专利名称：新活性肽及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的活性肽及其制备以及适于制备这种肽的原材料。
PCT申请WO93/23424公开了具有理想的抗癌活性的肽基活性物质。该申请的例234中的五肽被证实具有特别好的效果，这种肽具有如下化学式
Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzlMe2Val是N，N-二甲基-L-缬氨酸，MeVal是N-甲基-L-缬氨酸，而Bzl是苄基。
根据上述PCT申请，这种肽可通过固相法由脯氨酸制备而成。这样只能以较少的产率得到不纯的活性物质。繁琐的层析提纯是必不可少的。而且，该固相方法仅适于制备少量的物质。至今尚未证实以结晶形式制备WO93/23424的例234的物质的可能性。所述活性物质为树脂形式。这使得要彻底除去残余溶剂变得很困难。还必须昂贵的提纯步骤(喷雾干燥、冷冻干燥)。对这种物质进行药物加工是有困难的。需要较大量的这种物质以便进行试验和开发。为了在可能的情况下以结晶形式制备这种活性物质，需要一种能够进行工业化生产的方法。
我们业已发现一种以高纯度生产未外消旋化的上述活性物质的方法，因此可以毫无困难地将这种物质转化成结晶盐即其氢氯化物。
本发明涉及一种制备Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl的方法，它包括，在式II的一种化合物中
Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1II其中R1是C1-5烷基，而Z是可以在苯环上被取代的苄氧基羰基保护基，Aa)消除N末端上的保护基Z，而在所得化合物中1)将N末端上的游离氨基二甲基化，2)水解C末端上的烷氧基-OR1，以及b)将所得到的下式化合物Me2Val-Val-MeVal-Pro-OHV与脯氨酸苄酰胺XII偶联或Ba)除去C末端上的烷氧基-OR1，和b)将所得到的下式化合物Z-Val-Val-MeVal-Pro-OHIX与脯氨酸苄酰胺XII偶联，在所得到的下式化合物中Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzlXI1)除去N-末端上的保护基Z，以及2)将N末端上的游离氨基二甲基化，并将所得到的化合物转化成其氢氯化物。
方法A按以下反应简图进行Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1II｜｜↓Val-Val-MeVal-Pro-OR1III｜｜↓Me2Val-Val-MeVal-Pro-OR1IV｜｜↓
上述简图中的以及在本说明书其它地方出现的取代基的含义如下R1C1-5烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基，最好是甲基和乙基，R2叔丁基、2-乙基己基，C1-4烷氧基如甲氧基、乙氧基、异丁氧基，Z苄氧基羰基，其苯环未被取代过，或是被卤素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4酸基或硝基取代过，特别是被2-Cl、3-Cl、4-Cl、4-Br、4-CH3O-、4-CH3COO-、2-NO2和4-NO2取代过。
MK、Na、Li或一个铵离子如NH(C2H5)3Bzl苄基Me甲基。
将四肽酯II溶于适当溶剂，如醇，像甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇；醚，像THF、二噁烷、MTBE；酯，像乙酸乙酯；或冰醋酸中。在加入适当的催化剂，如Pd/C或Pt/C以后，在0～50℃，最好在10～30℃通入氢气。氢气的导入可在大气压力或高达10巴的压力下进行。通过让一定量的气体逸出可以提高反应速度。当氢气摄取结束后，加入2-5当量甲醛，其为水溶液、气态或聚甲醛的形式。接着，又在上述条件下通入氢气。然后把催化剂过滤除去。通过结晶可以氢氯酸盐形式将IV从适当溶剂或溶剂的混合物中提纯出来，已证实异丙醇/甲基叔丁基醚是适用的。通过提取方法可除去IV中的微量Z-四肽酯II。
