动相C的体积浓度恒定为4% ；0 20min时，流动相B的体积浓度为14 23. 6% ;其余为流动相A ；20 50min时，流动相B的体积浓度为23. 6 40% ;其余为流动相A ；50 55min时，流动相B的体积浓度为40 86% ;其余为流动相A ；55 60min时，流动相B的体积浓度为86% ;其余为流动相A ；60 65min时，流动相B的体积浓度为86 14% ;其余为流动相A ；收集30 60min时间段内的洗脱液冷冻干燥(_51°C冷冻干燥约24小时)至恒重后，得杨梅叶原花色素低聚体4mg。经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，90%为聚合度< 4的低聚体。
实施例2、将实施例I中的低温恒温槽中控制温度由_5°C改成15，声强由180W/cm2改成300W/cm2，处理时间由60分钟改成50 ;其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3mg。
经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，67%为聚合度< 4的低聚体。实施例3、将实施例I中的低温恒温槽中控制温度由_5°C改成45°C，声强由180W改成400W，处理时间由60分钟改成70分钟；其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3. 5mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，79%为聚合度< 4的低聚体。实施例4、将实施例I中的液面高度(即混合料液的深度)由4cm改为6cm，脉冲时间为2s改为4s，占空比由66. 7%改成90%，其余完全同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体2. 8mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，63%为聚合度< 4的低聚体。实施例5、将实施例I中的液面高度(即混合料液的深度)由4cm改为8cm，脉冲时间为2s改为5s，占空比由66. 7%改成30%，其余完全同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体2. 75mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，62%为聚合度< 4的低聚体。实施例6、将实施例I中的杨梅叶原花色素提取物改成是从炭梅品种的杨梅叶中获取的，该杨梅叶原花色素提取物经酸催化降解后采用HPLC法事先检测平均聚合度为
9.6，主要为聚合度为2的占22%，聚合度为3的占17%，聚合度为4的占19%，聚合度大于4的占42%。其余完全同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3. 8mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，85%为聚合度< 4的低聚体。实施例7、将实施例I中的杨梅叶原花色素提取物改成是从乌紫品种的杨梅叶中获取的，该杨梅叶原花色素提取物经酸催化降解后采用HPLC法事先检测平均聚合度为
10.1，主要为聚合度为2的占21%，聚合度为3的占17%，聚合度为4的占17%，聚合度大于4的占45%。其余完全同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3. 6mg0经HPLC法检测法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，81%为聚合度< 4的低聚体。对比例I、将实施例I中的溶剂由乙醇改成甲醇，其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体2. 8mg。经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，63%为聚合度< 4的低聚体。对比例2、将实施例I中的溶剂由乙醇改成丙醇，其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3. 2mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，72%为聚合度< 4的低聚体。对比例3、将实施例I中的脉冲时间由2s改成500ms，其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体2. 7mg0
经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，61%为聚合度< 4的低聚体。对比例4、将实施例I中的脉冲时间由2s改成6s，其余同实施例I。最终得杨梅叶原花色素低聚体3. 9mg0经HPLC法检测，上述杨梅叶原花色素低聚体中，76%为聚合度< 4的低聚体。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认 为是本发明的保护范围。
权利要求
1.杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，其特征是包括以下步骤 1)、在容器中加入纯度>50%的杨梅叶原花色素提取物和作为溶剂的乙醇，得混合料液；将所述混合料液于-5 50°C的温度、20khz超声频率下超声处理30 80分钟； 所述纯度> 50%的杨梅叶原花色素提取物与乙醇的用量比为10g纯度> 50%的杨梅叶原花色素提取物/20 40ml乙醇； 2)、将步骤I)所得产物经过滤，所得的滤液进行色谱分离，得杨梅叶原花色素低聚体。
2.根据权利要求I所述的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，其特征是，所述步骤I)中的超声处理为 装有混合料液的容器被置于低温恒温槽中，选用探头式脉冲超声波仪器，探头插入混合料液的液下I I. 5cm,混合料液的深度保持4 8cm,脉冲时间为I 4s,占空比为30% 90%，低温恒温槽中控制温度为-5 50°C，声强为60. 55 544. 59W/cm2，处理时间为30 80分钟。
3.根据权利要求2所述的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，其特征是所述步骤2)中的色谱分离为 液相色谱仪为Agilent 1100 Series，检测器为UV检测器，检测波长为280nm，色谱柱为Luna Silica，进样量为lOyL，流速为lmL/min，柱温为37°C ； 流动相由流动相A、流动相B和流动相C组成，流动相A为二氯甲烷，流动相B为甲醇，流动相C为乙酸与水按I:I的体积比混合而得； 梯度洗脱中 流动相C的体积浓度恒定为4% ； 0 20min时，流动相B的体积浓度为14 23. 6% ； 20 50min时，流动相B的体积浓度为23. 6 40% ; 50 55min时，流动相B的体积浓度为40 86% ； 55 60min时，流动相B的体积浓度为86% ； 60 65min时，流动相B的体积浓度为86 14% ； 收集30 60min时间段内的洗脱液冷冻干燥至恒重后，得杨梅叶原花色素低聚体。
4.根据权利要求3所述的杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，其特征是所述探头的直径为10_，所述容器为深色不透明容器。
全文摘要
本发明公开了一种杨梅叶原花色素低聚体的制备方法，包括以下步骤1)、在容器中加入纯度≥50％的杨梅叶原花色素提取物和作为溶剂的乙醇，得混合料液；将混合料液于-5～50℃的温度、20khz超声频率下超声处理30～80分钟；纯度≥50％的杨梅叶原花色素提取物与乙醇的用量比为10g纯度≥50％的杨梅叶原花色素提取物/20～40ml乙醇；2)、将步骤1)所得产物经过滤，所得的滤液进行色谱分离，得杨梅叶原花色素低聚体。采用本发明的方法能获得大含量的聚合度≤4的杨梅叶原花色素低聚体。
文档编号C07D311/62GK102643259SQ20121010552
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者刘东红, 叶兴乾, 吴丹, 孙玉敬, 杨海花, 钟烈洲, 陈健初 申请人:浙江大学