抗体亲和纯化材料及其用途
【专利摘要】本发明属于生物分离工程和生物医药领域，涉及一类纯化抗体的亲和分离材料，旨在提供一类理化性质稳定、生物安全性良好、可纯化多种来源的抗体的亲和分离材料。它包括活化的基础基质、具有一个及以上活性部位的间隔臂和功能性化学基团构成。本发明所述的亲和分离材料不仅可用于实验室纯化抗体，更适宜于工业中规模化纯化抗体，且分离材料纯化抗体的特异性高、可反复多次使用、生物安全性良好、价格低廉、易保存。
【专利说明】抗体亲和纯化材料及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属生物分离工程与生物医药领域，具体涉及一类新的纯化抗体类物质的亲和纯化材料及在抗体类物质分离、纯化中的应用。
【背景技术】
[0002]抗体又称免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig),是一组由衆细胞分泌的具有抗原结合能力的，主要存在于血液、组织液中的，具有广泛的临床疾病治疗和科研价值的蛋白质。单克隆抗体药物是基于细胞工程与基因工程技术的利用骨髓瘤细胞无线繁殖和浆细胞的抗原分泌能力建立起来的生产均一性较高、特异针较强的、针对特定抗原表位的临床疾病治疗用药物。在各种疾病的诊断与治疗中具有广泛应用前景。
[0003]对现有药物抗体分离与纯化技术的文献检索结果显示:目前单克隆抗体药物生产纯化主要以金黄色葡萄球菌A蛋白免疫亲和层析技术为主，但蛋白A/G亲和层析柱价格昂贵、不耐强酸与强碱、偶联的配基易脱落、层析柱保存条件苛刻、耐用性与生物安全性较差等诸多因素；国际专利NOVEL AFFINITY LIGANDS AND THEIR USE(W01997010887)和中国专利人丙种球蛋白亲和配位体及其用途(CN99119936.7)分别透露了能够结合抗体的小分子配体亲和纯化材料，但纯化单克隆抗体药物的评估数据表明，与蛋白A/G亲和介质相比这些亲和介质结合抗体的载量和专一性不够高，在抗体药物生产中采用也不够普及，因此需要研发抗体药物结合载量和专一性都更好的。
【发明内容】
[0004]本发明克服了现有抗体纯化技术中的不足，提供了一组小分子配基的亲和纯化材料，无脱落，生物安全性好，耐碱性强，适合工业应用。
[0005]因此，本发明的一个目的在于合成亲和纯化材料，用于抗体的分离纯化；
[0006]本发明是通过以下技术方案予以实现的:将基础基质材料用具有两个及以上活性位点的试剂活化，再分步连接两个化学基团成为双基团亲和配体，合成亲和纯化材料。
[0007]所述纯化材料双基团亲和配体的两个化学基团包括:
[0008]4- (2-Aminoethyl)benzenesulfonamide 和 L-Serine, N-(3-Aminopropyl)imidazole 和 N-(3-Aminopropyl)imidazole,4-Aminonaphthol 和 3,5-Diaminobenzoicacid,2-Amino_4,6-dihydroxypyrimidine 和 y-aminobutyric acid, Dibenzyl amine 和Dibenzyl amine ；
[0009]所述的具有两个及以上活性位点的试剂为:三氮嗪及其同系物中的一种或多种；
[0010]所述亲和纯化材料的固相基质为琼脂糖、葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、多聚高分子材料、聚苯乙烯多孔硅胶、玻璃及其衍生品；