将酯IV水解于合适的溶剂中，例如醇，像甲醇、乙醇、异丙醇；醚，像MTBE、THF、二噁烷；烃，像甲苯、二甲苯；或氯化烃，像1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿，添加和不添加水，添加合适的碱，像NaOH、KOH、LiOH。酯的裂解也可以由酸来完成。当R1＝叔丁基时，CF3CO2H和溶于二噁烷中的HCl溶液是特别适宜的。
随后，所得到的四肽酸V必须与脯氨酸苄酰胺XII偶联，以生成五肽I。在该偶联反应中，易于发生外消旋作用。因此，G.Pettit等(J.Am.Chem.Soc.113，6692-3(1991))将DEPC〔(OEt)2POCN〕用作偶联剂与四肽酸V进行类似的偶联。不可能大量购进DEPC，因此该方法需要使用有毒的磷和氰化物试剂的额外处理步骤。
含氰化物的废物会导致处理上的困难。因此，该方法不适于工业化实施。一种能够直接以工业规模实施的肽偶联方法是混合酐方法(例如，参见J.Meienhofer in the Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Vol.1，Academic Press，Orlando，1979，第264-314页)。这使得能够用合适的碱，如叔胺，像三乙胺、N-甲基吗啉、二环己基乙胺、二异丙基乙胺对酸V进行脱质子化，生成VI。也可以用诸如NaOH、KOH、LiOH之类的碱将式IV的酯直接转化成盐VI。化合物VI与酰基氯ClCOR2反应，生成VII的混合酐。除了新戊酰氯之外，还可以使用其它的酰基氯，例如2-乙基己酰基氯、氯甲酸乙酯，氯甲酸甲酯和氯甲酸异丁酯。这种混合酐极易发生外消旋作用(例如，见J.Meienhofer in the Peptides，Vol.1，Academic Press，Orlando，1979，第276页以及下列等等)。
令人惊奇的是，可通过混酐法使三肽酸V反应，完全没有外消旋作用。用由V和新戊酰氯制备的混酐取得了特别好的结果。与最近发表的结果(N.L.Benoiton等，Can.J.Chem.65，619-625(1987))相反，就选择性和产率而言，与新戊酰氯反应的结果优于与氯甲酯的反应结果。混酐VII的制备以及随后的脯氨酸苄酰胺的偶联是在-20至+5℃温度下在合适的溶剂，如二噁烷、NMP、THF、甲苯、二氯甲烷、二甲基甲酰胺中进行的。还可以用脯氨酸苄酰胺XII的合适的盐，例如硫酸氢盐、甲磺酸盐、氢氯酸盐或氢溴酸盐来代替该化合物。在这种情况下，必须加入另一种相当的碱，如三乙胺。在肽偶联和常规的提取处理之后，将粗产品溶于适当溶剂中，例如，诸如甲苯、二甲苯之类的烃，或诸如二乙醚、THF、二噁烷，甲基叔丁基醚之类的醚，诸如丙酮、甲基乙基酮、二乙基酮、环己酮之类的酮，或诸如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷的氯化溶剂。通过导入气态HCl或计量入溶于合适的溶剂，如THF、甲醇、异丙醇、正戊醇、二异丙基醚中的HCl溶液使氢氯化物I沉淀。业已证实的一种特别适用的方法是这样的，在该方法中，五肽的游离碱首先被溶于甲基乙基酮中，随后加入溶于异丙醇中的HCl溶液。
方法B按以下简图进行Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1II｜｜↓Z-Val-Val-MeVal-Pro-OHIX｜｜↓Z-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2+XII X｜｜↓Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl XI｜｜↓Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzlxHCl I酯II的水解、混合酐X的制备以及肽偶联生成XI，是按这样的顺序进行的IV→V→VI→VII→I。Z保护基的去除和二甲基化生成I，是按以下转换方式进行的II→III→IV。
令人惊奇的是，在变型方法B中，混合酐法也不会发生外消旋作用。与Benoiton发表的结果相反，用由酸IX和新戊酰氯制备的混合酐取得了最好的产率。
