具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽缀合物的制作方法

专利名称：具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有延长的体内半衰期的长效蛋白及其制备方法。
背景技术：
多肽在血液、肝脏或肾脏内容易发生变性或酶解。因为多肽的低稳定性，为了保持活性物质的有效血浆浓度，所以要求以持续的频率施用对患者施用多肽药物。此外，因为多肽药物通常是通过注射被施用.施用，所以多肽药物的频繁注射给患者造成了相当的不便。因此，已有许多研究在开发具有被提高的血液循环半衰期并同时保持其高药理功效的多肽药物。这些想得到的多肽药物也应当满足了对提高的血清稳定性、高活性、对各种多肽的可应用性以及当注射到患者体内时诱发非所需的免疫应答的低可能性的要求。用于提高蛋白质稳定性的最常用的方法之一是用高度可溶的大分子，例如聚乙二醇(“PEG”)，对多肽进行化学修饰，该大分子阻止了多肽与蛋白酶的接触。也熟知的是当PEG被特异地或非特异地连接到多肽药物时，PEG增加了多肽药物的可溶性并防止其被水解，从而增加了多肽药物的血清稳定性，并且因为它的低抗原性而不引起任何免疫应答(Sada et al. , J. Fermentation Bioengineering, 1991，71:137-139)。但是，这些 PEG 化(pegylated)多肽所具有的缺点是当PEG的分子量增加时降低了活性物质的活性和产量。在US5，738，846和WO 92/16221中分别公开了与两个被激活的PEG缀合的干扰素和被连接到两个具有不同活性的多肽上的PEG间隔物；但是在延长生理学活性多肽的体内活性方面，它们没有显示出任何突出的效果。也报道了通过经异质双功能(hetero-bifunctional) PEG将重组人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)共价连接到白蛋白上可延长G-CSF的循环半衰期(Kinstler et al.，Pharmaceutical Research, 1995，12(12) : 1883-1888)。但是，经修饰的 G-CSF-PEG-白蛋白的稳定性只比真G-CSF (authentic G-CSF)高4倍，因此它还不能被投入到实践应用中。作为另一种增强生理学活性多肽的体内稳定性的方法，通过利用重组技术在转化体中生成了与稳定的蛋白质融合的活性多肽。例如，已知白蛋白是用于增强与其融合的多肽的稳定性的最有效的蛋白质中的一种，已经报道的这样的融合蛋白有很多(W093/15199和TO93/15200，和EP413，622)。但是，与白蛋白结合的融合蛋白仍有活性被降低的问题。US5，045，312公开了一种为了增强生长激素的活性，使用交联剂，例如碳化二亚胺、戊二醛、酰基氯等将生长激素缀合到牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白上的方法。但是，这一方法是单独地针对于增强靶生长激素的活性。另外，使用化学化合物例如碳化二亚胺、戊二醛、酰基氯等作为交联剂是不利的，这是由于它们强烈的毒性和反应的非特异性。已经报道了免疫球蛋白能用作抗体以呈现出依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的细胞毒性(⑶C)的抗体，糖链在ADCC及⑶C中发挥了重要作用(BurtonD. ,Molec. Immun. 22, 161-206，1985)。尽管缺失糖链，无糖基化免疫球蛋白具有与糖基化免疫球蛋白相似的血液半衰期，但是由于去糖基化，它对补体或受体的亲和力下降了 10 到 1000 倍(Waldmann H. , Eur. J. Immnunol. 23, 403-411, 1993 ; Morrison S. , J.Immunol. 143, 2595-2601，1989)。尽管在将生理学活性多肽与各种大分子进行组合方面已经进行了很多的尝试，但是所有的尝试都不能达到同时增加稳定性和活性。作为一种用于增强活性多肽的稳定性并同时保持其体内活性的改进方法，本发明提供了一种蛋白质缀合物，其包括彼此共价连接的一种生理学活性多肽、一种非肽聚合物和一种免疫球蛋白缀合物。发明概述因此，本发明的第一个目的是提供一种具有体内半衰期被延长的生理学活性多肽的、且不诱导患者体内的免疫应答、同时将多肽活性的减低最小化的蛋白质缀合物。本发明的另一个目的是提供一种用于制备包括共价连接的一种生理学活性多肽、一种生物相容性的4M太聚合物和一种免疫球蛋白的蛋白质缀合物的方法。本发明的另一个目的是提供一种包括具有延长的体内半衰期的所述的生理学活性多肽的药物组合物。本发明的另一个目的是提供一种增强生理学活性多肽的体内稳定性并延长其循环半衰期且不牺牲其活性的方法。


结合附图，根据本发明以下的描述，本发明的上述以及其他的目的和特征将是显而易见的，所述各附图如下图I :hGH-PEG-IgG缀合物的层析；图2 hGH-PEG-IgG 缀合物的 SDS-PAGE 结果；图3 :干扰素-PEG-IgG缀合物的SDS-PAGE结果；图4 :在DDT处理之前和之后的hGH-PEG-IgG缀合物的SDS-PAGE结果； 图5 : IFN a -PEG-IgG缀合物的反相HPLC层析；图6 hGH-PEG-IgG缀合物的质谱；图7 :显示hGH-PEG-IgG缀合物具有优于PEG_hGH复合物的血清稳定性的药物代谢动力学图。图8 :显示促红细胞生成素-PEG-IgG缀合物相对于游离的促红细胞生成素或通过高糖基化稳定的促红细胞生成素，具有增强了的循环半衰期的药物代谢动力学图；图9 :无糖基化IgG (AG IgG)的质谱；图10 :显示IFN a -PEG-AG IgG缀合物相对于野生型IFN a具有增强了的血液稳定性，并且尽管缺失了糖链但保持了它的活性的药物代谢动力学图；图11 :显示EPO-PEG-AG IgG缀合物相对于比野生型IFN a具有增强了的血液稳定性，并且尽管缺失了糖链但保持了它的活性的药物代谢动力学图；图12 :显示 Fab’ -S-PEG-N-IgG 和 Fab’ -N-PEG-N-IgG 缀合物相对于野生型 Fab’ 和Fab' -S-40K PEG复合物具有增强了的循环半衰期的药物代谢动力学图13 :显示 Fab’、Fab’ -S-40K PEG 复合物、Fab’ -S-PEG-N-IgG 缀合物和Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物的体内活性。图14 :基于仅注射载体(30ii g/天，组I)、野生型hGH (30 ii g/天，组2)、hGH_PEG(30u g/ 天，组 3)、hGH-PEG-IgG 缀合物(30 u g/ 天，组 4)和 hGH-PEG-IgG 缀合物(IOu g/天，组4)之后鼠的时间依赖性的体重变化的hGH-PEG-IgG缀合物的体内活性。