[0011]所述的纯化材料合成为:以固相基质为基础，经功能性活化剂活化后，在其表面连接间隔臂，形成具有一个及以上活性中心的基础基质，在间隔臂上采用化学合成的方法，偶连物理、化学性质不同，分子构象各异的活性基团，构成各种亲和纯化材料；一个优选合成步骤为:将一定数量活化的固相基质分装在特定浓度配基反应液的容器中，固定在立式旋转烘箱中，调节温度为20-55°C，转速为5-200rpm，反应5_48小时，并用酸或碱性溶液调节反应液，至PH = 5-9。待反应结束后用乙醇，丙酮，DMF(N’N-二甲基甲酰胺)或水等溶剂洗涤活化的固相基质5-20次，除去未结合的游离的化学基团。将一定数量的已偶联第一个化学基团的纯化材料与配制的一定浓度配基的溶液置容器中，固定在立式旋转烘箱中，调节烘箱温度至45-98 (85-95) °C，转速为10_200rpm，反应24-72小时，反应过程中每4_8小时测定反应液的PH值，并用酸或碱性溶液调节至pH = 5-10 ;待反应结束后冷却至室温。用乙醇、丙酮，DMF(N’ N- 二甲基甲酰胺)或其他有机溶剂或水洗涤活化的固相基质5-20次，除去未结合的游离的小分子配基。最后将活化的固相基质浸泡于5-20%的乙醇、N’ N 二甲基甲酰胺或丙酮的水溶液中，低温保存待用。
[0012]所述的亲和纯化材料性能验证包括:物理、化学稳定性，抗体吸附能力、特异性、配基泄露实验和其生物安全性的检测。
[0013]所述的抗体吸附能力优良的亲和纯化材料在中、强碱性溶液在位清洗过程中，纯化材料对靶蛋白的动、静态吸附量均无显著变化，分别为动态吸附量Q1(l% (流穿抗体量占抗体总量的10% )在流速50-600cm/h时为22_40mg/ml，静态吸附量为56.38-91.99mg/ml。
[0014]将可纯化临床治疗用注射剂量生物活性物质所需的亲和纯化材料上所偶联的化学基团作为免疫原，进行动物试验，所述的药用剂量的生物活性物质为美国FDA批准的20余种已用于临床治疗的抗体类药物，并假设纯化临床使用剂量的生物活性物质所需亲和纯化材料上的全部化学基团均脱落，该剂量的抗体药物所需的亲和纯化材料中的小分子配基化合物全部脱落，在此基础上选择1-5000倍剂量的化学基团进行动物试验，实验结果显示:被注射的20只小鼠未出现死亡现象，记录实验鼠体重、毛色、行动变化规律、脏器解剖后观测与计算相关指数发现，实验组和对照组小白鼠的各项指标之间无显著差异。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为0.5N NaOH在位清洗亲和纯化材料柱对抗体的静态吸附图；
[0016]图2CH0细胞培养抗体药物亲和纯化的SDS-PAGE图；
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例进一步阐述本发明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明，而不用于限制本发明的范围。本领域研究人员在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改，亦属本发明专利的保护范围。
[0018]实施例1
[0019]Sepharose6B用三氯三氮嗪活化(操作参照《亲和色谱导论》(洛(C.R.Lowe)著；刘毓秀译.科学出版社，1983年5月第I版)，量取5份各200ml，估算三氮嗪摩尔数，分别称取5倍摩尔过量的氨基化合物(Rl)
[0020]4- (2-Aminoethyl)benzenesulfonamide, N-(3-Aminopropyl)imidazole,4-Aminonaphthol,2-Amino-4,6-dihydroxypyrimidine, Dibenzyl amine,溶角军于 300ml 的DMF中，分别加入三氮嗪活化介质中，混匀在50°C搅拌反应24h，反应过程中饱和NaHCO3溶液维持PH在7-8，反应完成后取出依次用10倍体积DMF (N’ N 二甲基甲酰胺)和水洗涤介质。
