一种荧光探针及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光探针及其制备方法与在检测G-四链体核酸构象中的应用，具体结构式为式中R1为F或N-甲基哌嗪基，R2为N-甲基哌嗪基。该类探针制备简单、易得，并且结构稳定，可用于特异性检测正平行构象的G-四链体核酸二级结构，通过荧光分光光度计可以快速检测出溶液中的DNA样品的二级结构。该类探针对正平行构象的G-四链体核酸二级结构的检测方法具有操作简便，选择性好的优点，并且克服了其他检测方法难以区分G-四链体核酸的多种不同构象，价格昂贵，设备要求高，技术操作相对复杂等缺点。
【专利说明】一种荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及探针，更具体地，涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] G-四链体（G-quadruplex)是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟 嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动 子区域，如 c_kit、c-myc、c-myb、bcl_2、FOGF、kRAS、VEGF、Rb 和膜岛素基因等。G-四链体 结构具有多态性，链的数量和取向、l〇〇P的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基 负电中心配位的金属离子等多方面决定了 G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白 和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行 与混合型三种构象。
[0003] G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某 些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被 认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等 一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链 体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体 结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。
[0004] 目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大 过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要 解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前能够 对G-四链体构象进行鉴定的探针非常少，体外实验中检测G-四链体构象主要是通过仪器 的手段，比如圆二色谱法、核磁共振等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而 且价格较昂贵，基本上不能普及使用。
[0005] 近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其 苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类 结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而 申请人:实验室前期的工作中合成了 一系列的三芳基咪唑类的化合物，其对正平行构象的G-四链体具有较好的选择性和结合 能力。 申请人:将香豆素结构融合到三芳基咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该 探针选择性识别正平行构象的G-四链体。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种荧光探针，其特征在于结构式为：
[0007]
【权利要求】
1. 一种荧光探针，其特征在于结构式为：
式中&选自F或N-甲基哌嗪基，R2选自N-甲基哌嗪基。
2. -种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物
再将
在P0C13的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体
容于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2C03,反应 生成
彡醛基香豆素中间体
应，得到最终探针化合物。
3. 如权利要求1所述的荧光探针在检测G-四链体结构中的应用。
4. 一种检测G-四链体结构的方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将待测DNA溶于PH值7. 2-7. 4的缓冲液，得到溶液A ;将所述探针溶解，再用PH值 7. 2-7. 4的缓冲液稀释，得到溶液B ; 2) 将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1?10,混合后对 混合液进行荧光光谱分析，或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为正平行构 象的G-四链体结构；判断方法如下： (a) 在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到 荧光增强，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构； (b) 对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则 待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，判断方法（b)中，与溶液B相比，若混合液的 荧光发射强度增强30?200倍，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。
6. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。
7. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述探针用二甲基亚砜溶解。
8. 如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，溶液A和溶液B的混合反应时间为1分 钟。
【文档编号】C07D405/04GK104151301SQ201410328648
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】黄志纾, 谭嘉恒, 吴伟彬, 陈硕斌, 胡命豪 申请人:中山大学