构象受限的主链环化的促生长素抑制素类似物的制作方法

专利名称：构象受限的主链环化的促生长素抑制素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过新的键环化的构象受限的Nα主链环化的促生长素抑制素类似物，涉及这些主链环化的肽类似物的制备方法，涉及应用这些肽类似物的方法，以及涉及含有该肽类似物的药物组合物。
背景技术：
促生长素抑制素类似物促生长素抑制素是在中枢神经系统和外周组织中发现的环十四肽。其最早是从哺乳动物下丘脑分离的，并且鉴定为生长激素从垂体前叶分泌的重要的抑制剂。其多生物活性包括对从胰腺分泌胰高血糖素和胰岛素的抑制作用，对大多数内脏激素的调节作用，以及对贯穿中枢神经系统的运动活性和认识过程所涉及的其它神经递质的释放的调节作用(参见综述Lamberts，内分泌研究(Endocrine Rev.,)9:427,1988)。另外，促生长素抑制素及其类似物是治疗各类型肿瘤的潜在的有用的抗增殖剂。
天然的促生长素抑制素(也称为促生长素释放抑制因子，SRIF)具有下面的结构式H-Ala1-Gly2-Cys3-Lys4-Asn5-Phe6-Phe7-Trp8-Lys9-Thr10-Phe11-Thr12-Ser13-Cys14-OH其最早由Guillemin及其同事分离到(Bruzeau等，科学，179:78.1973)。其通过与受体家族的相互作用而显示其作用。最近已经鉴定和克隆了五种受体亚类，称之为SSTR1-5。促生长素抑制素以其天然的形式作为治疗剂具有有限的用途，因为其具有两种所不期望的性质不好的生物利用率和短的作用持续时间。为此原因，在过去的二十年间已经进行了很大努力来发现有关对生长激素，胰岛素或胰高糖素抑制作用的药效，生物稳定性，作用持续时间或选择性具有优越性的促生长素抑制素类似物。
结构-活性相关研究，光谱技术，例如圆二色性和核磁共振，以及分子模型研究出以下结论天然促生长素抑制素的环部分的构象很有可能是反向平行的β-片层；Phe6和Phe11通过两个芳香环之间的疏水性相互作用而在稳定药效团构象中起重要作用；反向平行的β-片层中β-转角周围的4个氨基酸Phe7-Trp9-Lys9-Thr11对于药效团是基本的；对于促生长素抑制素受体亚型2至5的相互作用(D)，Trp8优于(L)Trp8。
然而，含有通过二硫桥连接的该4个氨基酸的六肽促生长素抑制素类似物在体外和体内几乎是灭活的
尽管其具有置换天然促生长素抑制素中Phe6-Phe11疏水性相互作用的共价二硫桥的优点。
为了提高该六肽促生长素抑制素类似物的活性进行了4方面主要研究。(1)通过促进顺式-酰胺键的环化作用，或者通过对分子进行第二环化作用得到二环类似物，来置换二硫化物桥。两种情况下，得到的类似物具有减小数值的自由度构象度。(2)用其它天然或非天然氨基酸置换Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10序列中原残基，例如用Thr7置换Phe7和用Val10置换Thr10。(3)插入另外的来自天然促生长素抑制素的官能基团，注意这些新的元素要对与受体的相互作用起作用。(4)删除4个氨基酸Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10中的一个，假设该类似物会更有选择性。
促生长素抑制素类似物，MK-678环(N-Me-Ala6-Tyr7-(D)Trp8-Lys9-Val10-Phe)是用上述头三项研究设计的强有力的促生长素抑制素类似物的例子(Veber等，生活科学(Life Science,)34:371,1984)。在该六肽类似物中，顺式-酰胺键位于N-Me-Ala和Phe11之间，Tyr7和Val10分别置换Phe7和Tyr10，并且从天然促生长素抑制素结合Phe11。
另一组促生长素抑制素类似物(美国专利4310518和4235886)包括Octreotide
其是迄今可购得的唯一许可的促生长素抑制素类似物。其是用上述第三项研究开发出来的。在这里，假设(D)Phe5和还原的C-末端Tyr12-CH2OH分别占据天然Phe6和Tyr12的构象空间的一部分。化合物TT-232
