太子参环肽b标准品的制备方法
【专利摘要】提供标准品太子参环肽B的制备方法，从中药太子参中提取分离纯化标准品太子参环肽B，太子参干药材粉碎后用工业乙醇热回流提取，浸膏经乙醇前处理后，用硅胶柱层析进行太子参环肽B的富集，洗脱溶剂为氯仿-甲醇系统，最后经制备型高效液相色谱制备得到纯度在98%以上的太子参环肽B。本发明的方法能快捷分离得到太子参环肽B，样品损失少，成本较低，操作方便，可控性和重现性好，溶剂可以反复回收利用，适用于工业生产。
【专利说明】太子参环肽B标准品的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种以中药太子参为原料制备标准品太子参环肽B的提取分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]太子参(PseudostellariaeRadix, ‘Tai Zi Shen’)是石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，别名异叶假繁缕，是常用中药。现市售太子参主要来自安徽、贵州、福建、江苏、山东等种植基地。味甘、微苦，平，归脾、肺经，具有益气健脾、生津润肺等功效，用于脾虚体倦，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳，为补气中药中的一味清补之品，特别适合作为少儿、老年人、久病恢复病人的滋补佳品。现代药理研究表明，太子参具有增强免疫、抗疲劳、抗应激、抗氧化、抗衰老、抗真菌等多种药理活性，而且在治疗白细胞减少症、心绞痛、肺炎、淋巴结核、糖尿病、继发性再生障碍性贫血等症方面取得了突破。
[0003]目前已报道从太子参中分离得到的化合物类型有环肽、皂苷、氨基酸、糖、油脂、挥发性物质、磷脂及脂肪酸等，其成分与功效之间的关系至今尚不够明确。很多学者认为环肽类成分是太子参的特征性成分，1993年谭宁华等首先从太子参中发现了 2个新环肽类成分太子参环肽A和B (Heterophyllin A, B),现已从太子参中分离报道10多个环肽类成分，2010年版《中华人民共和国药典》新增加了太子参环肽B含量测定指标，建立了其HPLC含量测定方法，用于太子参药材的质量控制。
[0004]有关标准品太子 参环肽B的制备工艺的国内外报道较少，现有技术中未见有可应用于工业生产的太子参环肽B的制备方法。因此，有必要寻找一种简便、安全、经济高效、可应用于工业化生产的太子参环肽B的制备方法。
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的旨在针对现有技术的上述不足，提供一种简单快速、样品损失少、成本低、可控性和重现性好、适用于工业化生产的太子参环肽B标准品的制备方法，建立一种通过多种现代分离分析技术手段相结合的方法。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]太子参环肽B标准品的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)提取:太子参药材晒干，粉碎至粒径20-80目，加入4-10倍体积的95%工业乙醇进行热回流提取，热回流温度75-85°C，提取时间2-4h，每次过滤后将残渣重复提取过程2-3次，合并提取液，减压浓缩至比重1.1-1.2 ；
[0009](2)前处理:向浸膏中加入5-15倍体积的95%工业乙醇于75_85°C热回流溶解l-3h，冷却静置8-24h，过滤浓缩滤液，得到太子参环肽总提物；
[0010](3)富集:将上述太子参环肽总提物用少量甲醇溶解，拌入拌样用柱层析硅胶，干燥，加载于分离用层析硅胶柱床顶端，用氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，收集流出液，TLC检测环肽成分，合并所有含环肽部分，回收溶剂，干燥得到太子参环肽B粗品，HPLC-MS分析，快速锁定目标产物；
[0011](4)分离纯化:取上述富集产物，甲醇溶解过滤，用制备型高效液相色谱进行跟踪分离纯化，流动相为乙腈-水溶液，根据HPLC-MS分析结果，收集太子参环肽B色谱峰流出液，回收溶剂，干燥得到纯度98%以上的太子参环肽B纯品。
[0012]上述步骤(1)中的太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla (Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根。
