一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法
【专利摘要】本发明提供了一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法，包括如下步骤：1)准备原料：将含三尖杉宁碱的紫杉醇粗品溶解于有机溶剂中制成溶液A；将高锰酸钾溶解于有机溶剂中制成溶液B；2)反应：溶液A与溶液B反应，并将反应后的溶液过滤；3)一次结晶：将步骤2)所得滤液结晶；4)柱层析：将步骤3)所得产物过滤干燥后进行柱层析，收集含紫杉醇的有效段，浓缩干燥；5)二次结晶：将步骤4)得到的干燥物进行结晶处理，得到紫杉醇含量在98.5wt％以上的紫杉醇纯品。该方法三尖杉宁碱去除效果好，对紫杉醇本身无影响，紫杉醇纯度和回收率均较高，并且该方法操作灵活简便，反应及处理条件温和，降低了精制步骤的难度，适于工业化生产。
【专利说明】一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及紫杉醇的分离纯化【技术领域】，尤其涉及一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法。
【背景技术】
[0002]紫杉醇是近二十年来世界上发现的最有希望的抗癌药物，于1967年首次从短叶红豆杉树皮中分离获得，已被美国FDA批准用于卵巢癌、乳腺癌以及非小细胞肺癌等的治疗。
[0003]紫杉醇属于二萜类生物碱，在红豆杉属植物中含量都很低，只有0.0004%至
0.01% (w/w)，如此低的含量使从原料中提取和纯化紫杉醇以达到纯品的要求非常困难。天然红豆杉资源极为有限，且红豆杉生长缓慢，无法满足紫杉醇生产的需要。因此，纯化紫杉醇的方法显得尤为重要。
[0004]三尖杉宁碱是与紫杉醇共生的一种天然紫杉烷类化合物和紫杉醇在化学结构上只有酰胺基侧链有所不同。由于三尖杉宁碱和紫杉醇在结构和性质上极其相似，从而造成紫杉醇与三尖杉宁碱的分离十分困难，反复多次分离是必需的。此外，作为一种生物大分子物质，紫杉醇受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，容易发生降解或异构而生成其他紫杉烷类物质。作为临床使用中的药品，紫杉醇在实际应用中其纯度要求很高。紫杉醇资源珍贵、价格居高不下，分离的纯度和收率成为制约药用紫杉醇成本的关键因素。基于上述几个方面，使得开发更加高效、廉价的分离纯化技术以及新型的生产分离纯化工艺，成为紫杉醇研究中的焦点问题。
[0005]目前常用的分离纯化紫杉醇与紫杉醇类似物的方法主要有柱层析法、薄层色谱法、沉淀法、胶束动电色谱法、膜分离法、树脂吸附分离法、化学反应法等。但是，这些方法尚不能够有效地分离紫杉醇和三尖杉宁碱。
[0006]除了上述方法之外，研究人员还提出了一些除去紫杉醇中的三尖杉宁碱的方法，如专利US5334732和US5336648中介绍了用臭氧氧化三尖杉宁碱侧链的方法；专利CN96193149中介绍了用卤素加成在三尖杉宁碱侧链上，再由正相硅胶柱分离的方法。但是，这两种方法也存在缺点:用臭氧氧化粗提物时，将会产生许多副反应，臭氧分解反应是很强的、而且是无选择性的，能将紫杉醇和三尖杉宁碱中的许多官能团发生不希望的氧化反应，例如同紫杉醇分子中的酮，醇，胺等反应，或者同紫杉醇及三尖杉宁碱的紫杉烷环上的双键反应，此外，臭氧发生器设备也很昂贵，生产成本高；卤素加成的方法对反应的条件要求比较苛刻，需要在0-5°C左右，避光，反应曝光太长或卤素过量会造成紫杉醇降解，并且溴作为一种低沸点液体卤素并且毒性较大的情况下，对于生产条件有较高的要求。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法，该方法能够在不影响紫杉醇性质的情况下高效地除去紫杉醇中的三尖杉宁碱，所得紫杉醇纯度较高，并且反应及处理条件温和,紫杉醇回收率高。
[0008]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]—种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法，包括如下步骤:
[0010]I)准备原料:将含三尖杉宁碱的紫杉醇粗品溶解于有机溶剂中制成溶液A ;将高锰酸钾溶解于有机溶剂中制成溶液B ;
[0011]2)反应:在溶液A中加入溶液B进行反应,并将反应后的溶液过滤；
[0012]3) 一次结晶:将步骤2)所得滤液结晶，过滤和干燥后得到三尖杉宁碱含量在Iwt %以下的紫杉醇粗品；
[0013]4)柱层析:将步骤3)所得紫杉醇粗品进行柱层析，收集含紫杉醇的有效段，浓缩干燥；
[0014]5) 二次结晶:将步骤4)得到的干燥物进行结晶处理，将结晶物过滤和干燥后得紫杉醇含量在98.5wt%以上的紫杉醇纯品。