制备肽I所需的原材料II可以由Z-Val-O-CO-R2(XIII)和Val-MeVal-Pro-OR1(XIV)制备。
这种新方法可以结晶形式提供活性物质I。可以通过再结晶以简便方法对这种肽做进一步提纯。不需要复杂的层析提纯步骤。
本发明还涉及用于制备I的下列前体Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1IIVal-Val-MeVal-Pro-OR1IIIMe2Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2VIIZ-Val-Val-MeVal-Pro-OH IXZ-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2XZ-Val-Val-MeVal-Pro-pro-NHBzl XI其中R1和Z具有在权利要求3中所述的含义，而R2是叔丁基、2-乙基己基、C1-4烷氧基、甲氧基、乙氧基和异丁氧基。
化合物I具有治疗固态肿瘤(肺瘤、乳腺瘤、肠瘤、膀胱瘤、直肠瘤、子宫瘤、前列腺瘤)、白血病、淋巴瘤和其它癌症的作用。
下面的实施例将说明本发明。实施例1(方法A)A.原料的制备a.Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe(II，R1＝Me)将溶于320l甲醇中的39.6kg(83.3mol)Z-Val-MeVal-Pro-OMe(VIII)与4kg的5％钯/碳一起加入氢化器皿中。然后，当在20～30℃冷却时通入氢气，直到在反应溶液中再也检测不到前体。当器皿里的容纳物被倒出后将催化剂过滤掉。在400l的搪瓷容器中在水泵抽真空的条件下将滤液浓缩至50l。随后加入50l甲苯，并用40l的2N HCl提取该混合物。甲苯相再用40l 1N HCl提取一次，然后排出。将收集的酸性水相送回上述容器中，在加入40l二氯甲烷之后，加入50％浓度的NaOH溶液调到pH9，同时剧烈搅拌并冷却。在相分离以后倒掉二氯甲烷相，再用二氯甲烷提取水相两次，每次用40l二氯甲烷。用水将所收集的产物的二氯甲烷溶液洗至中性。随后将二氯甲烷溶液浓缩至90l，以得到Val-MeVal-Pro-OMe(XIV，R1＝CH3)。产率24.2kg＝85.2％在一个400l的容器中将17.84kg(70.88mol)Z-缬氨酸和4.59kg(74.42mol)三乙胺溶于170l二氯甲烷中。在-5至-10℃温度下将8.58Kg(70.88mol)新戊酰氯计量入该溶液中。在-5℃温度下经过2小时的反应时间后，在-5℃下加入溶于86l二氯甲烷中的24.2kg Val-MeVal-Pro-OMe的溶液。在-5℃下再过2小时后，将混合物加热至20℃，并在该温度下搅拌12小时。为进行处理，加入50l水，并在除去水相之后用40l 2N HCl提取一次有机相，每次各用40l 2N NaOH溶液提取两次。在用水将有机相洗至中性以后，通过蒸馏除去二氯甲烷溶剂并代之以二异丙基醚。通过将油状产物乳状液加热至60℃，加入晶种并在60℃保持7小时而使该产物结晶。通过相继在50℃搅拌5小时、在40℃搅拌5小时然后冷却至20℃来完成结晶过程。通过一个120l的压滤器过滤除去晶体，并在氮气流中干燥。产率32.2kg＝79％熔点134-135℃b.脯氨酸苄酰胺氢氯化物(XII×HCl)在-10至-15℃温度下将48.2g新戊酰氯滴加到溶于1l CH2Cl2中的99.7g Z-脯氨酸和58ml三乙胺的溶液中。在-10℃下将混合物搅拌45分钟，然后，在0.5小时内，在-10℃下加入溶于500ml CH2Cl2中的42.8g苄胺。然后在室温下将混合物搅拌1小时。随后用500ml水将CH2Cl2溶液洗涤2次，用500ml 10％浓度NaHCO3水溶液洗涤2次，用500ml水洗涤两次，用500ml 5％浓度的柠檬酸水溶液洗涤2次，并用500ml水洗涤2次，在Na2SO4上干燥并蒸发。将120g残余物溶于200ml乙酸乙酯中。将1.2l正庚烷加入该溶液中，搅拌混合物1小时，通过空吸将产物滤出，并在减压条件下在50℃干燥。产率110g，81.3％熔点93～94％将以这种方式获得的110g Z-脯氨酸苄酰胺溶于1.5l甲醇中。在加入0.5g Pd/C(10％)以后，通入氢气。在室温下该溶液在1.5小时内吸收0.5l H2。通过过滤和蒸发除去催化剂以后，剩下4.6g黄色油状物。