[0013]上述步骤(1)中热回流提取所用溶剂为原药材4-10倍体积的95%工业乙醇，提取时间2-4h，温度75-85°C，每次过滤后将残渣重复提取过程2-3次，合并提取液，减压浓缩至比重 1.1-1.2。
[0014]上述步骤(2)中前处理所用溶剂为浸膏5-15倍体积的95%工业乙醇，热回流溶解时间为l_3h，温度75-85°C，冷却静置时间为8-24h。
[0015]上述步骤(3)中所用拌样用柱层析硅胶为100-200目，用量为太子参环肽总提物重量的1-1.5倍，分离用柱层析硅胶为200-300目，用量为太子参环肽总提物的15-40倍。
[0016]上述步骤(3)中所用洗脱溶剂为氯仿-甲醇溶剂系统，梯度或等度洗脱:20-40:1 (6-14BV)，6-12:1(6-14BV)。
[0017]上述步骤(3)中所用TLC环肽检测方法:薄层板为硅胶G板，样品点于硅胶G板上，用氯仿-甲醇(8:2-9:1)展开，挥掉溶剂后，在100-120°C用4-8NHC1溶液水解30_60min后，再喷洒2%-5%茚三酮乙醇溶液显色剂，加热后显桔黄色至橙红色斑点。
[0018]上述步骤(3)中所述HPLC-MS检测分析太子参环肽B的方法，HPLC色谱条件为:色谱柱:C18柱，柱温:室温，流动相:乙腈-7K，乙腈在流动相中的比例为:0-20min，20%-32% ；20-40min, 32% ；40-50min, 32%_45%，流速:1.0ml/min,检测:DAD 检测器，检测波长:203nm。质谱条件为:电离方式为电喷雾离子源(ESI)正离子模式，喷雾电压3kV，椎孔电压42V，离子源为450°C，雾化气流速650L/Hr，辅助气流量50L/Hr，碰撞能量38V，0.2秒内的质量扫描范围为 m/z100-1000。
[0019]上述步骤(4)中制备型液相色谱色谱柱为:C18柱，流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为0-20min: 15-32%, 20-40min:32%，检测波长203nm。
[0020]与现有技术相比，本发明的优益性和显著优点在于:
[0021](I)采用工业乙醇提取，减少了太子参中糖类、苷类等大极性物质的溶出，促进了环肽类成分的溶出，提取率高，且毒性低。
[0022](2)采用乙醇热回流溶解对提取浸膏进行前处理，可快速除掉大部分糖类、苷类等大极性物质，与传统有机溶剂萃取相比，具有操作简单、溶剂用量少、稳定性好等优点。
[0023](3)用制备型HPLC分离前，先用硅胶柱层析方法对太子参环肽进行富集，可除掉大部分杂质，避免干扰，使上样量得到很大提高，并减少对色谱柱的污染。
[0024](4)将HPLC-MS连用技术与制备型HPLC相结合，实现了太子参环肽B的快速识别和高通量快速制备，大大简化了物质分离纯化步骤，快速、高效，适合工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】:
[0025]图1为太子参环肽B制备工艺流程图；[0026]图2为太子参环肽B化学结构；
[0027]图3为硅胶富集得到太子参环肽B粗品的HPLC液相色谱图(A)和HPLC-MS总离子流图(B)。
【具体实施方式】:
[0028]下面结合附图，用本发明的具体实例来进一步阐述本发明的实质性内容，但是本发明的保护范围并不限于这些实例，根据本发明的实质对本发明进行的改进都属于本发明的范围。
[0029]实施例1:
[0030](I)取太子参药材原料500g，粉碎至粒径60目后，加入6倍体积的95%工业乙醇后，于80°C进行热回流提取，提取时间3h，提取后将提取液抽滤出来，再重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至比重1.15，得到乙醇浸膏65.00g，太子参环肽B的含量为
0.23%。向浸膏中加入10倍体积的95%工业乙醇热回流溶解2h，冷却静置10h，过滤，收集滤液，浓缩回收溶剂得到太子参总环肽提取物16.50g，太子参环肽B的含量为0.86%，富集率为 93.09%ο
[0031](2)硅胶柱层析富集太子参环肽B:上述太子参总环肽提取物用少量甲醇溶解后与等量100-200目硅胶拌样，挥干溶剂后，称取30倍量200-300目硅胶，湿法装柱，径高比(1:9)，干法上样，用氯仿-甲醇梯度洗脱:25:1 (9BV),10:1 (10BV)收集洗脱液，每1/2BV收集一份，TLC检测环肽，合并所有含环肽部分，回收溶剂干燥得到太子环肽B粗品1.15g，HPLC, HPLC-MS分析检测，太子参环肽B含量为11.12%，富集率为83.14%。
