一种高效制备重组人mica蛋白的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于在毕赤酵母中高效表达重组人MICA蛋白的表达盒，其特征在于所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件：(1)控制基因转录的毕赤酵母启动子；(2)控制所述重组人MICA在毕赤酵母中分泌表达的信号肽序列；(3)所述重组人MICA的编码序列；和(4)转录终止子；其中所述信号肽序列为α-factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ?ID?No:9所示。本发明还提供甲醇诱导表达并纯化人MICA蛋白的方法以及组成型表达并纯化人MICA蛋白的方法。
【专利说明】—种高效制备重组人MICA蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，更具体地涉及毕赤酵母生产重组人MICA蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]MICA是mic基因家族的一个成员，位于6号染色体距离HLA-B基因座着丝粒端约46.5kb处，属于非经典的HLA-1类基因。正常生理条件下，其编码的蛋白存在于细胞表面，且被高度N-糖基化修饰。区别于经典的MHC I类分子，MICA不与beta-2-微球蛋白结合形成异二聚体。作为NKG2D的受体，MICA被认为直接参与了 NK细胞介导的杀伤肿瘤功能。此外，Bauer等证实MICA作为NKG2D的配体在器官移植所引起的免疫反应方面也发挥着重要的作用(Bauer, S.，V.Groh等(1999)."Activation of NK cells and T cells by NKG2D, areceptor for stress-1nducible MICA."Science285(5428):727-729)。
[0003]本发明前，市场上出售的重组人MICA主要是用大肠杆菌和人的细胞系进行重组表达的。众所周知，现有的大肠杆菌系统不具备对重组表达的蛋白进行翻译后修饰，特别是N-糖基修饰。在大肠杆 菌中重组表达的蛋白多以包涵体的形式存在，涉及复杂的变复性过程，且整个系统会产生大量的内毒素等诸多不利因素。人的细胞系等动物细胞表达系统通常需要消耗大量的血清而大大增加了生产成本,且生产周期和生产设备要求高,但产量却很有限。值得注意的是，有很多的研究显示了动物细胞系统所生产的蛋白产品具有潜在的病毒污染风险。此外，曹利平等公开了一项MICA蛋白的制备方法专利(CN102154302A)，他用重组的杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞来重组表达和制备MICA蛋白。由于该方法采用了杆状病毒系统，有直接的病毒污染的可能性，不符合目前关于临床注射用治疗性蛋白的标准。同时，Sf9昆虫表达系统具有一般动物细胞表达系统所含有的缺点。
[0004]尽管毕赤酵母被广泛用于尝试表达各种人来源的重组蛋白，但是由于不同的蛋白本身具有复杂性和特殊性，因而最终的表达和制备效果是无法预测的。同时，成功地利用毕赤酵母来重组表达和制备MICA蛋白目前还没有报道。
[0005]综上，当前急需要一种简便，活性高，产量高和有产业化应用前景的重组人MICA蛋白的制备方法。
【发明内容】
[0006]本发明的技术方案
[0007]本发明提供了一种利用毕赤酵母表达和制备重组人MICA蛋白的方法。
[0008]本发明的方案-1提供了在毕赤酵母中利用甲醇诱导表达重组人MICA蛋白的方法，其包括了重组表达质粒的构建、甲醇诱导重组蛋白的表达和重组蛋白的纯化方法。
[0009]本发明的方案-2提供了在毕赤酵母中利用组成型表达(非甲醇诱导)重组人MICA蛋白的方法，其包括了重组表达质粒的构建、重组蛋白表达和重组蛋白的纯化方法。
[0010]具体而言，方案-1和方案-2都包含以下步骤:[0011](1)构建组成型表达载体，其包含启动子、终止子、抗生素抗性基因、分泌信号肽和MICA的编码序列；
[0012](2)电转毕赤酵母，利用抗生素浓度梯度来筛选高效表达克隆；
[0013](3) MICA蛋白的表达和纯化；
[0014]在本发明的一方面中，所用的分泌信号肽为a -factor的Pre序列(SEQ IDNo:1),而非完整的 a -factor Pre-Pro 序列(SEQ ID No: 2)。
[0015]在本发明的另一方面中，所用的MICA的编码序列是未经密码子优化的序列。
[0016]在本发明的另一方面中，所用的MICA的编码序列是经密码子优化的序列。对编码序列进行密码子优化以利于在宿主细胞中表达的方法是本领域技术人员熟知的。
[0017]在本发明的另一方面中，所表达的MICA蛋白的C末端不带有6 X His标签。
[0018]在本发明的另一方面中，所表达的MICA蛋白的C末端带有6 X His标签。
[0019]在本发明的方案-1的一个方面中，所构建的甲醇诱导MICA表达载体包含的启动子为AOXl转录启动子，终止子为AOXl转录终止子，抗性基因为Zeocin抗性基因，分泌信号肽为a -factor的Pre序列，MICA的编码序列为人MICA(AAH16929.1)胞外区编码序列(Glu24-Gln308)。
[0020]在本发明的方案-2的一个方面中，所构建的组成型表达MICA载体包含的启动子为GAP启动子，终止子为GAP转录终止子，抗性基因为Zeocin抗性基因，分泌信号肽为a -factor的Pre序列，MICA的编码序列为人MICA(AAH16929.1)胞外区编码序列(Glu24-Gln308)。
[0021]在本发明的方法中可以使用本领域人员熟知的各种适用于毕赤酵母表达的质粒载体，具体而言，方案-1的方法包括但不限于PPIC9K，pPICZ a -A/B/C ;方案-2的方法包括但不限于 pGAPZ-A/B/C，pGAPZ a -A/B/C。
[0022]在本发明的方法中可以使用本领域技术人员熟知的各种合适的分泌信号肽，其包括但不限于a-factor、α _淀粉酶、葡糖淀粉酶、血清白蛋白分泌信号肽。
