一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：(1)除去海鲈鱼加工副产物中的杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构；(2)加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物；(3)加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶原蛋白肽；(4)灭酶，冷却；(5)脱腥脱色；(6)离心，取上清液；(7)通过膜分离截留上清液中分子量1000~3000Da的胶原蛋白肽组分；(8)将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩；(9)冻干成粉末。该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的高活性的生物活性肽。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物活性肽的制备方法，尤其涉及一种酶法制备具有促进伤口愈 合活性的海洋胶原蛋白肽的方法。 一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的 方法
【背景技术】
[0002] 海S卢鱼(学名又称七星S卢、花S卢，为福鳍鱼纲S卢形目真 鲈科花鲈属，分布于西太平洋，是广东省产量最大的海洋经济鱼。海鲈鱼在加工过程中会 产生大量鱼头、鱼骨和鱼皮等副产物，通常丢弃或者加工成动物饲料，既污染了环境又浪费 了资源。Nagai等发现海鲈的鱼皮、鱼骨和鱼鳍中胶原蛋白的含量分别为51. 4%、40. 7%和 41.6% (以干基计)。胶原蛋白由于其三股螺旋结构性质比较稳定，进入人体小肠后吸收率 很低；但是降解为胶原蛋白肽以后吸收率可高达90%。因此，从鱼加工副产物中制备生物活 性肽已经成为研究热点。已有报道采用木瓜蛋白酶水解鱼皮明胶制备抗氧化肽，Zhuang等 采用碱性蛋白酶水解海蜇胶原蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽。然而，从鱼加工副产物 中制备具有伤口愈合作用生物活性肽的研究还很少。
[0003] 目前，针对创伤患者专用型临床营养品在市场上非常缺乏，急需开发有助于伤口 愈合的功能配料。成纤维细胞是非常重要的创伤修复细胞，在伤口愈合过程中参与肉芽组 织形成，合成并分泌胶原、纤维连接蛋白和透明质酸等细胞外基质来参与皮肤组织重塑过 程。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽 的方法，该方法是由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的 高活性的生物活性肽，可以解决现有海鲈鱼加工副产物浪费得不到合理利用以及创伤患者 专用临床营养品配料缺乏的问题。
[0006] 为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种酶法制备具有促进伤口愈 合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤： (1) 预处理：将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂 处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解； (2) 胶原蛋白的提取：加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥 后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶 原蛋白肤； (4) 灭酶：对得到的酶解液进行灭酶，冷却； (5) 脱腥脱色：向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色； (6) 离心：将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液； (7) 膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量100(T3000Da的胶原蛋白肽组分； (8) 浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干； (9) 冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。
[0007] 以海鲈鱼加工副产物为原料，其中必存在杂蛋白、钙、油脂等杂质，这必会影响胶 原蛋白的纯度，因而在提取胶原蛋白前必须去除上述杂质。杂蛋白能溶解于碱性溶液中，因 此在预处理中采用碱性溶液对海鲈鱼加工副产物进行处理，将杂蛋白溶解除去，然后在脱 钙脱脂。在碱性溶液对海鲈鱼加工副产物溶解杂蛋白的同时，由于碱性溶液的水解作用，使 得胶原蛋白的三股螺旋结构被打开，有利于提高后续酶解效果。
[0008] 进一步地，所述步骤（1)中具体处理步骤为：往海鲈鱼加工副产物中添加其质量 15~20倍的0. lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡15~30h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用 其质量15~20倍的0. 6mol/L的盐酸浸泡15~30h以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量 2?3倍的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反复两次，共脱脂4(T48h。
[0009] 进一步地，所述步骤（2)中具体处理步骤为：脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸 馏水洗涤，浙干，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min离心15?20min 后取上清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为10-22%。
[0010] 进一步地，所述步骤⑶中胶原蛋白溶液的质量体积浓度为1〇%，所用蛋白酶为碱 性蛋白酶。碱性蛋白酶的酶解条件是：酶添加量为底物重量的2~3%、酶解温度45飞0°C、酶 解时间2?4h和pH值8. 5?9. 5,在此条件下胶原蛋白肽提取率为4(Γ48. 6%。
[0011] 进一步地，所述步骤（4)中，灭酶操作是：9(T95°C水浴加热l(Tl5min灭酶。
[0012] 进一步地，所述步骤（5)中脱腥脱色条件为：加入胶原蛋白重量4~6%的活性炭， 45°C 水浴加热 40-50min。
[0013] 进一步地，所述步骤（6)中的具体操作为：4000?4500r/min离心15?20min。