将以这种方法获得的413g脯氨酸苄酰胺溶于400ml异丙醇中。加入630ml的异丙醇饱和溶液，在0～5℃搅拌所得到的悬浮液2小时，通过空吸滤掉固体，并用250ml异丙醇洗涤2次。在减压条件下于50℃干燥残余物，获得401g脯氨酸苄酰胺氢氯化物；αD20-45°B.最终产物的制备a.1Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe×HCl(IV×HCl，R1＝Me)将20kg(34.8mol)Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe(II，R1＝Me)和2kg 5％Pd/C一起加入400l氢化器皿中的200l甲醇中。随后在冷却的同时，在20℃下通入氢气，直至在反应溶液中再也检测不到前体。然后加入8.46kg37％浓度(104mol)的甲醛水溶液，在20℃继续氢化作用，直到氢的吸入终止。在倒出上述反应器皿中所盛之物时将催化剂滤掉。通过水泵抽真空在一个400ml的搪瓷容器中把滤液浓缩至50l。然后加入200l异丙醇，并将该混合物再次浓缩至50l。然后将残余物溶于135l甲基叔丁基醚中，在20℃进行冷却的同时加入1个当量HCl在异丙醇中的溶液。将所得悬浮液在20℃再搅拌3-4小时，在0-5℃搅拌2小时，然后通过一个120l的压滤器过滤。滤饼用50l新的甲基叔丁基醚洗涤一次。产率16.2kg＝92.3％熔点224℃(分解)a.2在第一个氢化阶段之后按以下方式进行处理时，还可以分离出中间产物Val-Val-MeVal-Pro-OMe(III，R1＝CH3)将反应溶液同催化剂分离并进行浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中。用2N HCl提取该乙酸乙酯溶液2次。用NaOH溶液把酸性水相调至pH9，并用二氯甲烷提取2次。然后将二氯甲烷相洗涤至中性并蒸发。
HPLC96.8％1H-NMR(400MHz，CDCl3/TMSint.)
δ(ppm)0.84-1.08(m，18H)；1.45-1.6(S，broad，NH2)；1.85-2.15(m，4H)；2.18-2.38(m，3H)；3.15(s，N-CH3)；3.25(d，1H)；3.65-3.75(m，1H)；3.73(s，O-CH3)；3.9-4.05(m，1H)；4.38-4.45(m，1H)；4.73-4.83(m，1H)；5.12(d，1H)；7.9(d，NH)a.3也可以用以下方法制备Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe×HCl(IV×HCl，R1＝Me)，该方法无需分离和提纯中间产物Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe(II，R1＝Me)在一个4l的烧瓶中将128g(0.51mol)Z-缬氨酸和55.1g(0.54mol)三乙胺溶于1.2l二氯甲烷中。在-5℃至-10℃将62.1g(0.51mol)新戊酰氯加入该溶液中。在-5℃经过2小时的反应时间之后，加入由174.6g(0.51mol)Val-MeVal-Pro-OMe在0.8l二氯甲烷中配成的溶液，在-5℃将该混合物再搅拌2小时，加温至20℃后再搅拌12小时。然后将370ml的水加入该混合物中。在相分离之后，用290ml的2N HCl洗涤二氯甲烷相一次，每次各用290ml 2N NaOH溶液洗涤2次，用370ml的水洗涤3次。随后将二氯甲烷溶剂蒸馏掉，并代之以3l甲醇。向该溶液中加入于110ml水中的30g 5％的Pd/C悬浮液，氢化反应是在25℃下用一个气体导入搅拌器和氢气量管进行的，直到吸入了1当量的氢气。然后加入123g(1.53mol)37％浓度的甲醛水溶液，继续氢化作用，直到又吸入2当量的氢气。然后除掉催化剂并在一个旋转蒸发器中蒸发。将残余的油状物溶于670ml异丙醇和2.6l甲基叔丁基醚中。