[0015]本发明所述方法将含三尖杉宁碱的紫杉醇粗品有机溶液加入有机溶剂溶解的高锰酸钾，使三尖杉宁碱与高锰酸钾反应生成三尖杉宁碱络合物，由于高锰酸钾在溶剂中的溶解度不大，本发明所述方法将紫杉醇粗品和高锰酸钾分别配制成溶液，有效提高了高锰酸钾与紫杉醇粗品溶液中三尖杉宁碱的接触，从而提高了反应效率和三尖杉宁碱从紫杉醇中分离的效率；反应完全之后将反应液过滤、一次结晶并在50?60°C干燥后得到三尖杉宁碱含量低于lwt%以下的紫杉醇粗品；再经柱层析、二次结晶后得到98.5wt%以上的紫杉醇纯品，有效地解决了目前紫杉醇分离提纯难的问题。
[0016]步骤I)所述有机溶剂为丙酮，丙酮对紫杉醇的溶解度相对较大，且有利于后道工序的处理。
[0017]步骤I)所述溶液A的溶质质量kg与溶剂的体积L比为1:6?10，如1:6.5、1:7.0、1:7.5、1:8.0、1:8.5、1:9.0 或 1:9.5，优选为 1:7 ?9，进一步优选为 1:7 ?8。
[0018]步骤I)所述高锰酸钾与所述紫杉醇粗品中的三尖杉宁碱的重量比为1:2?7，如1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5 或 1:6，优选为 1:3 ?6，进一步优选 1:3 ?5，所述重量比为根据生产过程确定的最佳重量比。
[0019]步骤I)所述溶液B中有机溶剂的体积L与紫杉醇粗品的质量kg比为2?5:1，如2.5:1、3.0:1、3.5:1、4.0:1 或 4.5:1，优选为 2 ?4:1，进一步优选 2 ?3:1。
[0020]步骤I)所述紫杉醇粗品紫杉醇含量为45?
49wt %、50wt %、51wt %、52wt %、53wt % 或 54wt % ;三尖杉宁碱含量是任意的，如 5wt%、10wt%、20wt%、30wt%、40wt% 或 50wt%。
[0021]步骤2)所述反应时间为 3 ?8h,如 3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h 或 7.5，
优选为3?6h,进一步优选为4?5h。
[0022]步骤2)所述反应的温度为常温。
[0023]步骤3)所述结晶使用的溶剂为纯化水，经过步骤2)的反应之后的滤液为紫杉醇、高锰酸钾和三尖杉宁碱等杂质的混合液，紫杉醇不溶于水，高锰酸钾为水溶性试剂，因此，采用纯化水作为结晶溶剂可除去过量的高锰酸钾。所述纯化水与所述滤液的体积比为1:0.5 ?1.8，如 1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1: 1.2、1: 1.3、1: 1.5、1: 1.6 或 1:1.7，优选为1:0.5?1.5，进一步优选为1:0.5?1.2，采用如上所述的纯化水与滤液的体积比能够使得紫杉醇晶体析出的效果最佳。
[0024]步骤3)所述晶体干燥温度为 50 ?60°C，如 52°C、54°C、55°C、57°C、58°C、或 59°C。
[0025]步骤4)所述柱层析流动相为乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液，所述乙酸乙酯和二氯甲烷的体积比为 2:8 ?3:7，如 2.1:7.9,2.2:7.8,2.3:7.7,2.4:7.6,2.5:7.5,2.6:7.4、2.7:7.3、2.8:7.2或2.9:7.1。本发明所述柱层析操作条件为:用二氯甲烷将待测物制成湿样，在50 X 500玻璃柱内加入硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为30%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段。由于紫杉醇与杂质在乙酸乙酯和二氯甲烷中的溶解度不同，采用乙酸乙酯和二氯甲烷作为流动相，能够有效地分离紫杉醇与其他杂质。
[0026]步骤5)所述二次结晶的溶剂为丙酮和纯化水，所述丙酮用于将步骤4)所述干燥物溶解，所述纯化水用于紫杉醇的结晶，所述丙酮和纯化水的体积比为1:0.7?1.4，如1:0.8、1:0.9、1: 1.0、1: 1.1、1: 1.2 或 1:1.3，优选为 1:0.8 ?1.2，进一步优选为 1:0.9 ?1.1。
[0027]步骤5)所述晶体干燥温度为 50 ?60°C，如 52°C、54°C、55°C、57°C、58°C、或 59°C。
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0029]I)本发明的方法三尖杉宁碱去除效果好，制得的紫杉醇纯度和回收率高，且对紫杉醇本身无影响；
[0030]2)本发明的方法操作灵活简便，反应及处理条件温和，降低了精制步骤的难度，适宜于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明所述的紫杉醇㈧与三尖杉宁碱⑶结构式；
[0032]图2为本发明的生产工艺流程图；