[0014] 进一步地，所述步骤（7)中的具体操作为：依次采用3000Da和lOOODa的超滤膜截 留离心后的上清液，分离得到100(T3000Da的胶原蛋白肽组分。
[0015] 进一步地，所述步骤（8)中的具体操作为：将分离得到的胶原蛋白肽组分于50°C 旋转蒸发20-30min。
[0016] 进一步地，所述步骤（9)中的具体操作为：-80至-20°C冷冻干燥4(T48h即可得海 鲈鱼胶原蛋白肽产品。
[0017] 本发明所得的海鲈鱼胶原蛋白肽产品含苯丙氨酸20~50μ g/100mg，甘氨酸 30?50 μ g/100mg，赖氨酸 10?20 μ g/100mg。
[0018] 本发明与现有技术相比具有以下有益效果： (1)本发明以成纤维细胞增殖活性为评价指标，筛选采用碱性蛋白酶结合膜分 离技术来制备具有伤口愈合作用的生物活性肽，分子量在1000-3000Da，含苯丙氨酸 20?50 μ g/100mg，甘氨酸30?50 μ g/100mg，赖氨酸10?20 μ g/100mg，通过动物实验验证该 生物活性肽可以增加伤口组织的羟脯氨酸含量和促进伤口愈合，因此可用作创伤患者专用 临床营养品的配料。
[0019] 本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽促进伤口愈合的动物实验结果： 1、试验条件 1. 1样品 本发明制备的海鲈鱼胶原蛋白肽粉末（SBCP )。
[0020] 1.2实验动物 KM小鼠，雄性，体重18-22g，SPF级，由南方医科大学实验动物中心提供。
[0021] 1.3分组及处理 (1)分组 KM小鼠72只，适应性喂养1周后随机分为4组，每组18只，包括对照组（Control)和3 个SBCP剂量组。SBCP低剂量组（Low)给药浓度为0. 2g/ kg*bw，SBCP中剂量组（Moderate) 给药浓度为0.66 g/ kg*bw，高剂量组（High)给药浓度为2.0 g/ kg*bw。
[0022] (2)处理 每日除了饲喂各组小鼠2 g/10g*bw基础饲料，还需在上午11 :00灌胃相应的药物，灌 胃体积为200yl/10g*bw。对照组给予等体积生理盐水灌胃。分别在第5、9、15天各组随机 挑选6只小鼠拉颈处死。
[0023] 1. 4数据分析 采用SPSS进行数据分析。
[0024] 2、实验结果 2. 1海鲈鱼胶原蛋白肽对小鼠皮肤伤口愈合率的影响如表1和图1所示：
【权利要求】
1. 一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 预处理：将海鲈鱼加工副产物洗净绞碎，依次经碱性溶液脱杂蛋白、酸脱钙和脱脂 处理，除去杂蛋白及杂质，并打开胶原蛋白的三股螺旋结构，便于酶解； (2) 胶原蛋白的提取：加酸提取预处理后海鲈鱼加工副产物中的胶原蛋白，冷冻干燥 后得到的胶原蛋白粉作为下一步酶解制备胶原蛋白肽的底物； (3) 酶解：加水制成胶原蛋白溶液，向其中加入蛋白酶进行酶解，将胶原蛋白转化成胶 原蛋白肤； (4) 灭酶：对得到的酶解液进行灭酶，冷却； (5) 脱腥脱色：向灭酶后的酶解液中加入适量活性炭，以脱腥脱色； (6) 离心：将脱腥脱色后的酶解液离心，取上清液； (7) 膜分离：通过膜分离截留上清液中分子量100(T3000Da的胶原蛋白肽组分； (8) 浓缩：将膜分离所得的胶原蛋白肽组分旋转蒸发浓缩，便于冻干； (9) 冻干：将浓缩后上清液冷冻干燥成粉末，即为成品，于干燥条件下贮存起来。
2. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（1)中具体处理步骤为：往海鲈鱼加工副产物中添加其质量15~20倍 的0. lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡15~30h，以去除杂蛋白；用蒸馏水洗至中性，再用其质量 15~20倍的0. 6mol/L的盐酸浸泡15~30h以脱钙；用蒸馏水洗至中性，最后用其质量2~3倍 的8?12%的乙醚浸泡15?30h，反复两次，共脱脂4(T48h。
3. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（2)中具体处理步骤为：脱脂完成后，海鲈鱼加工副产物经蒸馏水洗 涤，浙干，用等量的〇. 5mol/L的乙酸溶液浸泡2?3d，400(T4500r/min离心15?20min后取上 清，冷冻干燥后，以海鲈鱼加工副产物的干重计，胶原蛋白得率为10-22%。
4. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（3)中胶原蛋白溶液的质量体积浓度为10%，所用蛋白酶为碱性蛋白 酶。
5. 根据权利要求4所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方 法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的酶解条件是：酶添加量为底物重量的2~3%，酶解温度 45?50°C，酶解时间2?4h和pH值8. 5?9. 5,所得胶原蛋白肽提取率为4(Γ48. 6%。
6. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（4)中，灭酶操作是：9(T95°C水浴加热l(Tl5min灭酶。
7. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（5)中脱腥脱色条件为：加入胶原蛋白重量4~6%的活性炭，45°C水浴 加热 40_50min。
8. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（7)中的具体操作为：依次采用3000Da和lOOODa的超滤膜截留离心 后的上清液，分离得到l〇〇(T3000Da的胶原蛋白肽组分。
9. 根据权利要求1所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法， 其特征在于，所述步骤（6)中的具体操作为：400(T4500r/min离心15?20min ;所述步骤（8) 中的具体操作为：将分离得到的胶原蛋白肽组分于50°C旋转蒸发20-30min ;所述步骤（9) 中的具体操作为：_80至_20°C冷冻干燥4(T48h即得海鲈鱼胶原蛋白肽产品。
10.由上权利要求1、任一项所述的酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶 原蛋白肽的方法制备的海洋胶原蛋白肽，其特征在于，所得的海鲈鱼胶原蛋白肽的分 子量为100(T3000Da，含苯丙氨酸2(Γ50 μ g/100mg，甘氨酸3(Γ50 μ g/100mg，赖氨酸 10?20 μ g/100mg。
【文档编号】C07K14/78GK104109705SQ201410274645
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】刘磊, 张名位, 魏振承, 张瑞芬, 邓媛元, 唐小俊, 池建伟, 李健雄 申请人:广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所, 广东宝桑园健康食品有限公司, 广州力衡临床营养品有限公司