与Octreotide密切相关，并且是完成上述第四项研究的例子。缺失Tyr10可能是其关于抗肿瘤活性中高功能选择性的原因。
这些高效力促生长素抑制素类似物的例子提示在位置6和11的苯丙氨酸不只是在稳定药效团构象中起重要作用，而且还在与受体的相互作用中起功能作用。还留有一个问题就是一个苯丙氨酸(或Phe6或Phe11)对于与受体的相互作用是否是足够的或者两者都是需要的。
现在已经知道，促生长素抑制素受体构成五种不同受体亚型族(Bell和Reisine，神经科学动态(Trends Neurosci.),16,34038,1993)，其可以根据其组织特异性和/或生物活性来区分。本领域已知的促生长素抑制素类似物可能不能提供足够的选择性或受体亚型选择性，特别是作为抗肿瘤剂(Reubi和Laissue,TIPS,16,110-115,1995)。
与转移类癌瘤肿瘤相关的症状(发烧和腹泻)和与分泌血管作用肠肽(VIP)的腺癌相关的症状(水样腹泻)用促生长素抑制素类似物治疗。也已经证明用促生长素抑制素治疗严重的肠胃出血。促生长素抑制素由于其抗分泌活性也可以用于其它分泌激素肿瘤(例如胰岛细胞肿瘤和肢端肥大症)和依赖激素的肿瘤(例如软骨肉瘤和骨肉瘤)的缓和治疗。肽模拟物作为有机化学和分子生物学主要研究的结果，现在很多生物活性肽可以以对于药物和临床应用足够的量制备。因此在最近几年，对于处理和治疗涉及肽的病状已经建立起新的方法。但是，由于下列原因，肽作为药物使用是有限的a)其对于在胃肠道和血清中的蛋白酶解的低的代谢稳定性；b)其口服吞下后不好的吸收作用，特别是由于其相对高的分子量或者缺少特异的运送系统，或者两者兼而有之；c)其通过肝和肾的快的排泄作用；和d)其在非靶物器官系统中的不期望的副作用，因为肽受体可以广泛分布于生物中。
此外，除少数例外外，小至中等大小(少于30个氨基酸)的天然肽在稀释的水溶液中在多构象时在可以导致受体选择性缺乏，代谢不稳定性和对测定生物活性构象努力的阻碍的动态平衡方面显示出不规则性。如果肽本身具有生物活性构象，即受体结合构象，则预期有提高的对受体的亲和性，因为结合熵的减小比结合揉性肽更小。因此其对于努力和开发有序的，均匀的，且生物活性的肽是重要的。
最近几年，已经进行了大量研究来开发比其原型天然肽具有更好的药物性能的肽模拟物或肽类似物。药物性能已经是最优化的天然肽本身一般作为开发这些肽模拟物的前导。但是，开发这些药剂的主要问题在于测定生物活性肽的活性区。例如，常常只有少数氨基酸(通常4-8个)负责受体对肽配体的识别。一旦测定了该生物活性位点，则可以将用于开发肽模拟物的前导结构最优化，例如，通过结构活性关系研究。
这里所使用的“肽模拟物”是作为受体配体的化合物，其可以在受体水平上模拟(激动剂)或阻断(拮抗剂)肽的生物作用。应该考虑下面的因素来完成最好的可能的激动剂肽模拟物a)代谢稳定性，b)好的生物利用率，c)高受体亲和性和受体选择性，和d)最小的副作用。
最近已经研究出开发尽可能近地模拟内源肽的受体结合构象的受限肽模拟物的一般性可应用和成功的方法(Rizo和Gierasch，生物化学年度评述(Ann.Rev.Biochem.),61:387,1992)。对这些类型类似物的研究表明其具有提高的对蛋白酶的抗性，即代谢稳定性的提高，以及提高的选择性，从而更少的副作用(Veber和Friedinger，神经科学动态，p.392，1985)。
一旦制备出具有稳固构象的这些肽模拟物化合物，则通过研究结构-活性关系选择最有活性的结构。这样的构象受限物可包括结构的局部修饰或整体构象受限物(有关综述参见Giannis和Kolter,Angeu.Chem.Int.Ed.Engl.32:1244,1993)。构象受限肽类似物肽中两个相邻氨基酸之间成桥导致局部构象修饰，与正常二肽相比，其揉性(flexibility)受限。生成这样的桥的一些可能性包括插入内酰胺和哌嗪酮。γ-内酰胺和δ-内酰胺在某种程度上被设计成“反转模拟”；在一些情况下，将这样的结构插入到肽中，产生生物活性化合物。