图15 :基于在未处理组(组I)、仅注射载体(组2)、野生型G-CSF (组3)、20kDaPEG-G-CSF (组4)、和17S-G-CSF-PEG-IgG缀合物治疗(组5)中的时间依赖性的中性粒细胞数目变化的G-CSF-PEG-IgG缀合物的体内活性；和图16 :基于在仅注射溶剂(组I)、野生型EPO (组2)、高糖基化的EPO (组3)、和EPO-PEG-IgG缀合物治疗(组4)中的时间依赖性的红细胞比容的数目变化的EPO-PEG-IgG缀合物的体内活性。 具体实施方案本文所用术语“生理学活性多肽”是指当对包括人在内的哺乳动物施用时，任何具有有益的生物学活性的多肽或蛋白，它与术语“生理活性蛋白”、“活性蛋白”、“活性多肽”或“肽药物”可互换使用。术语“蛋白质缀合物”或“缀合物”是指一种包括根据本发明彼此共价连接的一种生理学活性多肽、一种非肽聚合物和一种免疫球蛋白的化合物。区别于术语“缀合物”，本文所用术语“复合物”的意思是那些仅包括选自一种生理学活性多肽、一种免疫球蛋白和一种非肽聚合物中的两种成分的化合物。术语“非肽聚合物”是指一种包括至少两种单体的生物相容性聚合物，其中所述单体通过任何不同于肽键的共价键连接在一起。根据本发明的一个方面，提供了一种蛋白质缀合物，其包括i) 一种生理学活性多肽，ii) 一种非肽聚合物，以及iii) 一种免疫球蛋白，它们是彼此共价地连接的，并且生理学活性多肽的体内半衰期被延长。例如，发明的蛋白质缀合物可以包括至少一个单位结构的[活性多肽/非肽聚合物/免疫球蛋白]，其中所有的成分以线性形式被共价连接。非肽聚合物可以在其两个末端具有两个反应基团，通过这两个反应基团聚合物分别被共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。在一个优选的实施方案中，两种生物活性多肽和非肽聚合物的复合物可被共价地连接到免疫球蛋白上。生理学活性多肽对免疫球蛋白的摩尔比的范围可以从1:1到10:1，优选地为1:1到 4:1。一种类型的聚合物以及不同类型的聚合物的组合可被用作为非肽聚合物。 在本发明的蛋白质缀合物中，免疫球蛋白的合适的结合位点可以包括免疫球蛋白的可变区或恒定区的氨基酸残基的游离功能基团。用于与非肽聚合物或活性多肽共价结合的免疫球蛋白的合适位点可以包括可变区内的氨基末端基团、赖氨酸残基或组氨酸残基的氨基、半胱氨酸的游离SH基团，非肽聚合物的合适的位点是末端的反应基团。免疫球蛋白可以选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM及其组合和IgG的所有亚型如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。为了不诱导患者体内的免疫应答，免疫球蛋白优选是人免疫球蛋白。
作为构成本发明的蛋白质缀合物的一种成分，免疫球蛋白可以是分离自血液的天然免疫球蛋白或是通过遗传工程所制备的重组免疫球蛋白。用氨基酸残基的取代、缺失或添加在免疫球蛋白中的不同位点修饰的任何免疫球蛋白及其任何高糖基化、低糖基化或无糖基化的衍生物也可以被用于本发明，只要这些免疫球蛋白或衍生物在其功能、结构和稳定性方面完全等价于野生型免疫球蛋白。用任何一种传统方法例如化学的方法、酶的方法和生物技术的方法可以实现糖基化或去糖基化程度的增加或减少。已知免疫球蛋白G的第214到238位、297到299位、318到322位和327到331位氨基酸残基是结合的重要位点，可被用作用于修饰的合适位点。合适的非肽聚合物具有选自由乙醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组的反应基团。琥珀酰亚胺衍生物可以选自由琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基和琥珀酰亚胺基碳酸酯所构成的组。在其两末端具有乙醛基的非肽聚合物可有效地使非特异结合最小化，从而在该聚合物的每个末端分别将非肽聚合物与生理学活性多肽和免疫球蛋白相连接。乙醛基的还原烷基化所生成的蛋白质缀合物比 用酰胺基所结合的蛋白质缀合物更为稳定。非肽聚合物的两个末端的反应基团可以是彼此相同的或不同的。例如，非肽聚合物可以在一个末端具有马来酰亚胺基团，在另一个末端具有马来酰亚胺基团、乙醛基或丙醛基。当聚乙二醇被用作非肽聚合物时，商品化可获得的产品可被用于制备本发明的蛋白质缀合物；或在结合反应之前，商品化的PEG的末端羟基可被进一步转化成其他的反应基团。非肽聚合物可以用作间隔基，它分别共价连接免疫球蛋白的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基以及生理学活性多肽的其中一个反应基团。非肽聚合物是优选地选自由聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、聚(乳酸-乙醇酸)、可生物降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及其组合所构成的组。本领域已知的上述非肽聚合物的衍生物可被用于相同的目的。更优选的非肽聚合物是聚乙二醇。非肽聚合物的分子量可以从500到100，000，优选地从500到20，000。先前所报道的用于通过基因克隆将两种多肽结合起来的交联剂，例如寡肽，增加了非所需的免疫应答的可能性并将结合位点限定于所述多肽的N末端或C末端。因此，使用非肽聚合物相对于使用寡肽的其中一个优点在于毒性和免疫原性的减低。另一个优点是结合位点的多样性所造成的它的广泛的可适用性。当小的化学化合物，例如碳化二亚胺和戊二醛被用作交联剂时，可以造成将被连接其上的多肽的变性或可以阻碍产物的可控的结合及纯化。与这些化学品相反，在控制所形成的缀合物的结合、纯化缀合物以及使非特异结合反应最小化的容易性方面，包括一种非肽聚合物的本发明的蛋白质缀合物是有优势的。本发明的蛋白质缀合物显示出延长的体内半衰期以及明显优于多肽-PEG复合物或多肽-PEG-白蛋白质缀合物的活性。根据药物代谢动力学分析，本发明的hGH-PEG-IgG缀合物的半衰期比野生型hGH长约13倍，而hGH-PEG复合物和hGH-PEG-白蛋白缀合物的半衰期分别比野生型蛋白长7倍和5倍(见测试实施例2，表3)。从用G-CSF、17S-G-CSF、干扰素或EPO取代hGH的测试中得到了相似的结果。与仅被PEG修饰或PEG-白蛋白复合物所修饰的活性多肽复合物相比较，本发明的蛋白质缀合物在平均滞留时间(“MRT”)和血清半衰期上都表现出相当大的增加，它们比传统复合物的MRT和血清半衰期要高出2-70个因子(见测试实施例2，表4-7)。另外，本发明的Fab’ -PEG-IgG缀合物，即其中IgG-PEG复合物被分别连接到邻近于Fab’的C末端或Fab的N末端的SH基团的Fab’ -S-PEG-N-IgG和Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物，呈现其血清半衰期比Fab’ -S-40K PEG复合物的血清半衰期高