[0021]再分别称取5倍摩尔过量的氨基化合物(R2)L-Serine, N-(3-Aminopropyl)imidazole,3,5-Diaminobenzoic acid, y-aminobutyric acid 和 Dibenzyl amine,溶解于 300ml DMF 中，分别加入，已经偶联 4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonamide,N-(3-Aminopropyl)imidazole,4-Aminonaphthol,2-Amino-4,6-dihydroxypyrimidine 和Dibenzyl amine的三氮嗪活化介质，混匀，95°C搅拌反应24小时，反应过程用饱和NaHCO3维持PH在7.0-8.0之间，反应完成后取出依次用10倍体积DMF(N’ N 二甲基甲酰胺)和水洗涤介质，得仿生亲和材料Cl-2，C4-7，C9-12，C21-33和C47-65，用体积分数为20%的乙醇保存待用。
[0022]实施例2
[0023]亲和纯化材料物理、化学性质验证:
[0024]亲和纯化材料C1-2装柱(160mmX 1mm),用抗体溶液连续进样,至紫外吸收信号不变为止，抗体原始浓度为lmg/ml,样品流速为2ml/min ；
[0025]将抗体溶解在1mMPBS (pH7.0,150mM NaCl)中，平衡10个柱体积，直至紫外吸收UV280稳定在基线附近。
[0026]记录样品在管道中的流速为150cm/h时不同流穿比例下的样品的上样体积，直至柱子出口蛋白浓度达到入口浓度10%以上时，停止进样，上样缓冲液冲洗亲和纯化材料柱至紫外吸收值下降到基线，即改用Gly-HCl (lOOmM，pH3)冲洗色谱柱，测定吸附蛋白总量即为蛋白动态载量。
[0027]C1-2亲和纯化材料的耐碱性验证:分别将5根装有C1-2的亲和材料色谱柱(lml/根)首尾相连接入AKTA，用0.5NNa0H以0.5ml/min的流速持续冲洗亲和层析柱，每个循环清洗5个柱体积，并分别在5个循环，16个循环，42个循环和65个循环后分别取一根亲和纯化材料柱检测静态吸附量；
[0028]实验结果显示在0、5、16、42和65个循环处，亲和纯化材料静态抗体吸附量分别为54.8mg/ml, 53.2mg/ml, 52.7mg/ml, 56.3mg/ml 和 54.6mg/ml,强碱在位清洗 65 个循环内静态吸附量无显著变化；
[0029]亲和纯化材料配基泄露实验:取一根柱体积Iml的C1-2亲和纯化材料柱，与AKTA连接并用PBS (1Mm PB, 150mM NaCl pH7.4)缓冲液平衡柱子至基线平，取浓度为lmg/ml的甲公司单克隆抗体培养液过C1-2亲和纯化材料柱，分别收集流穿液和洗脱液组分，并对所有收集组分进行编号，将流穿液组用截留分子量为3000Da的Milipore超滤管5000g，30min超滤，收集穿透液后与12N HCl水解的配基分别质谱分析其成分；该实验结果表明，以高灵敏度质谱分析检测亲和纯化材料，C1-2时，在纯化抗体后的穿透液中未检测到有配基成分泄露；
[0030]C1-2亲和纯化材料毒性验证:参照美国FDA已批准并用于临床治疗的抗体药物:Remicade、Humira、Herceptin、Avastin、Basiliximab for Inject1n、Iscover、Etanerc印t、泰欣生的注射剂量(说明书剂量为准)，以人体注射剂量最大的抗体药物Remicade的剂量为标准，换算为纯化此剂量所需的亲和纯化材料，进行小鼠体内的毒性试验:将20只Balb/c鼠随机均分为5组，尾静脉注射，对照组注射0.2ml的0.0lM PBS,实验组1、I1、II1、IV组按照小鼠体重注射0.2ml不同浓度亲和纯化材料配基。分两次注射，第一次注射剂量分别为配基完全泄露剂量的1.7倍、3.3倍、10倍、20倍。观察记录一周后进行第二次注射，剂量分别为20倍、50倍、100倍、150倍，观察记录一周，解刨小鼠，观测、称量小鼠脏器，并计算脏器相关指数；
[0031]小鼠两次注射纯化材料配基后体征参数
观测指标— 对照组-实验组-
^I ^UpIV'+1
Ο?.30^50pICKV150^^
泄兹.约係放)-
[0032], 、 ^ 小鼠体(g)- 40.6±3.如40.4±2Jp 40.9±2^ 41.3±2.(^ 38±2.如
—Jfr /L1-—-.毛寒粟、轻度 -
异常体征- 无P无-无*3少动-_ ^
要取死亡率 P OpΟ*3CM