将1当量的异丙醇HCl加入该溶液中。将所得悬浮液在20℃再搅拌12小时，然后抽吸过滤。用少量甲基叔丁基醚洗涤滤饼，随后在40℃温度下在真空箱中干燥。产率182.8g＝71％熔点224℃(分解)b.Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl×HCl(I)将15.9kg(31.5mol)Me2Val-Val-MeVal-Pro-OMe×HCl(IV×HCl，R1＝CH3)和140l甲苯及15l甲醇一起加入400l的容器中。再向其中加入3.15kg(76.38mol)的NaOH颗粒。水解结束之后，即在20℃经过3小时之后，通过加入异丙醇HCl来中和该混合物。随后在100mbar的条件下与甲苯一起共沸蒸馏，直到没有醇和水。接着用甲苯替代被蒸馏掉的溶剂。然后加入80l二氯甲烷和6.44kg(63.0mol)三乙胺(99％的纯度)，将混合物冷却至-5℃，在这一温度下计量入3.84kg(31.5mol)的新戊酰氯。在反应2小时以后，在-5℃至0℃温度下分批加入7.6kg(31.5mol)Pro-NHBzl×HCl。混合物在-5℃放置2小时之后被加温至20℃，再让其反应6小时。然后在500mbar的压力下通过蒸馏除去二氯甲烷，并加入80l甲苯。然后加入50l水并将水相调至pH9。经过剧烈搅拌之后分离除去水相，用25l水洗涤有机相一次。接着每次各用50l 2N HCl提取有机相2次。在把酸性水相调至pH9之后对其中的产物进行反萃取每次各用50l二氯甲烷提取3次。在用水把二氯甲烷相洗至中性以后，蒸馏除去二氯甲烷，并代之以180l甲基乙基酮。将该溶液加温至40℃，并加入1当量(31.5mol)的异丙醇HCl。将所得悬浮液加温至60℃，随后在不用再加热的情况下搅拌12小时。然后冷却至20℃，再搅拌5小时。接着冷却至5℃并通过一个120l的压滤器过滤。在5℃下用60l新配制的甲基乙基酮洗涤滤饼。在滤器上经初步干燥后，在真空箱中在40℃下将产物干燥至恒重。产率14.36kg＝67％熔点214℃(分解)实施例2(方法B)a.Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH(IX)在一个2l的烧瓶中将117g(0.2mol)Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe(II，R1＝Me，实施例1Aa)溶于900ml甲醇和47.5ml水中。随后加入18g(0.45mol)NaOH颗粒，并在20℃将该混合物搅拌12小时。为进行处理，加入250ml水并将甲醇蒸馏掉。然后加入足够的乙酸乙酯，以产生清楚的相分离(约500ml)。分离出乙酸乙酯相。用盐酸将水相酸化至pH1，并用500ml二氯甲烷提取两次。然后将有机相蒸干。产率105g＝96.4％
1H-NMR(200MHz，CDCl3/TMSint.)δ(ppm)0.6-1.2(m，18H)；1.7-2.45(m，7H)；3.2(s，N-CH3)；3.55-3.95(m，2H)；4.05-4.2(m，1H)；4.35-4.5(m，1H)；4.68-4.85(m，1H)；4.98-5.2(m，3H)；5.93(d，Val-1NH)；7.2-7.4(m，5H)；7.53-7.68(Val-2NH)；9.6-10.2(s，broad，COOH)b.Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl(XI)将5g Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH(8.75mmol)(IX)溶于50ml CH2Cl2中，将1.79g(17.5mmol)三乙胺滴加进去，将该混合物冷却至10℃，并在该温度下将1.08g(8.75mmol)新戊酰氯滴加进去。在10℃下搅拌2小时之后，在该温度下将由2.11g(8.75mmol)Pro-NHBzl×HCl溶于10ml甲醇中制成的溶液滴加进去，在10℃下搅拌该混合物2小时并在室温下过夜。