2-3倍(见测试实施例3和图12)。另外，通过采用无糖基化免疫球蛋白所制备的蛋白质缀合物表现出与那些相应的包括糖基化免疫球蛋白的蛋白质缀合物相似的血液半衰期和体内活性(见表4、7和9，以及图10和11)。药物代谢动力学分析的结果表明应用于不同的多肽的本发明的蛋白质缀合物在 血液半衰期和MRT方面表现出极好的性能特征，因此可以被有利地用于制备具有延长的体内半衰期的多肽药物剂型，所述不同的多肽包括hGH、干扰素、EPO、G-CSF或它们的衍生物和抗原片段。另外，根据使用动物模型的体内试验，本发明的hGH-PEG-IgG缀合物表现出极好的体内活性。具体地，通过以对应于1/3野生型剂量的量每6天给药hGH-PEG-IgG缀合物一次所产生的效果等同于或优于每天给药野生型所产生的效果，这意味着hGH-PEG-IgG缀合物的体内活性比野生型的体内活性高超过3倍(见图14 )。本发明的17S-G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物呈现出比20kDa PEG-G-CSF复合物高3倍的体内活性；对于相同的给药总量，当每5天给药I次时，它所产生的恢复中性粒细胞的疗效比每日给药的野生型G-CSF高2倍(图15)。此外，本发明的EPO-PEG-IgG缀合物诱导了比野生型EPO和高糖基化EPO更高和更快的红细胞比容水平的增加速度并且长时间地保持这样高的体内活性(图16)。这些结果表明本发明的蛋白质缀合物显著地增加了生理学活性多肽的血液半衰期和体内活性，同时克服了野生型多肽需频繁给药的问题。生理学活性多肽的实例类型包括以下的多肽、突变蛋白和它们的其他类似物激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体。适合于制备本发明的蛋白质缀合物的生理学活性多肽的特定的实例包括人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素(例如干扰素a、0和Y)、集落刺激因子、白介素(例如白介素-I, _2，_3，-4，-5，-6，-I, -8，-9，-10，-11，-12，-13，-14，-15，-16，-I7，-18，-19，-20，-21，-22，-23，-24，-25，-26，-27，-28，-29和-30)、葡糖脑苷脂酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、a -I抗胰蛋白酶、白蛋白、载脂蛋白E、促红细胞生成素、高糖基化的促红细胞生成素、VII因子、VIII因子、IX因子、纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素(leptin)、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、成骨生长因子、成骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心房肽(atriop印tin)、软骨诱导因子、结缔组织激活蛋白、促卵泡激素、促黄体素、FSH释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、胰泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、促肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、受体(例如，TNFR(P75)和TNFR(P55))、受体拮抗剂(例如 ILl-Ra)、细胞表面抗原(例如，CD2，3,4, 5，7，11a, Ilb, 18，19，20，23，25，33，38，40，45和69)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段和病毒来源的疫苗抗原。抗体片段指的是能结合特异性抗原的抗体的片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd和scFv，其中优选Fab’。Fab片段由抗体的轻链和重链的可变区及第一恒定区(ChI区)组成；Fab’片段为Fab片段加上连接到ChI区的C末端的几个含有一个或多个来自绞链区的半胱氨酸残基的氨基酸残基；F(ab’)2片段是通过二硫键或通过化学反应彼此连接起来的两个Fab’片段；Fd片段是重链的可变区和第一恒定区(CJ)。scFv片段是由通过连接肽彼此连接的重链和轻链的可变区所构成的单多肽链。特别优选的多肽是一种选自由人生长激素、干扰素(例如干扰素a、P和Y )、粒细胞集落刺激因子和促红细胞生成素所构成的组的多肽，这是因为为了治疗或预防相关疾病的目的，这些多肽比其他的多肽更需要频繁给药这一事实。可应用本发明的生理学活性多肽的列表并不限定于上述所引用的多肽，还包括它 们的任何突变蛋白或衍生物，因为这些突变蛋白或衍生物的功能、结构、活性和稳定性被认为是等价于或优于野生型多肽的。本发明的另一方面是提供一种制备所述蛋白质缀合物的方法，该方法包括以下步骤(a)将非肽聚合物至少一种生理学活性多肽、至少一种免疫球蛋白与至少一种其两个末端具有反应基团的非肽聚合物共价地连接；(b)分离主要包括共价连接的生理学活性多肽、免疫球蛋白和非肽聚合物的蛋白质缀合物。在上述方法的步骤(a)中，可以用两步反应或同步反应共价地连接多肽、免疫球蛋白和非肽聚合物。两步反应(例如，将非肽聚合物共价地连接到活性多肽或免疫球蛋白上，然后将所形成的复合物共价地连接到活性多肽或免疫球蛋白上以产生它们的缀合物，其中活性多肽和免疫球蛋白是经非肽聚合物彼此连接)在减少非所需的副产物的产量上是有优势的。因此，上述方法的步骤(a)可以包括(al)将非肽聚合物的一个末端与免疫球蛋白或生物活性多肽共价地结合非肽聚合物；(a2)从反应混和物中分离出包括与免疫球蛋白或生理学活性多肽相结合的非肽聚合物的复合物；和(a3)将上述复合物的非肽聚合物的游离末端与免疫球蛋白或生理学活性多肽共价地结合非肽聚合物，以生成蛋白质缀合物，该缀合物中非肽聚合物共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。在步骤(al)中的生理学活性多肽与非肽聚合物的摩尔比可以优选从1:2. 5到1:5，步骤(al)中的免疫球蛋白与非肽聚合物的摩尔比优选从1:5到1:10。在步骤(a2)中所得到的复合物与步骤(a3)中的生理学活性多肽或免疫球蛋白的摩尔比可以是1:0. 5到1:20，优选 1:1 到 1:5。步骤(al)和(a3)可以优选在有还原剂存在时进行，还原剂可以选自由氰基硼氢化钠、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐和吡啶硼酸盐所构成的组。根据对所形成的缀合物的所需纯度的程度和缀合物包括分子量在内的特性和带电情况，用于进行步骤(a2)和(b)的操作可以依据用于纯化蛋白的传统方法例如尺寸排阻层析、离子交换层析等及其组合。本发明再一方面是提供了一种与未修饰的多肽相比，具有延长的体内半衰期的生理学活性多肽的药物组合物，它包括本发明的蛋白质缀合物和药学上可接受的载体(赋形剂)。本发明的药物组合物可以经各种途径给药，包括口服、经皮、皮下、静脉和肌肉内导入(introduction)施用药物组合物,更优选注射。可以通过采用任何一种本领域熟知的方法配制本发明的组合物，以提供一种在其对患者给药后活性成分被施用快速地、持续地或延迟地释放，。制剂可以是片剂、丸剂、粉剂、囊剂、酏剂(elixir)、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气雾剂、软的和硬的胶囊、无菌可注射溶液、无菌包装粉剂等等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂还可以包括填充剂、抗凝集剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等等。应当根据各种相关因素决定所实际施用的活性成分的量，所述相关因素包括所治疗的疾病、所选择的给药途径、年龄、性别和个体患者的体重、以及患者症状的严重程度、特别是活性成分的种类。由于本发明的蛋白质缀合物的被增强的稳定性，可以显著地减少所施用的包含蛋白质缀合物的多肽药物制剂的总量和频率。本发明在以下实施例中被进一步阐释。应当了解这些实施例虽然说明了本发明的优选的实施方案，但它只是用于举例说明，而非对本发明的范围的限制。