[0033]小鼠两次注射纯化材料配基后脏器指数
[0034]
^-_实验组-_
器官P 对照PI *>Π ^HI.5IV^
0.548 土心脏- 0.553士0.098- 0.554±0.09-0.542土0.09b 0.528土0.031-
0.089^
5.401 土5.353'土肝脏- 6.104±0.592-5.136±0.227^ 4.733土0.548%
0.288%0.600*^
1.483土1.626 士肾脏- 1.663±0.167^1.692±0.119- 1.453±0.193ρ
0.128^0.167ρ
0.803 土0.728 士肺脏- 0.791±0.18如O-728土0.046ο 0.791 ±0.047--
0.078?=0.221^
[0035]注:*和对照组显著差异(P < 0.05)。
[0036]实施例3
[0037]亲和纯化材料柱C1-2纯化CHO细胞培养的单克隆抗体药物:
[0038]配置1mM的HAc缓冲液作为平衡液，用IN NaOH调ρΗ5.0,配制10mM的ρΗ4.5、ρΗ4.0 和 ρΗ3.0 的 Gly-HCI 缓冲液。
[0039]取一根Iml的亲和纯化材料预装柱连接至ΑΚΤΑ，用1Mm PBS(150Mm NaCl，pH7.4)平衡液以lml/min的流速平衡至基线水平，准备上样。
[0040]CHO细胞培养上清(4000rpm, 5in离心并弃沉淀)，3000g离心1min,取上清液并10倍稀释后上样，采用1mM pH5.0条件下的缓冲液洗杂，流速为lml/min，至基线平，用ρΗ4.5、ρΗ4.0和ρΗ3.0的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0041 ] 采用SDS-PAGE (12%的SDS-PAGE胶)检测洗脱样本，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定，洗脱产物浓缩后过检测型液相色谱；结果抗体纯度为97.6% ；
[0042]实施例4
[0043]亲和纯化材料柱C47-65纯化CHO细胞培养的单克隆抗体药物:
[0044]配置1mM的HAc缓冲液作为平衡液，用IN NaOH调pH5.0,配制10mM的pH4.5、ρΗ4.0 和 ρΗ3.0 的 Gly-HCI 缓冲液。
[0045]取一根Iml的亲和纯化材料预装柱连接至ΑΚΤΑ，用1Mm PBS(150Mm NaCl，pH7.4)平衡液以lml/min的流速平衡至基线水平，准备上样。
[0046]CHO细胞培养上清(4000rpm, 5in离心并弃沉淀)，3000g离心1min,取上清液并10倍稀释后上样，采用1mM pH5.0条件下的缓冲液洗杂，流速为lml/min，至基线平，用ρΗ4.5、ρΗ4.0和ρΗ3.0的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0047]采用SDS-PAGE (12%的SDS-PAGE胶)检测洗脱样本，用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定，结果单克隆抗体纯度96% ；
[0048]实施例5
[0049]亲和纯化材料柱C9-12纯化CHO细胞培养的单克隆抗体药物:
[0050]配置1mM 的 HAc 平衡液，用 IN NaOH调 ρΗ5.0,配制 10mM 的 ρΗ4.5、ρΗ4.0 和 ρΗ3.0的Gly-HCI缓冲液。
[0051]取一根Iml的亲和纯化材料预装柱连接至ΑΚΤΑ，用1Mm PBS(150Mm NaCl，pH7.4)平衡液以lml/min流速平衡至基线水平，准备上样。
[0052]CHO细胞培养上清(4000rpm, 5in离心并弃沉淀)，3000g离心1min,取上清液并10倍稀释后上样，采用1mM pH5.0条件下的缓冲液洗杂，流速为lml/min，至基线平，用ρΗ4.5、ρΗ4.0和ρΗ3.0的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0053]采用SDS-PAGE (12%的SDS-PAGE胶)检测各样本；单克隆抗体纯度97% ；