通过环化来限制肽链的揉性，肽构象中的整体受限是可能的(Hruby等，生物化学杂志(Biochem.J.).268:249,1990)。不仅仅是生物活性肽的环化作用改善其代谢稳定性和受体选择性，环化作用还对增强构象均匀性的受限施加影响，而有利于构象分析。环化的一般模式与自然存在的环肽所发现的相同。这包括侧链与侧链的环化作用或者支链与终端基团的环化作用。为此目的，受体识别中所没有涉及的氨基酸侧链相互连接或者与肽主链连接。另一种常见的环化作用是终端与终端的环化作用。
这些环化作用经典模式的主要限制是他们为了实现环化而需要氨基酸侧链的取代作用。
另一种关于肽构象受限的概念性探讨是由Gilon等介绍的(生物聚合物(Bio-polymer)31:745,1991)，其提议肽主链与主链环化。该策略理论上的优点包括通过肽主链的碳或氮影响环化而不干扰对与给定肽的特异受体的相互作用是关键的侧链的能力。尽管该概念设想是应用于所有感兴趣的线性肽，但是，事实是建议的方案中的限制因素是必须用来置换通过桥基连接的氨基酸的合适的结构单元的可用性。实施主链环化该概念的实际的还原作用被不能设计任何制备除甘氨酸以外的氨基酸结构单元的实际方法所阻碍(Gilon等有机化学杂志(J.Org.Chem),587:5687,1992)。
在Gilon,EPO申请No.564739A2；和有机化学杂志(J.Org.Chem)，57:5687,1992中，描述了两种合成结构单元的基础方法。第一种用二胺与溴酸反应开始。选择性保护ω胺，并且进一步修饰保护基团，得到适合Boc化学肽合成的结构单元。第二种方法从选择性保护二胺，并且产物与氯乙酸反应开始，得到适合Fmoc肽合成的保护的甘氨酸衍生物。
应用主链环化肽类似物概念的其它模式公开于WO95/33765，其也提供了合成除甘氨酸以外的结构单元的新的方法。WO95/33765公开的肽类似物组是不同的促生长素抑制素类似物。该申请中公开的类似物组中没有一个表明对结合受体亚型有独特的贡献或意料不到的好处。主链环化肽类似物库如上所述，线性肽作为有效力的药物具有一些严重的不足，如其在体内的众所周知的不稳定性，经常缺乏结合其受体的高亲和性，常常缺乏对一种受体的选择性，并且通常具有不好的口服生物利用率，如此之多。为了克服这些问题，也可以应用与合成的肽库相关研究出的方法来产生环肽，新的生物聚合物，还有新的支化的低聚物化合物的集合(Zuckermann的综述，结构生物学的最新观点(Current Opinion in Structural Biology)3,580-584,1993)。
环肽库的产生除了所有上述考虑外，要求环化反应要以高产率进行，并且要有最少的附加操作。令人遗憾的是，经典的环化反应从期望的产率来考虑是高度序列依赖性的，使得肽混合物的不均匀环化是不可靠的。
直接在固体载体上的肽环化的最新研究改良了合成方法，甚至以已知的环化方案为基础使环化反应自动完成。过去，环化作用一般在溶液中在高度稀释条件下进行。聚合物作载体的环化作用即避免潜在的副作用，例如低聚合作用，又有利于产物的纯化。例如，在树脂上的环化方法最近已经被用来制备带有两个侧链之间硫醚，二硫化物，或内酰胺，氨基末端和侧链之间的内酰胺，和氨基和羧基末端之间的内酰胺生成的桥的环肽(Zuckermann的综述，结构生物学的最新观点(Current Opinion inStructural Biology)3，上文)。
组合库中树脂结合环肽和游离环肽的应用公开于WO92/00091。但是，这些环肽不包含任何构象受限元素，而且实现环化的情况下，这些肽仍然选定一定数目构象，仍然有线性肽的相同的缺点。
WO95/01800公开的环半无规肽库全部是含有一个或几个无规氨基酸和固定相邻氨基酸残基的β-反转角的氨基酸残基例如脯氨酸形式的构象受限元素的环五肽和六肽库。这项研究的发明者强调了这些构象受限元素的优点。但是，通过向肽序列插入特定的氨基酸残基而包含这样的元素对受体识别或其它生物活性所必需的那些残基有不利的影响。此外，在该说明书中(WO95/01800)，环化反应只是另一种偶联反应，其中线性链肽的末端氨基与该肽的末端羧基偶联。
发明概述根据本发明，制备出新的肽模拟化合物，其特征在于插入与α-氨基酸的α氮连接的带有桥基的新的结构单元。
该项研究最引人注目的优点是