[0023]在本发明的方法中可以使用本领域人员熟知的各种毕赤酵母菌株，其包括但不限于 X-33、GS115 和 KM71。
[0024]在本发明的上述各技术特征和在下文(如【具体实施方式】)具体描述的各技术特征可以互相结合，从而构成新的或优选的技术方案。
[0025]本发明的技术效果
[0026]本发明人员发现,当使用a-factor Pre-Pro序列作为信号肽,会导致发酵上清中存在相当一部分的Pro序列未被切割的Pro-MICA。因而,本研究人员采用a-factor的Pre序列作为信号肽，解决了 Pro序列残留的问题，典型的效果展示见图3。
[0027]本发明人员发现，使用本发明方法表达和制备的MICA蛋白的分子量与用人的细胞系表达的MICA蛋白的分子量很接近。用糖苷酶F处理纯化的MICA蛋白(见图7)，发现分子量变为理论值34kDa，表明了 MICA被N-糖基修饰，这与MICA的天然形式很接近。
[0028]本发明方法表达产量高，摇瓶发酵就能实现> 20mg/L的产量。同时，发酵液的后期处理和纯化方便，通过Ni柱纯化和SlOOHR分子筛纯化这两步就可以实现纯化过程。
[0029]更具体地，本发明提供以下各项:
[0030]1.一种用于在毕赤酵母中高效表达重组人MICA蛋白的表达盒，其特征在于所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件:
[0031](1)控制基因转录的毕赤酵母启动子；
[0032](2)控制所述重组人M1CA在毕赤酵母中分泌表达的信号肽序列；
[0033](3)所述重组人M1CA的编码序列；和
[0034](4)转录终止子；
[0035]其中所述信号肽序列为a-factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ 1D No:9所示。
[0036]2.根据1所述的表达盒，其中所述重组人M1CA的编码序列如SEQ 1DNo:10所示。
[0037]3.根据1所述的表达盒，其中所述启动子为PP1C9K质粒中的AOXl启动子，并且所述转录终止子为PP1C9K质粒中的AOXl转录终止子。
[0038]4.根据3所述的表达盒,其序列如SEQ 1D No: 13所示。
[0039]5.根据1所述的表达盒，其中所述启动子为pGAPZ a-A质粒中的GAP启动子，并且所述转录终止子为pGAPZ a -A质粒中的GAP转录终止子。
[0040]6.根据5所述的表达盒,其序列如SEQ 1D No: 14所示。
[0041]7.一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌含有3或4所述的表达盒。
[0042]8.一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌含有5或6所述的表达盒。
[0043]9.一种甲醇诱导表达并纯化人M1CA蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0044](1)培养根据7所述的毕赤酵母工程菌，并且用甲醇诱导毕赤酵母AOXl启动子，使得所述工程菌分泌表达人M1CA蛋白；和
[0045](2)从发酵液中纯化所述人M1CA蛋白。
[0046]10.一种组成型表达并纯化人M1CA蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0047](1)培养根据8所述的毕赤酵母工程菌，并且利用GAP启动子使得所述工程菌组成型分泌表达人M1CA蛋白；和
[0048](2)从发酵液中纯化所述人M1CA蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1:Pre-M1CA-H1s/pP1C9K 质粒的构建流程图；
[0050]图2 =Pre-M1CA-H1 s/pGAPZ-A 质粒的构建流程图；
[0051]图3:用Pre序列作为信号肽优于用完整的a -factor Pre-Pro序列作为信号肽的效果图；
[0052]图4:蛋白质印迹法(Western blott1ng)检测甲醇诱导M1CA表达；
[0053]图5:蛋白质印迹法(Western blott1ng)检测组成型M1CA表达；
[0054]图6:分子筛S100HR纯化的峰图；
[0055]图7:考马斯亮蓝染色方法检测糖苷酶F处理的M1CA。
【具体实施方式】
[0056]实验材料
[0057]1.1菌株与质粒
[0058]巴斯德毕赤酵母(P1ch1apastor1s)菌株 GS115 和 X_33、pP1C9K 质粒和 pGAPZ-A质粒购自1nv1trogen公司。[0059]1.2 试剂
[0060]TRIzol 购自 Invitrogen 公司；M_MLV Reverse Transcriptase 购自 LifeTechnologies ；oligo dT 购自上海生工；pMD18_T 购自宝生物工程；Yeast NitrogenBase (YNB)购自 BD 公司；Yeast Extract 和 Trypton 购自 OXOID 公司；D_Sorbitol、Biotin、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、蛋白marker和PAGE配制相关试剂购自上海生工；质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；G418购自Sigma-Aldrich公司；糖苷酶F购自New England Biolabs公司；抗His-标签mAb购自Abmart公司；二抗ant1-mouse IgG-HRP购自Bio Legend公司；其他化学试剂购自国药集团。
[0061 ] 下述实施例中其他所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0062]下述实施例中其他所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063]实施例1.甲醇诱导MICA表达和制备方法，包括以下步骤:
[0064]1.lPre-MICA_His/pPIC9K 质粒的构建
[0065]1.1.1克隆完整的MICA基因的编码序列(Metl_Ala383)
[0066]用TRIzol并按其说明书抽取离体的健康人外周血(购自合肥血站)单核细胞的总RNA,在M-MLV Reverse Transcriptase的作用下，以oligo dT为引物合成人cDNA。再以合成的cDNA为模板，用引物-1 (SEQ ID No: 3)和引物_2(SEQ ID No: 4)进行PCR，将PCR产物插入到TA载体pMD18-T，获得MICA/pMD18T。质粒委托英俊公司测序，结果与预期一致。
[0067]1.1.2扩增Pre序列、MICA编码序列(Glu24_Gln308)和6 XHis标签的融合片段Pre-MICA-His
[0068](I)以 MICA/pMD18T 质粒为模板，用引物-3(SEQ ID No:5)和引物 _4(SEQ IDNo:6)进行PCR，PCR反应条件为:先94°C 3分钟；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分钟，共30个循环；最后72°C 10分钟。反应结束后，将得到的PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约920bp的条带，与预期结果相符。最后，用PCR产物回收试剂盒对PCR片段进行回收。
[0069](2)用上述(I)的PCR回收产物为模板，用引物-5 (SEQ ID No:7)和引物_4(SEQID No:6)进行PCR，PCR反应条件为:先94°C 3分钟；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C I分钟，共30个循环；最后72°C 10分钟。反应结束后，将得到的PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约955bp的条带，与预期结果相符。最后，用PCR产物回收试剂盒对PCR片段进行回收，进而获得了 Pre-MICA-His片段(N末端带有BamH I限制性酶切位点，C末端带有Not I限制性酶切位点)。
[0070]1.1.3Pre-MICA-His 片段与 pPIC9K 质粒的连接
[0071]用BamH I和Not I分别双酶切Pre-MICA-His片段和pPIC9K质粒，分别纯化回收Pre-MICA-His片段和pPIC9K质粒，再用T4DNA连接酶连接，并转化感受态大肠杆菌DH5 α，筛选阳性克隆。阳性重组质粒委托英俊公司测序，结果表明Pre-MICA-His片段和pPIC9K质粒正确连接，且Pre-MICA-His序列与预期一致，进而获得了 Pre-MICA-His/pPIC9K表达质粒，整个构建流程见图1。
[0072]以上所述质粒中MICA蛋白的编码序列如下所示:(ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCC GCATTAGCT)〈GAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGT CCTG
【权利要求】
1.一种用于在毕赤酵母中高效表达重组人MICA蛋白的表达盒，其特征在于所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件: (1)控制基因转录的毕赤酵母启动子； (2)控制所述重组人MICA在毕赤酵母中分泌表达的信号肽序列； (3)所述重组人MICA的编码序列；和 (4)转录终止子； 其中所述信号肽序列为a -factor的Pre序列，其核酸序列如SEQ ID No:9所示。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述重组人MICA的编码序列如SEQID No: 10所示。
3.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述启动子为PPIC9K质粒中的AOXl启动子，并且所述转录终止子为PPIC9K质粒中的AOXl转录终止子。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其序列如SEQID No: 13所示。
5.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述启动子为pGAPZa -A质粒中的GAP启动子，并且所述转录终止 子为pGAPZ a -A质粒中的GAP转录终止子。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其序列如SEQID No: 14所示。
7.一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌含有权利要求3或4所述的表达盒。
8.一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌含有权利要求5或6所述的表达盒。
9.一种甲醇诱导表达并纯化人MICA蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: (1)培养根据权利要求7所述的毕赤酵母工程菌，并且用甲醇诱导毕赤酵母AOXl启动子，使得所述工程菌分泌表达人MICA蛋白；和 (2)从发酵液中纯化所述人MICA蛋白。
10.一种组成型表达并纯化人MICA蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: (1)培养根据权利要求8所述的毕赤酵母工程菌，并且利用GAP启动子使得所述工程菌组成型分泌表达人MICA蛋白；和 (2)从发酵液中纯化所述人MICA蛋白。
【文档编号】C07K14/47GK103789340SQ201410027717
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】肖卫华, 钟永军, 马佳佳, 邬婧, 仰露, 康文瑶, 田志刚 申请人:中国科学技术大学