每次用50ml水将反应混合物洗涤3次，用50ml pH9的水洗涤1次，每次再各用50ml水洗涤2次。在旋转蒸发器中蒸发二氯甲烷溶液，留下5.3g(81.4％)白色结晶产物(纯度88.7％)。熔点118-122℃c.Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl×HCl(I)将12g Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl(XI)溶于200ml甲醇中。再向其中加入2g 5％Pd/C(悬浮于20ml水中)并在20℃下进行氢化作用，直到停止吸入氢气。随后加入6.5g 37％浓度的甲醛水溶液，继续氢化作用直至停止吸入氢气。分离除去催化剂并蒸发反应溶液。将残余物溶于甲苯中并再次浓缩，再加入200ml甲苯，过滤该混合物。然后用50ml2N HCl提取甲苯溶液2次。用NaOH溶液将酸性水相调至pH9，并用50ml二氯甲烷提取3次。用水将二氯甲烷相洗至中性并浓缩。将粗制碱溶于150ml甲基乙基酮和7.5ml异丙醇中。通过在40℃加入4g 25％浓度异丙醇HCl将该产物的盐从上述溶液中沉淀出来。将悬浮液在20℃搅拌3小时，在0-5℃搅拌1小时，然后抽吸过滤。产率7.1g纯度99.1％(HPLC百分面积)熔点214℃(分解)
权利要求
1.Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl (I)。
2.结晶形式的Me2VAl-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl (I)。
3.一种用于制备Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl·HCl的方法，该方法包括在式II的化合物中Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1II其中R1是C1-5烷基和Z是苄氧基羰基保护基，其苯环上可以被取代，Aa)去掉N末端上的保护基Z，在所获得的化合物中1)将N末端的游离氨基二甲基化，2)水解C末端的烷氧基-OR1，以及b)将所得到的下式化合物Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH V与脯氨酸苄酰胺偶联，或Ba)除去C末端的烷氧基-OR1，和b)将所得到的下式化合物Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH IX与脯氨酸苄酰胺偶联，在所得到的下式化合物中Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl XI1)除去N末端的保护基Z，以及2)将N末端的游离氨基二甲基化，并把所得到的化合物转化成它的氢氯化物。
4.如权利要求3所述的方法，其中为了与脯氨酸苄酰胺偶联，首先用新戊酸将式V和IX的四肽羧酸转化成混合酐。
5.一种用于制备权利要求1所述化合物I的下式前体Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1IIVal-Val-MeVal-Pro-OR1IIIMe2Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2VIIZ-Val-Val-MeVal-Pro-OH IXZ-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2XZ-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzlXI其中R1和Z具有权利要求3中所述的含义，而R2是叔丁基、2-乙基己基、C1-4-烷氧基、甲氧基、乙氧基或异丁氧基。
全文摘要
公开了化合物Me
文档编号C07K7/06GK1162318SQ95193411
公开日1997年10月15日 申请日期1995年4月26日 优先权日1994年5月6日
发明者W·阿姆伯格, H·伯纳德, E·布施曼, A·哈普特, L·扎尼施克, B·詹森, U·卡尔, A·克林格, S·穆勒, B·德勃佐利, K·里特, M·希烨斯, T·兹尔克 申请人:巴斯福股份公司