实施例I :hGH-PEG_IgG缀合物I的制备(步骤I)hGH-PEG复合物的制备将人生长激素(hGH，M. ff. 22kDa)溶解于IOOmM磷酸缓冲液中，至浓度为5mg/ml，并将在其两末端都含有乙醛基的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD，Shearwater Inc, USA)(分子量为
3.4kDa)以相应于1:1、1:2. 5、1:5、1:10或1:20的hGH:PEG摩尔比的量加入到所形成的缓冲溶液中。将氰基硼氢化钠(NaCNBH3, Sigma)作为还原剂加入到其中至终浓度为20mM，在4°C下搅拌反应混和物3个小时。为了分离hGH-PEG复合物，其中PEG被选择性地以I: I的摩尔比连接到hGH的末端氨基上，将反应混和物在Superdex (Pharmacia, USA)上进行尺寸排阻层析。用IOmM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)从柱上洗脱并纯化出hGH-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的hGH、未反应的PEG和在PEG的两末端上都连接有两分子hGH的二聚体副产物。将纯化的hGH-PEG复合物浓缩至5mg/ml。已经发现为获得最佳结果，最优化的hGH:PEG摩尔比是1:2. 5-1:5的范围内。(步骤2)hGH-PEG复合物和IgG之间的缀合物的形成将分子量为150kDa的免疫球蛋白G(IgG,Green Cross, Korea)溶解于IOOmM憐酸缓冲液中。为了将IgG缀合到在实施例I中所纯化的PEG-hGH复合物的乙醛基上，PEG-hGH复合物被以对应于hGH-PEG复合物IgG的摩尔比为I: I、1: 2、1:4或1:8的量加入到含IgG的缓冲液中。将NaCNBH3作为还原剂加入其中至终浓度为20mM，并在4°C下轻轻地搅拌反应混和物20个小时。为了在缀合反应之后从污染物中纯化出hGH-PEG-IgG缀合物，将反应混和物用经20mM Tris缓冲液(pH 7. 5)平衡的DEAE柱(Pharmacia，USA)进行阴离子交换层析。将流动相从缓冲液A (20mM Tris缓冲液，pH 7. 5)转换到具有线性浓度梯度(NaCl浓度0M — 0. 5M)的缓冲液B (含有I. OM NaCl的20mM Tris缓冲液，pH 7. 5)中。为了从所洗脱的hGH-PEG-IgG缀合物中去除少量的未反应的IgG和未修饰的hGH，将洗脱溶液用经IOmM乙酸钠(Ph4. 5)平衡的polyCAT柱(PolyLC，美国)的阳离子交换层析。将流动相从缓冲液A (IOmM乙酸钠，pH4. 5)转换到具有线性浓度梯度(NaCl浓度0M — 0. 5M)的缓冲液B (含有I. OM NaCl的IOmM乙酸钠，pH 7. 5)中，这造成纯化hGH-PEG-IgG缀合物(图I)。已经发现为获得最佳结果的最优化的hGH-PEG复合物IgG摩尔比是1:4。实施例2 hGH-PEG-IgG缀合物II的制备(步骤I)IgG-PEG复合物的制备
将IgG (Green Cross, Korea)溶解于IOOmM憐酸缓冲液中至浓度为15mg/ml,并将 3. 4kDa 的 ALD-PEG-ALD (Shearwater Inc, USA)以相应于 I: I、1:2. 5、1: 5、1:10 或1:20的IgG = PEG摩尔比的量加入到所形成的缓冲溶液中。将NaCNBH3作为还原剂加入到其中至终浓度20mM，在4°C下搅拌反应混和物3个小时。为了分离其中PEG被选择性地以1:1的摩尔比连接到IgG的末端氨基上的IgG-PEG复合物，将反应混和物在Superdex' (Pharmacia, USA)上进行尺寸排阻层析。用IOmM磷酸钾缓冲液(pH 6. 0)从柱中洗脱并纯化出IgG-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的IgG、未反应的PEG和在PEG的两末端上都连接有两分子IgG的二聚体产物。将纯化的IgG-PEG复合物浓缩至15mg/ml。已经发现为了得到最佳结果，最优化的IgG:PEG摩尔比是在1:5到1:10的范围内。(步骤2)IgG-PEG复合物和hGH之间的缀合物的形成为了将hGH (分子量22kDa)缀合到在实施例I中所纯化的IgG-PEG复合物上，将溶解于IOOmM磷酸缓冲液中的hGH与IgG-PEG复合物以I: I、I: I. 5、1:3或1:6的摩尔比反应。将NaCNBH3作为还原剂加入其中至终浓度为20mM，并在4°C下搅拌反应混和物20个小时。根据与实施例I的步骤2所描述的相同的方法将反应混和物进行纯化以去除未反应物质和副产物，并从中纯化出hGH-PEG-IgG缀合物。实施例3 : IFN a -PEG-IgG缀合物的制备根据在实施例I中所描述的相同的方法制备并纯化IFNa-PEG-IgG缀合物，除了用干扰素 a 2b (IFN a 2b，分子量 20kDa)取代 hGH，IFN a 2b: ALD-PEG-ALD (分子量 3. 4kDa)的摩尔比为1:5。实施例4 :人G-CSF-PEG-IgG缀合物的制备根据在实施例I中所描述的相同的方法制备并纯化G-CSF-PEG-IgG缀合物，除了用人粒细胞集落刺激因子(G-CSF，分子量18. 7kDa)取代hGH，G-CSF: ALD-PEG-ALD (分子量
3.4kDa)的摩尔比为1:5。此外，根据上面描述的相同的方法用G-CSF衍生物(17S-G-CSF)制备并纯化G-CSF衍生物-PEG-IgG缀合物，其中用丝氨酸取代野生型G-CSF的第17位氨基酸得到所述衍生物。实施例5 =EPO-PEG-IgG缀合物的制备根据在实施例I中所描述的相同的方法制备并纯化EPO-PEG-IgG缀合物，除了用人促红细胞生成素(EPO，分子量35kDa)取代hGH，EPO: ALD-PEG-ALD (分子量3. 4kDa)的摩尔比为1:5。实施例6 :用具有不同的功能基的PEG制备蛋白质缀合物用在其两末端都具有不同的功能基而非乙醛基的PEG按照如下制备hGH-PEG-IgG缀合物。将溶解于IOOmM磷酸缓冲液的IOmghGH与在其两末端都含有琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)的 PEG (SPA-PEG-SPA, Sharter Inc, USA,分子量 3. 4kD)以对应于 hGH:PEG 的摩尔比为1:1、1:2. 5、1:5、1:10或1:20的量反应。将反应混和物在室温下搅拌2个小时。为了得到其中PEG被选择性地按I: I的摩尔比连接到hGH的赖氨酸残基上的hGH-PEG复合物，将反应混和物在Superdex (Pharmacia, USA)上进行尺寸排阻层析。用IOmM磷酸钾缓冲液(pH