[0054]实施例6
[0055]亲和纯化材料柱C4-7纯化成年人血清丙种球蛋白
[0056]配置1mM 的 HAc 为平衡液，用 IN NaOH 调 ρΗ5，配制 10mM 的 ρΗ4.5、ρΗ3.0 的Gly-HCI缓冲液，取一根Iml的亲和纯化材料预装柱连接至ΑΚΤΑ，用1Mm PBS(150Mm NaCl,pH7.4)平衡液以lml/min流速平衡至基线水平，准备上样；
[0057]取15人份成人血清(100ml/人，混勻后12000rpm, 5in离心并弃沉淀,取上清液并10倍稀释后上样，用1Mm PBS(150Mm NaCl,pH7.4)缓冲液流速为lml/min洗杂至基线平，用pH4.5和pH3的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0058]用12% SDS-PAGE检测纯化的各样本；丙种球蛋白纯度92% ；
[0059]实施例7
[0060]亲和纯化材料柱C21-33分离、纯化儿童血清丙种球蛋白:
[0061]配置1mM的HAc缓冲液作为平衡液，用IN NaOH调pH5，配制10mM的ρΗ4.5、Ph4.0和pH3.0的Gly-HCI缓冲液。并取一根预装有Iml的C1-2亲和纯化材料柱，用1MmPBS(150Mm NaCl，pH7.4)缓冲液流速为lml/min洗杂至基线平，用pH4.5和pH3的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0062]取15人份儿童血清(100ml/人，混勻后12000rpm, 5in离心并弃沉淀,取上清液并10倍稀释后上样，用1Mm PBS(150Mm NaCl,pH7.4)缓冲液流速为lml/min洗杂至基线平，用pH4.5和pH3的10mM的Gly-HCI洗脱并收集洗脱产物；
[0063]用12% SDS-PAGE检测纯化的各样本；丙种球蛋白纯度94%。
【权利要求】
1.一组亲和分离材料其特征在于，所述的亲和分离材料的亲和配体分别含4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonamide 和 L-Serine, N-(3-Aminopropyl)imidazole和 N—(3—Aminopropyl)imidazole,4—Aminonaphthol 和 3,5—Diaminobenzoic acid,2-Amino-4,6-dihydroxypyrimidine 和 y-aminobutyric acid, Dibenzyl amine 和Dibenzyl amine 的双基团。
2.根据权利要求书I所述的亲和分离材料，其特征在于所述的亲和配体的双基团连接的多位点骨架分子包括但不限于三氯三氮嗪。
3.根据权利要求书I所述的亲和分离材料，其特征在于固相基质包括但不限于琼脂糖、葡聚糖、纤维素、丙烯酰胺、多聚高分子材料、聚苯乙烯多孔硅胶、玻璃及其衍生品。
4.根据权利要求书I所述的亲和分离材料，其特征在于用于纯化抗体类物质。
5.根据权利要求书4所述的抗体类物质，其特征在于抗体类物质来自细胞培养液、生物体血液、体液、外分泌液。
6.根据权利要求书I所述的亲和分离材料在抗体纯化中的应用，其特征在于，所述的亲和分离材料与抗体类物质的结合缓冲液为PH5.0-10，离子浓度为0.01-2M的缓冲液，洗脱液为PH为4.5-1.0的、盐离子浓度为0.0l-1M的缓冲液。
【文档编号】C07K1/22GK104148018SQ201310178055
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月14日 优先权日:2013年5月14日
【发明者】李荣秀, 潘金亭, 程超, 任敬钢, 马国荣, 马贵军 申请人:李荣秀, 马贵军