[0032](3)制备型高效液相色谱分离纯化太子参环肽B:色谱柱为SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;检测波长:203nm，收集太子参环肽 B色谱峰流出液，减压回收溶剂得到太子参环肽B116mg，纯度在98%以上，富集率为91.07%。
[0033]实施例2:
[0034](I)取太子参药材原料500g，粉碎至粒径80目后，加入5倍体积95%工业乙醇后，于85°C进行热回流提取，提取时间3h，提取后将提取液抽滤出来，再重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至比重1.2，得到乙醇浸膏64.50g，太子参环肽B的含量为0.24%。向浸膏中加入9倍体积95%工业乙醇热回流溶解2h，冷却静置10h，过滤，收集滤液，浓缩回收溶剂得到太子参总环肽提取物17.50g，太子参环肽B的含量为0.84%，富集率为93.44%。
[0035](2)硅胶柱层析富集太子参环肽B:上述太子参总环肽提取物用少量甲醇溶解后与等量100-200目硅胶拌样，挥干溶剂后，称取25倍量200-300目硅胶，湿法装柱，径高比(1:8)，干法上样，用氯仿-甲醇梯度洗脱:30:1 (9BV),9:1 (10BV)收集洗脱液，每1/2BV收集一份，TLC检测环肽，合并所有含环肽部分，回收溶剂干燥得到太子环肽B粗品1.08g，HPLC, HPLC-MS分析检测，太子参环肽B含量为10.05%,富集率为75.93%。
[0036] (3)制备型高效液相色谱分离纯化太子参环肽B:色谱柱为SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;检测波长:203nm，收集太子参环肽 B色谱峰流出液，减压回收溶剂得到太子参环肽B99mg，纯度在98%以上，富集率为92.01%。[0037]实施例3:
[0038](I)取太子参药材原料500g，粉碎至粒径40目后，加入7倍体积95%工业乙醇后，于85°C进行热回流提取，提取时间3h，提取后将提取液抽滤出来，再重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至比重1.15，得到乙醇浸膏66.00g，太子参环肽B的含量为0.23%。向浸膏中加入11倍体积95%工业乙醇热回流溶解1.5h，冷却静置12h，过滤，收集滤液，浓缩回收溶剂得到太子参总环肽提取物17.00g，太子参环肽B的含量为0.83%，富集率为93.25%。
[0039](2)硅胶柱层析富集太子参环肽B:上述太子参总环肽提取物用少量甲醇溶解后与等量100-200目硅胶拌样，挥干溶剂后，称取25倍量200-300目硅胶，湿法装柱，径高比(1:8)，干法上样，用氯仿-甲醇梯度洗脱:30:1 (10BV),9:1 (10BV)收集洗脱液，每1/2BV收集一份，TLC检测环肽，合并所有含环肽部分，回收溶剂干燥得到太子环肽B粗品1.05g，HPLC, HPLC-MS分析检测，太子参环肽B含量为10.78%，富集率为76.43%。
[0040](3)制备型高效液相色谱分离纯化太子参环肽B:色谱柱为SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为15%(Omin) -32 %(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;检测波长:203nm，收集太子参环肽 B色谱峰流出液，减压回收溶剂得到太子参环肽B107mg，纯度在98%以上，富集率为89.54%。
[0041]实施例4:
[0042](I)取太子参药材原料4kg，粉碎至粒径60目后，加入6倍体积95%工业乙醇后，于85°C进行热回流提取，提取时间3h，提取后将提取液抽滤出来，再重复以上过程2次，合并三次提取液，减压浓缩至比重1.2，得到乙醇浸膏544.00g，太子参环肽B的含量为0.22%。向浸膏中加入10倍体积95%工业乙醇热回流溶解2h，冷却静置10h，过滤，收集滤液，浓缩回收溶剂得到太子参总环肽提取物139.40g，太子参环肽B的含量为0.83%，富集率为94.83%。
[0043](2)硅胶柱层析富集太子参环肽B:上述太子参总环肽提取物用少量甲醇溶解后与等量100-200目硅胶拌样，挥干溶剂后，称取30倍量200-300目硅胶，湿法装柱，径高比(1:10)，干法上样，用氯仿-甲醇梯度洗脱:30:1(1(?￥)，10:1(1(?￥)收集洗脱液，每1/28￥收集一份，TLC检测环肽，合并所有含环肽部分，回收溶剂干燥得到太子环肽B粗品8.80g,HPLC, HPLC-MS分析检测，太子参环肽B含量为9.06%,富集率为68.89%。