6.0)从柱中洗脱并纯化出hGH-PEG复合物以去除污染物例如未修饰的hGH、未反应的PEG和在PEG的两末端上连接有两分子hGH的二聚体副产物。将纯化的IgG-PEG复合物浓缩至 5mg/ml。根据实施例I中所描述的相同方法用浓缩的hGH-PEG复合物制备hGH-PEG-IgG缀合物。已经发现为了获得最佳结果，最优化的hGH: PEG摩尔比是在1:2. 5到1:5的范围内。根据上述的相同的方法制备和纯化另一种hGH-PEG-IgG缀合物，除了用在其两末端含有N羟基琥珀酰亚胺基(NHS)的PEG取代SPA-PEG-SPA。实施例I :利用具有不同的分子量的PEG制备蛋白质缀合物根据在实施例I的步骤I中的相同的方法制备并纯化hGH-PEG复合物，除了用在其两末端都含有乙醛基且分子量为10，000道尔顿的PEG (ALD-PEG-ALD, ShearwaterInc, USA)以外。同时，已经发现对为了获得最佳结果，最优化的hGH:PEG摩尔比是在1:2. 5到1:5的范围内。将所纯化的hGH-PEG复合物浓缩至5mg/ml。根据实施例I的步骤2中所描述的相同方法用浓缩的hGH-PEG复合物制备hGH-PEG-IgG缀合物。实施例8 :Fab’ -S-PEG-N-IgG缀合物(-SH基)的制备(步骤I)Fab’的表达和纯化将表达抗了,0 &13’的大肠杆菌乩21/^001册(保藏号KCCM10511)接种于IOOmlLB培养基中并震荡培养过夜。将所培养的LB肉汤转移到51发酵罐(Marubishi)中，并在30°C、通风率为20vvm、搅拌速度为500rpm的条件下进行培养。随着发酵的进展，往培养物中加入适当量的葡萄糖和酵母提取物以补充微生物生长所造成的能量源的短缺。当所培养的肉汤在600nm的吸光率达到80时，往培养基中加入IPTG以诱导蛋白表达。将培养物再继续培养40到45个小时，直到所培养的肉汤在600nm的吸光率达到120到140。在20，OOOxg下离心所形成的培养肉汤30分钟以获得上清液。为了纯化抗TNF a Fab’，将上清液进行下面的三步层析纯化处理。将上清液装入到经 20mM 憐酸缓冲液(pH 7. 0)平衡的 HiTrapProteinG (5ml,Pharmacia, Germany)柱中，并用IOOmM甘氨酸缓冲液(pH 3. 0)洗脱。被洗脱的Fab’部分被装入到经IOmM磷酸缓冲盐水(PBS,pH7. 3)平衡的Superdex 200柱(Pharmacia, Germany)中，并用相同的缓冲液洗脱。被洗脱的Fab’部分被装入到polyCAT21x250 (PolyLC Inc.，USA)，并用在线性浓度梯度的NaCl (0. 15M — 0. 4M)下的IOmM乙酸缓冲液(pH4. 5)洗脱以获得纯的抗TNFa Fab’部分。(步骤2)IgG-PEG复合物的制备将150mg 免疫球蛋白 G (IgG,分子量为 150kDa, Green Cross Inc.，Korea)溶解于IOOmM PBS (pH 6. 0)中至浓度为 5mg/ml，并将 NHS-PEG-MAL (分子量为 3400Da, ShearwaterInc.，USA)以对应于IgG = PEG摩尔比为1:10的量加入到所形成的溶液中。在4°C下轻轻地搅拌反应混和物12个小时。完成反应后，马上将反应缓冲液换为20mM PBS (pH 6.0)以去除未反应的NHS-PEG-MALo之后，将反应混和物装入到polyCAT21x250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并用20mM PBS (pH 6. 0)用线性浓度梯度法(NaCl浓度0. 15M — 0. 5M)洗脱以获得IgG-PEG复合物。未反应的IgG比IgG-PEG复合物更晚被洗脱，并将其废弃。(步骤3)Fab’ -S-PEG-N-IgG缀合物(-SH基团)的制备将在步骤I中所纯化获得的Fab’溶解于IOOmM PBS (pH 7. 3)中至浓度为2mg/ml，并将在步骤2中所制备的IgG-PEG复合物以对应于Fab’ :复合物的摩尔比为1:5的量
加入到所形成的溶液中。将反应混和物浓缩为50mg/ml的蛋白浓缩物，并在4°C下轻轻地搅拌浓缩物24个小时。完成结合反应后，马上将反应混和物装入到经IOmM磷酸缓冲液(pH 7. 3)平衡过的Superdex 200 (Pharmacia, USA)柱中，并用相同的缓冲液以lml/min的流速洗脱以获得Fab’ -S-PEG-N-IgG部分。具有高分子量的Fab’ -S-PEG-N-IgG缀合物较早地被洗脱，未反应的IgG-PEG复合物和Fab’比缀合物被更晚洗脱并将其废弃。为了去除剩余的未反应的 IgG-PEG 复合物，将 Fab’ -S-PEG-N-IgG 缀合物部分装入到 polyCAT21x250 (PolyLCInc.，USA)中并用线性浓度梯度方法(NaCl浓度0. 15M—0. 5M)用20mM乙酸缓冲液(pH6. 0)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab’ -S-PEG-N-IgG缀合物的部分，其中IgG-PEG复合物被连接到邻近于Fab’的C末端的-SH基团上。实施例9 :Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物(N末端)的制备(步骤I)Fab’ -PEG复合物(N末端)的制备将40mg在实施例8的步骤I中所得到的被纯化的Fab’溶解于IOOmM PBSCpH 6. 0)中至浓度为 5mg/ml,并将丁基ALD-PEG-丁基 ALD(分子量为 3400Da, Shearwater Inc. , USA)以对应于Fab’ :PEG的摩尔比为1:5的量加入到所形成的溶液中。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM，然后在4°C下轻轻地搅拌混合物2个小时。完成反应后，马上将缓冲液换为20mM PBS (pH 6.0)。在变换缓冲液之后，将混和物装入到polyCAT21x250柱(PolyLC Inc. , USA)中，并用线性浓度梯度法(NaCl浓度