[0033]图3为本发明实施例2所用的紫杉醇粗品高效分离制备的液相色谱图；
[0034]图4为本发明实施例2 —次结晶之后得到的紫杉醇粗品高效分离制备的液相色谱图；
[0035]图5为本发明实施例3得到的紫杉醇含量为99.8wt%的紫杉醇纯品高效分离制备的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0037]如图1所示为本发明所述的紫杉醇与三尖杉宁碱结构式，从图中可以看出三尖杉宁碱和紫杉醇在结构上极其相似，由于结构决定性质，紫杉醇和三尖杉宁碱在性质上也很相似，从而造成紫杉醇与三尖杉宁碱的分离十分困难。紫杉醇属于不稳定物质，其受温度、有机溶剂、酸、碱等环境条件的影响，容易发生降解或异构而生成其他紫杉烷类物质，增加了分离提纯紫杉醇的难度。
[0038]如图2所示为本发明制备紫杉醇纯品的生产工艺流程图，将含三尖杉宁碱的紫杉醇粗品的有机溶液加入高锰酸钾的有机溶液，经反应后将反应液过滤、一次结晶并干燥后得到三尖杉宁碱含量低于1%以下的紫杉醇粗品，再经柱层析和二次结晶后得到98.5wt%以上的紫杉醇纯品。
[0039]实施例1
[0040](I)取紫杉醇粗品50g(紫杉醇含量47.6wt%，三尖杉宁碱含量10.lwt% )用300ml丙酮溶解后加入高锰酸钾溶液(2.5g加入10ml丙酮溶解)进行反应。反应3h后进行过滤，得滤液约450ml，加入纯化水250ml结晶，晶体干燥得31.3g，HPLC检测，紫杉醇含量74.2 %，三尖杉宁碱含量0.44%，紫杉醇收率为97.6%。
[0041](2)将上步产物用二氯甲烷溶解后得湿样，在50X500玻璃柱内加入360g硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为30%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段，共1.5L，浓缩干燥后得干燥物23.3g，加入200ml丙酮溶解后，再加入140ml纯化水进行析晶，晶体干燥后得干燥物19.4g，HPLC检测紫杉醇含量为99.1 %，主收率为82.8 %，一次总收率为80.8 %。
[0042]实施例2
[0043](I)取紫杉醇粗品300g (紫杉醇含量52.8wt%，三尖杉宁碱含量16.1wt %，其高效分离制备的液相色谱图如图3所示，48.6处的峰是紫杉醇的特征峰，42.4处的峰是三尖杉宁碱的特征峰)用3000ml丙酮溶解后加入高锰酸钾溶液(7g加入900ml丙酮溶解)进行反应。反应8h后进行过滤，得滤液约4000ml，加入纯化水7000ml结晶，晶体干燥得203.2g，HPLC检测，检测结果如图4所示，48.1处的峰是紫杉醇的特征峰，42.1处的峰是三尖杉宁碱的特征峰，分析后得到紫杉醇含量为76.7 %，三尖杉宁碱含量为0.58%，紫杉醇收率为98.4%。
[0044](2)将上步产物用二氯甲烷溶解后得湿样，在300X600玻璃柱内加入18kg硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段，共245L，浓缩干燥后得干燥物141.2g，加入1400ml丙酮溶解后，再加入1960ml纯化水进行析晶，晶体干燥后得干燥物132.5g，HPLC检测，得到紫杉醇含量为99.2%，主收率为84.3%，一次总收率为83.0%。
[0045]实施例3
[0046](I)取紫杉醇粗品100g(紫杉醇含量50.1wt%，三尖杉宁碱含量19.8wt% )用8L丙酮溶解后加入高锰酸钾溶液^Og加入2L丙酮溶解)进行反应。反应5h后进行过滤，得滤液约10.5L，加入纯化水1L结晶，晶体干燥得690.3g，HPLC检测，紫杉醇含量71.2%,三尖杉宁碱含量0.67%，紫杉醇收率为98.1 %。
[0047](2)将上步产物用二氯甲烷溶解后得湿样，在400X1000不锈钢柱内加入45kg硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段，共660L，浓缩干燥后得干燥物431.5g，加入4.5L丙酮溶解后，再加入4.5L纯化水进行析晶，晶体干燥后得干燥物411.1g,HPLC检测，检测结果如图5所示，47.6处的峰是紫杉醇的特征峰，没有检测到三尖杉宁碱的特征峰，分析后得到紫杉醇含量为99.8%，主收率为83.5%，一次总收率为81.9%。
[0048]实施例4
[0049](I)取紫杉醇粗品2000g(紫杉醇含量55wt%，三尖杉宁碱含量15.8wt% )用14L丙酮溶解后加入高锰酸钾溶液￠3.2g加入8L丙酮溶解)进行反应。反应6h后进行过滤，得滤液约22.5L，加入纯化水12.5L结晶，晶体干燥得1406g，HPLC检测，紫杉醇含量76.8%,三尖杉宁碱含量0.66%，紫杉醇收率为98.2 %。