[0044](3)制备型高效液相色谱分离纯化太子参环肽B:色谱柱为SunFierprep C18 (5 μ m, 19mm X 250mm),流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为15%(Omin) -32%(20min) -32%(40min);流速:10ml/min ;检测波长:203nm，收集太子参环肽 B色谱峰流出液，减压回收溶剂得到太子参环肽B717mg，纯度在98%以上，富集率为90.35%。
【权利要求】
1.太子参环肽B标准品的制备方法，包括以下步骤: (1)提取:太子参药材晒干，粉碎至粒径20-80目，加入太子参药材4-10倍体积的95%工业乙醇进行热回流提取，合并提取液、浓缩至比重为1.1-1.2的浸膏； (2)前处理:向浸膏中加入5-15倍体积的95%工业乙醇热回流溶解l-3h，冷却静置8_24h，过滤浓缩滤液，得到太子参环肽总提物； (3)富集:将上述太子参环肽总提物用少量甲醇溶解，拌入拌样用柱层析硅胶，干燥，加载于分离用层析硅胶柱床顶端，用氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱，收集流出液，TLC检测环肽成分，合并所有环肽部分，回收溶剂，干燥得到太子参环肽B粗品，HPLC-MS分析，快速锁定目标产物； (4)分离纯化:取上述富集产物，甲醇溶解过滤，用制备型高效液相色谱进行跟踪分离纯化，流动相为乙腈-水溶液，根据HPLC-MS分析结果，收集太子参环肽B色谱峰流出液，回收溶剂，干燥得到纯度98%以上的太子参环肽B纯品。
2.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax etHoffm.的干燥块根。
3.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(I)中热回流提取所用溶剂为原料4-10倍体积的95%工业乙醇，提取时间2-4h，温度75-85°C，每次过滤后将残渣重复提取过程2-3次，合并提取液，减压浓缩至比重1.1-1.2。
4.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中前处理所用溶剂为浸膏5-15倍体积的95%工业乙醇，热回流溶解时间为l_3h，温度75-85°C，冷却静置时间为8-24h。
5.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中富集目标产物所用层析柱为硅胶柱，装柱方法为湿法装住，所用装柱硅胶为200-300目柱层析硅胶，用量为太子参环肽总提物的15-40倍重量，上样方法为干法上样，拌样用硅胶为100-200目柱层析硅胶，用量为太子参环肽总提物的1-1.5倍重量，洗脱溶剂为氯仿-甲醇溶剂梯度洗脱:20-40:1 (6-14BV)，6-12:1 (6-14BV)。
6.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中TLC检测环肽所用薄层板为硅胶G板，样品点于硅胶G板上，用8:2-9:1的氯仿-甲醇展开，挥掉溶剂后，在100-120°C用4-8N HCl溶液水解30_60min后，再喷洒2%_5%茚三酮乙醇溶液显色剂，加热后显桔黄色至橙红色斑点。
7.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中HPLC-MS分析方法:HPLC色谱条件为:色谱柱:C18柱，柱温:室温，流动相:乙腈-/K，乙腈在流动相中的比例为:0-20min,20%-32% ；20-40min, 32% ；40-50min, 32%-45%,流速:l.0ml/min,检测:DAD检测器,检测波长:203nm ;质谱条件为:电离方式为电喷雾离子源正离子模式，喷雾电压3kV，椎孔电压42V，离子源为450°C，雾化气流速650L/Hr，辅助气流量50L/Hr，碰撞能量38V，0.2秒内的质量扫描范围为m/z100-1000。
8.按照权利要求1所述的太子参环肽B标准品的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中制备型高效液相色谱分离纯化所用色谱柱为:C18柱，流动相为乙腈-水体系，乙腈在流动相中的比例为0-20min: 15-32%, 20-40min:32%，检测波长203nm。
【文档编号】C07K1/16GK103923191SQ201410174961
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】谭宁华, 赵丽梅, 宋卫武 申请人:中国科学院昆明植物研究所