0.15M — 0. 4M)用20mM PBS(pH4. 5)进行洗脱以获得含有Fab’ -PEG复合物的部分。未反应的IgG比复合物更晚被洗脱，并将其废弃。(步骤2)Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物(N末端)的制备将在步骤I中所获得的纯化Fab’ -PEG溶解于IOOmM PBS (pH6. 0)中至浓度为10mg/ml,并将IgG (分子量为150kDa, Green Crosslnc. Korea)以对应于复合物IgG的摩尔比为1:5的量加入到所形成的溶液中。将反应混和物浓缩为50mg/ml的蛋白浓缩物。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM的，并在4°C下轻轻地搅拌反应混和物24个小时。完成结合反应后，马上将反应混和物装入到经IOMm PBS (pH7. 3)平衡过的Superdex200 (Pharmacia, USA)柱中，并用相同的缓冲液以lml/min的流速进行洗脱以获得含有Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物的部分。具有高分子量的Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物被较早地洗脱，未反应的免疫球蛋白和Fab’ -PEG比缀合物被洗脱得更晚并将其废弃。为了去除剩余的未反应的免疫球蛋白，将Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物部分装入到polyCAT21X250柱(PolyLC Inc.，USA)中，并用线性浓度梯度法(NaCl浓度0. 15M — 0. 5M)，用20mM乙酸缓冲液(pH6. 0)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab’ -N-PEG-N-IgG缀合物的部分，其中IgG-PEG复合物被连接到Fab’的N末端上。实施例10 :无糖基化IgG (AGIgG)的制备
将200mg免疫球蛋白G (Green Cross Inc.，Korea)溶解于IOOmM憐酸缓冲液(pH
7.5)中至浓度为2mg/ml，并往其中加入300U/mg无糖基化酶，PNGase F (NEB Inc.，UK)。在轻轻搅拌下，该混和物于37°C反应24个小时。完成反应后，马上将反应混和物装入到SP琼脂糖FF (Pharmacia, Germany)柱中，用线性浓度梯度法利用IMNaCl (NaCl浓度:
0.IM- 0. 6M)用IOmM乙酸缓冲液(pH4. 5)洗脱以得到无糖基化IgG部分，它比野生型IgG被洗脱得更晚。实施例11 : IFN a -PEG-AGIgG缀合物的制备通过将在实施例10中所制备的无糖基化(AGIgG)缀合到在实施例3中所制备的IFN a -PEG复合物上，按照如下制备IFN a -PEG-AGIgG缀合物。将AG IgG (分子量约147kDa)溶解于IOmM磷酸缓冲液中。将IFN a -PEG复合物以对应于IFNa-PEG复合物AG IgG的摩尔比为I: I、1: 2、1:4或1:8的量加入到含AGIgG的缓冲液中。将所形成的混和物调整到IOOmM磷酸缓冲液，并往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM。在4°C下轻轻地搅拌反应混和物20个小时。已经发现为了获得最佳结果，最优化的IFNa-PEG复合物=AGIgG的摩尔比为1:2。为了在结合反应之后从污染物中纯化出IFNa-PEG-AGIgG缀合物，将反应混和物进行尺寸排阻层析。将反应混和物装入到Superdex (Pharmacia, USA)柱中并用IOmMPBS (pH 7. 3)以2. 5ml/min的流速进行洗脱，以得到IFNa-PEG-AGIgG缀合物部分，同时也去除了污染物例如未反应的AG IgG和IFNa-PEG复合物。然后将如此所获得的IFNa-PEG-AGIgG缀合物部分进一步进行阳离子交换层析以去除少量未反应的AG IgG和IFNa-PEG复合物。将该部分装入到经IOmM乙酸钠缓冲液(pH 4. 5)平衡过的polyCAT LP柱(PolyLC, USA)中，利用线性浓度梯度法(NaCl浓度OM — 0. 6M)用含有I. OM NaCl的IOmM乙酸钠缓冲液(pH 4. 5)进行洗脱以获得IFNa -PEG-AGIgG缀合物部分。然后将所得到的部分进一步进行阴离子交换层析。将该部分被装入到经IOmM Tris-HCl缓冲液(pH 7. 5)平衡过的poIyWAXLP柱(PoIyLC Inc.，USA)中，通过线性浓度梯度法(NaCl浓度OM — 0. 3M)用含有I. OM NaCl的IOMm Tris-HCl缓冲液(pH 7. 5)进行洗脱以获得纯的IFNa-PEG-AGIgG缀合物部分。实施例12 :EP0-PEG-AG IgG缀合物的制备通过采用在实施例5中所制备的EPO-PEG复合物和在实施例10中所制备的无糖基化IgG重复实施例11中的操作，得到EPO-PEG-AG IgG缀合物。比较实施例I :PEG_hGH复合物的制备将5mg hGH溶解于IOOmM磷酸缓冲液(pH 6. 0)中以得到5ml溶液，并将活化的具有40kDa PEG的甲氧基-PEG-ALD以对应于hGH:PEG的摩尔比为1:4的量加入到溶液中。往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM，然后在4°C下逐渐搅拌反应混和物18个小时。然后往其中加入氨基乙醇至终浓度50mM，以灭活未反应的PEG。
为了进一步去除未反应的PEG，将反应混和物进行S印hadexG-25柱(Pharmacia, USA)层析。在装入反应混和物之前，将柱用2倍柱体积(CV)的IOmM Tris-HCl(pH 7. 5)缓冲液平衡。用UV分光光度计在260nm分析洗脱部分的吸收率吸光率。具有大分子量的PEG修饰的hGH在未反应的PEG之前首先被洗脱。然后如下从洗脱部分中进一步纯化PEG修饰的hGH。用IOmMTris-HCl (pH 7.5)缓冲液平衡装有3ml PolyffAX LPCPolywax Inc, USA)的柱。将含有PEG修饰的hGH的洗脱部分以lml/min的速度装入到柱中，并用15ml平衡缓冲液洗涤柱。通过利用IM NaCl缓冲液的盐浓度梯度法(NaCl浓度0% — 100%) 30分钟依次分离出三、双和单PEG连接的hGH。为了从混和物中进一步纯化出单PEG连接的hGH复合物，将柱流出物进行尺寸排阻层析。将浓缩的流出物装入到经IOmM磷酸钠缓冲液平衡过的Superdex 200(Pharmacia, USA)柱中，并用相同的缓冲液以lml/min的流速进行洗脱。比单PEG连接的 hGH更早被洗脱的三和双PEG连接的hGH复合物被出去以获得单PEG连接的hGH复合物。根据上述的相同的方法制备并纯化PEG-IFN a、PEG-17S-G-CSF衍生物和PEG-G-CSF，其中40kDa PEG分别被连接到IFNa和G-CSF的末端氨基上的。比较实施例2 :白蛋白-hGH复合物的制备为了将白蛋白和在实施例I中所得到的hGH-PEG复合物相缀合，将溶解于IOmM磷酸缓冲液中的人血清白蛋白(HAS,分子量为约67kDa) (Green Cross, Korea)以对应于hGH-PEG复合物HSA的摩尔比为1:1、1:2、1:4或1:8的量与hGH-PEG复合物反应。反应混和物被浓缩到IOOmM磷酸缓冲液中，并往其中加入作为还原剂的NaCNBH3至终浓度为20mM。然后在4°C下搅拌反应混和物20个小时。已经发现为了获得最佳结果，最优化的hGH-PEG复合物白蛋白的摩尔比为1:2。在结合反应之后，将反应混和物在Superdex中进行尺寸排阻层析以去除未反应的原料和副产物。浓缩反应混和物并将其以2. 5ml/min的流速装入到使用IOmM乙酸钠(Ph