[0050](2)将上步产物用二氯甲烷溶解后得湿样，在400X1000不锈钢柱内加入45kg硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段，共1450L，浓缩干燥后得干燥物1000.9g，加入9.5L丙酮溶解后，再加入8.55L纯化水进行析晶，晶体干燥后得干燥物923g，HPLC检测，分析后得到紫杉醇含量为98.9%，主收率为84.5%，一次总收率为83.0%。
[0051]实施例5
[0052](I)取紫杉醇粗品600g(紫杉醇含量45wt%，三尖杉宁碱含量21.2wt% )用5.4L丙酮溶解后加入高锰酸钾溶液(21.2g加入3L丙酮溶解)进行反应。反应4h后进行过滤，得滤液约8.5L，加入纯化水17L结晶，晶体干燥得357g，HPLC检测，紫杉醇含量74.6%，三尖杉宁碱含量0.54%，紫杉醇收率为98.6 %。
[0053](2)将上步产物用二氯甲烷溶解后得湿样，在400X1000不锈钢柱内加入45kg硅胶装柱，用二氯甲烷润柱，再将湿样加入柱头，用乙酸乙酯的体积百分比为25%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶剂作为流动相进行洗脱，收集主分段，共500L，浓缩干燥后得干燥物244.2g，加入2.7L丙酮溶解后，再加入3.0L纯化水进行析晶，晶体干燥后得干燥物225.1g,HPLC检测，分析后得到紫杉醇含量为99.5%，主收率为84.1%，一次总收率为83.0%。
[0054] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【权利要求】
1.一种除去紫杉醇中三尖杉宁碱的方法，其特征在于，包括如下步骤: . 1)准备原料:将含三尖杉宁碱的紫杉醇粗品溶解于有机溶剂中制成溶液A;将高锰酸钾溶解于有机溶剂中制成溶液B ； .2)反应:在溶液A中加入溶液B进行反应,并将反应后的溶液过滤； . 3)—次结晶:将步骤2)所得滤液结晶，过滤和干燥处理后得到三尖杉宁碱含量在1%以下的紫杉醇粗品； . 4)柱层析:将步骤3)所得粗品进行柱层析，收集含紫杉醇的有效段，浓缩干燥； .5)二次结晶:将步骤4)得到的干燥物进行结晶处理，过滤和干燥后得紫杉醇含量在.98.5wt%以上的紫杉醇纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)所述有机溶剂为丙酮。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤I)所述溶液A的溶质质量kg与溶剂的体积L比为1:6?10，优选为1:7?9，进一步优选为1:7?8。
4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤I)所述高锰酸钾与所述紫杉醇粗品中的三尖杉宁碱的重量比为1:2?7，优选为1:3?6，进一步优选1:3?5。
5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤I)所述溶液B中有机溶剂的体积L与紫杉醇粗品的质量kg比为2?5:1，优选为2?4:1，进一步优选为2?3:1。
6.根据权利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步骤I)所述紫杉醇粗品中紫杉醇含量为45?55wt%。
7.根据权利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步骤2)所述反应时间为3?8h，优选为3?6h,进一步优选为4?5h ; 优选地，步骤2)所述反应的温度为常温。
8.根据权利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步骤3)所述结晶使用的溶剂为纯化水，所述纯化水与所述滤液的体积比为1:0.5?1.8，优选为1:0.5?1.5，进一步优选为.1:0.5 ?1.2 ; 优选地，步骤3)所述晶体干燥温度为50?60°C。
9.根据权利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，步骤4)所述柱层析流动相为乙酸乙酯与二氯甲烷的混合液，所述乙酸乙酯与二氯甲烷体积比为2:8?3:7。
10.根据权利要求1-9之一所述的方法，其特征在于，步骤5)所述结晶的溶剂为丙酮和纯化水，所述丙酮用于将步骤4)所述干燥物溶解，所述纯化水用于紫杉醇的结晶，所述丙酮与所述纯化水的体积比为1:0.7?1.4，优选为1:0.8?1.2，进一步优选为1:0.9?.1.1 ; 优选地，步骤5)所述晶体干燥温度为50?60°C。
【文档编号】C07D305/14GK104262300SQ201410522893
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】胡立, 丁正飞, 任莉, 喻琼林 申请人:江苏红豆杉药业有限公司