4.5)的柱中，以得到纯化的hGH-PEG-白蛋白质缀合物。因为所纯化的hGH-PEG-白蛋白质缀合物仍被少量的未反应的白蛋白和hGH 二聚体所污染，因此进一步进行阳离子交换层析以去除这些污染物。将hGH-PEG-白蛋白质缀合物流出物装入到经IOmM乙酸钠(pH 4. 5)平衡过的SP5PW (Waters, USA)柱中，用具有线性浓度梯度(NaCl浓度0M — 0. 5M)的含有
I.OM NaCl的IOmM乙酸钠(pH 4. 5)将其分级以回收纯hGH-PEG-白蛋白。根据上述的相同的方法制备并纯化到IFNa-PEG-白蛋白、G-CSF-PEG-白蛋白和17S-G-CSF衍生物-PEG-白蛋白，其中白蛋白被分别连接到IFNa ,17S-G-CSF和G-CSF上。比较实施例3 =Fabj -S-40K PEG复合物的制备将在实施例8的步骤I中所得到的纯化的Fab’放置在活化缓冲液(20mM PBS (pH
4.0)和0. 2mM DTT)中I个小时，以激活其游离-SH基。将缓冲液换为PEG化缓冲液(50mM磷酸钾(PH6.5))。将马来酰亚胺-PEG (分子量为40kDa，Shearwater Inc. , USA)以对应于Fab’ PEG的摩尔比为1:10的量加入到所形成的溶液中。在4°C下轻轻地搅拌反应混和物24个小时。完成反应之后，马上将反应混和物装入到经IOmM PBSCpH 7. 3)平衡过的Superdex200柱(Pharmacia, USA)中，并用相同的缓冲液以lml/min的流速进行洗脱以获得含有Fab’ -S-40K PEG复合物的部分。未反应的Fab’比复合物被洗脱得更晚并将其废弃。为了去除未反应的Fab’，将Fab’ -S-40K PEG复合物部分装入到polyCAT 21x250柱(PolyLCInc.，USA)中，并利用线性浓度梯度法(NaCl浓度0. 15M —0. 5M)用20mM PBS (pH 4.5)进行洗脱。最后，得到含有纯Fab’-S-40K PEG复合物的部分，其中40kDa PEG被连接到邻近于Fab’的-SH基团上。测试实施例I :蛋白质缀合物的确认和定量
( I)蛋白质缀合物的确认利用具有浓度梯度为4到20%的凝胶通过SDS-PAGE和ELISA(R & D System, USA)分析在上述实施例中所制备的蛋白质缀合物的修饰情况。hGH、hGH-PEG、IFN 和 IFN-PEG 每种都在 SDS-PAGE 以及一种与 50mM DTT (二硫苏糖醇)的混和物中显影，而IgG、hGH-PEG-IgG和IFN-PEG-IgG中没有DTT。图2和3分别显示了 hGH-PEG-IgG和IFN-PEG-IgG缀合物所得到的SDS-PAGE结果。左边所列的数字是分子量标记(kDa)。如图2中所示，hGH-PEG-IgG缀合物的表观分子量为约170kDa。但是，因为在SDS-PAGE中区别出IgG蛋白质缀合物与野生型IgG之间的分子量差异是困难的，用DTT处理还原hGH-PEG-IgG缀合物和IgG，将其分离成重链和轻链，并分别通过SDS-PAGE确认它们的缀合状态(图4)。当用DTT处理IgG时，根据它们的分子量，IgG的轻链被首先分离，随后是IgG的重链。经DTT处理的hGH-PEG-IgG缀合物的带出现在对应于通过分别累计hGH-PEG的分子量(3. 4kDa)和轻链及重链片段的分子量所计算出的分子量的位置上显现出缀合物。hGH-PEG-IgG缀合物的轻链在比hGH-PEG-IgG缀合物的重链更低的位置(更小的分子量)上形成了一个条带，发现所述重链条带在对应于约SOkDa的位置。从上述的结果中，已经发现hGH与轻链及重链结合的可能性相同，且IgG与hGH以1:1的摩尔比反应。(2)蛋白质缀合物的定量分析通过计算在尺寸排阻层析(柱Superdex ;洗脱液10mM磷酸钾缓冲液(pH 6. 0))中所观察到的峰面积并将其与对照比较，确定出在上述的实施例中所制备的每种蛋白质缀合物的量。在分别用预先定量的hGH、IFN,G-CSF^17S-G-CSF,EPO和IgG进行尺寸排阻层析之后，确定出峰面积的相对感应因子。用恒定量的每种蛋白质缀合物在相同条件下进行尺寸排阻层析，并通过从上面所得到的每种蛋白质缀合物的峰面积中减去对应于IgG的峰面积而确定出存在于每种蛋白质缀合物中的生理活性蛋白的数量值。除了层析外，也进行ELISA (R&D System, USA)分析。如果IgG的一部分被缀合到多肽的生理学活性位点上，利用特异于生理学活性位点的抗体所得到的ELISA分析的数值要比层析所计算出的数值小。对于hGH-PEG-IgG缀合物，已经发现通过ELISA所测定的数值只有通过层析所确定的数值的30%。(3)蛋白质缀合物的纯度和质量的确认。为了检查在实施例3中所得到的INFa-PEG-IgG复合物的纯度，利用反相柱(259VHP54柱，Vydac Inc.，USA)进行反相HPLC。在有0. 5%TFA存在的情况下，通过线性浓度梯度法(乙腈浓度40% — 100%)用乙腈洗脱复合物，并在280nm下对该复合物进行检测。如图5中所能看到的,复合物的纯度超过95%。在尺寸排阻层析期间，分析在每个实施例中所得到的蛋白质缀合物在280nm的吸光值，发现 hGH-PEG-IgG、IFN-PEG-IgG、G-CSF 和 17S-G-CSF-PEG-IgG 每种都显示出对应于分子量从170，000到180，000道尔顿的单峰。观察到EPO-PEG-IgG峰在对应于分子量为200, 000道尔顿的位置。为了确定出每种蛋白质缀合物的确切的分子量，用MALDI-TOF (VoyagerDE-STR, Applied Biosystems, USA)超高速质谱法分析所纯化的样本。芥子酸被用作基质。将0.5 Ul的每种样本涂抹在载玻片上并在空气中晾干。在将等体积的基质滴到载玻片上之后，将载玻片在空气中晾干，并放置到离子源中。用利用阳性法的线性模式TOF装置进行检测，在利用750nSec/1500nSec延迟提取时间的延迟离子提取器的分离的提取供应源中，用约2. 5kV的总电位差对离子进行加速。hGH-PEG-IgG缀合物的质谱分析的结果示于表I和图6。表I对IgG-蛋白质缀合物的质谱分析
理论值(kDa)测定值 ___(kDa)
hGH-PEG-IgG (实施例 I)__115A__176.8INFa-PEG-IgG (实施例 3)__17^6__172.6
G-CSF-PEG-IgG (实施例 4)__IllA__173.0
17S-G-CSF 衍生物-PEG-IgG (实施例 4) 171.9__172.2
EPO-PEG-IgG (实施例 5)185.4183.0结果表明hGH-PEG-IgG缀合物的纯度为90%或更高，所测定的分子量几乎等于理论值。另外，hGH-PEG-IgG缀合物是IgG与hGH-IgG复合物以I: I的摩尔相结合的形式。另外，如通过上面的MALDI-T0F方法所测定的在实施例10中所制备的AG IgG的分子量为147kDa，它比野生型IgG小3，OOODa (图9)。这一被减少的分子量，即3，OOODa,对应于糖链的理论大小，因此推断IgG的糖链被完全地去除了。表2显示了在实施例11和12中所制备的INF a -PEG-AG IgG和EP0_PEG_AG IgG缀合物的分子量。表2对AG IgG-蛋白质缀合物的质谱分析
理论值(kDa)测定值(kDa)
INFa-PEG-AG IgG (实施例 11)169. 6170. 0
EPO-PEG-AG IgG (实施例 12)182. 4180. 0测试实施例2 :药物代谢动力学分析I比较了在实施例和比较实施例中所制备的IgG-蛋白质缀合物、PEG-蛋白和白蛋白-蛋白复合物(测试组)和生物学活性野生型蛋白(对照组)的体内稳定性和药物代谢动力学系数。在下面的试验中，每组使用5只Sprague-Dawley (SD)鼠。以100 ii g/kg分别对鼠皮下注射对照、PEG-复合物、白蛋白-蛋白质缀合物和IgG-蛋白质缀合物。在注射后的0. 5、1、2、4、6、12、24、30、48、72和96小时，从对照组中采取血样，在注射后的1、6、12、24、30、48、72、96、120、240和320小时，从测试组中采取样本。将血样收集到经肝素涂层的试管中以预防血液凝固，并将其在4°C、3，OOOxg下高速微离心30分钟以去除细胞。通过使用特异于每种生物学活性蛋白的各个抗体的ELISA法测定血清中的蛋白浓度。在表2到6中显示了野生型hGH、IFN、G-CSF和EPO及它们的蛋白质缀合物、复合物的药物代谢动力学数值，其中Tmax意思是到达最大药物浓度的时间，T172为药物在血液中的半衰期，MRT (平均滞留时间)为在体内的平均滞留时间。表3hGH的药物代谢动力学数值
权利要求
1.一种蛋白质缀合物，其包括彼此以如下顺序共价连接的i)选自由人生长激素、干扰素a、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素和Fab’所构成的组中的生理学活性多肽，ii)聚乙二醇，以及iii)免疫球蛋白G，并具有生理学活性多肽的延长的体内半衰期。
2.权利要求I的蛋白质缀合物，其中所述聚乙二醇在其两末端具有两个反应基团，通过这两个反应基团，该聚乙二醇被共价地连接到生理学活性多肽和免疫球蛋白上。
3.权利要求I的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白G选自由IgGI、IgG2、IgG3和IgG4所构成的组。
4.权利要求I的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白G是人免疫球蛋白G。
5.权利要求I的蛋白质缀合物，其中所述免疫球蛋白G选自由具有野生型糖基化的免疫球蛋白G、具有增加或减少的糖基化程度的免疫球蛋白G和无糖基化的免疫球蛋白G所构成的组。
6.权利要求5的蛋白质缀合物，其中通过选自由化学方法、酶学方法和生物技术方法所构成组的方法来进行免疫球蛋白G的糖基化程度的增加或减少或无糖基化。
7.权利要求2的蛋白质缀合物，其中所述聚乙二醇的反应基团选自由乙醛、丙醛、丁醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组。
8.权利要求7的蛋白质缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
9.权利要求7的蛋白质缀合物，其中所述聚乙二醇在其两末端具有乙醛基。
10.权利要求I的蛋白质缀合物，其中所述聚乙二醇在其末端分别被共价地连接到免疫球蛋白的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基以及生理学活性多肽的氨基末端、赖氨酸残基、组氨酸残基或半胱氨酸残基。
11.一种制备权利要求I的蛋白质缀合物的方法，该方法包括 (a)将生理学活性多肽和免疫球蛋白G与在其两末端具有反应基团的聚乙二醇共价连接，其中所述生理学活性多肽选自由人生长激素、干扰素a、粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素和Fab’所构成的组；和 (b)分离含有生理学活性多肽、聚乙二醇和免疫球蛋白G的蛋白质缀合物，其中所述生理学活性多肽、聚乙二醇和免疫球蛋白G以活性多肽、聚乙二醇和免疫球蛋白G这种顺序共价相连。
12.权利要求11的方法，其中步骤(a)包括 (al)将聚乙二醇的一个末端与免疫球蛋白G或生理学活性多肽共价地结合； (a2)从所得的反应混和物中分离出复合物，所述复合物包含与免疫球蛋白G或生理学活性多肽相结合的聚乙二醇；和 (a3)将上述复合物的聚乙二醇的游离末端与免疫球蛋白G或生理学活性多肽共价地结合，以产生蛋白质缀合物，该缀合物包含彼此共价相连的生理学活性多肽、聚乙二醇和免疫球蛋白G。
13.权利要求12的方法，其中在步骤(al)中的生理学活性多肽与聚乙二醇的摩尔比是在从1:2. 5到1:5的范围内。
14.权利要求12的方法，其中在步骤(al)中的免疫球蛋白G与聚乙二醇的摩尔比是在从1:5到1:10的范围内。
15.权利要求12的方法，其中在步骤(a2)中所获得的复合物与步骤(a3)中的生理学活性多肽或免疫球蛋白G的摩尔比是在从I: I到1:3的范围内。
16.权利要求12的方法，其中在存在还原剂的条件下实施步骤(al)和(a3)。
17.权利要求16的方法，其中所述还原剂是氰基硼氢化钠、硼氢化钠、二甲胺硼酸盐或吡啶硼酸盐。
18.—种具有半衰期被延长的生理学活性多肽的药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项的蛋白质缀合物和药学上可接受的载体。
19.权利要求11的方法，其中所述免疫球蛋白G选自由IgGl、IgG2、IgG3和IgG4所构成的组。
20.权利要求19的方法，其中所述免疫球蛋白G是人免疫球蛋白G。
21.权利要求11的方法，其中所述免疫球蛋白G选自由具有野生型糖基化的免疫球蛋白G、具有增加或减少的糖基化程度的免疫球蛋白G和无糖基化的免疫球蛋白G所构成的组。
22.权利要求21的方法，其中通过选自由化学方法、酶学方法和生物技术方法所构成的组的方法进行免疫球蛋白G的糖基化程度的增加或减少或无糖基化。
23.权利要求11的方法，其中所述聚乙二醇的反应基团选自由乙醛、丙醛、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物所构成的组。
全文摘要
一种具有生理活性的、体内半衰期被延长的蛋白质缀合物，其包括i)一种生理学活性多肽，ii)一种非肽聚合物(non-peptidic polymer)，和iii)一种免疫球蛋白，由于其被增强的体内稳定性和被延长的血液半衰期，该蛋白质缀合物对于多肽药物的开发是有益的，同时它还减少了诱发免疫应答的可能性。
文档编号C07K16/00GK102757505SQ201210217939
公开日2012年10月31日 申请日期2004年3月13日 优先权日2003年3月13日
发明者权世昌, 李宽淳, 林昌基, 裴城敏, 金大振, 金荣民 申请人:韩美控股株式会社