1)该方法成就肽序列的环化作用而不影向肽的任何侧链，从而减少了损失生物识别和功能所必需的功能基的机会。2)该方法通过使变更桥长度，取向，和键的类型(例如酰胺键，二硫键，硫醚键，硫酯键等)和环中键的位置使优化肽构象。3)当应用于已知活性线性肽的环化作用时，可以以这样方式设计桥以将肽活性区和其相应受体的相互作用最小。这减少了环化臂干扰识别和功能的机会，并且也产生了适合连接标记物的位点，所述标记物例如放射性示踪剂，细胞毒性药物，光捕获物质，或者任何其它期望的标记物。
本发明所公开的最新产生的库为了发现完成其作为激动剂或拮抗剂的作用的最适宜的肽主链构象而改变构象及揉性(受限)水平。这通过变化桥头的位置(即要环化的残基线性序列的位置)，以及改变这些单元之间桥的长度，取向和键型来实现。
本发明另一个目的是提供主链环化的促生长素抑制素类似物，包括含有与桥基连接的肽主链的一个氮原子的肽序列，如下所述。在本发明中，一对或几对结构单元相互连接，形成环结构。因此，根据本发明的一个方面，提供具有下面通式(Ⅰ)的主链环化的促生长素抑制素类似物
其中a-c各自独立地代表1-8或0的整数；(AA)代表氨基酸残基，其中每条链中的氨基酸残基可以相同或不同；Q代表H或酰基；E代表羟基，羧基保护基或氨基，或者末端羧基可以还原为CH2-OH；R1和R2各自代表任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；线代表下式桥基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W独立地选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自独立地选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，同型-或杂-环烯和取代的环烯。
在优选实施方案中，式(Ⅰ)末端羧基被羧基末端酰胺置换或者被还原为CH2OH基团。
本发明另一个实施方案包括通式(Ⅱ)N-主链与侧链环化的促生长素抑制素类似物
式(Ⅱ)其中d-f各自独立地代表1-8或0的整数；(AA)代表氨基酸残基，其中每条链中的氨基酸残基可以相同或不同；Q代表H或酰基；E代表羟基，羧基保护基或氨基，或者末端羧基可以还原为CH2-OH；R1代表任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；线代表下式桥基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W独立地选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自独立地选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，同型-或杂-环烯和取代的环烯。
本发明优选实施方案包括式Ⅰ或Ⅱ主链环化的促生长素抑制素类似物，其中线代表式-(CH2)x-M-(CH2)v-桥基；M选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；x和y各自独立地代表1-10的整数。
此外优选的是式Ⅰ或Ⅱ主链环化的促生长素抑制素类似物，其中R1和R2不是氢，例如CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)3-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，苄基，甲基吲哚和甲基咪唑。
本发明另一个优选方面是涉及产生位置6和11之间连接，留有未连接苯丙氨酸侧链的新的促生长素抑制素类似物的主链环化作用。该构象稳定作用比天然促生长素抑制素中Phe6,Phe11疏水性相互作用稳定得多，并且对于还原-氧化反应比Cys-Cys二硫桥更稳定。换句话说，第一次实现了稳定的共价键桥，同时保留了原Phe6和Phe11之一或两者。
此外，主链环化作用还可以用来固定β-转角，不只是在位置6和11，而且还在Phe7-(D)Trp8-Lys9-Thr10的活性反应中，得到具有优选构象的单环类似物或者非常刚性的二环类似物。在这里，药物活性氨基酸的侧链保持不连接，并且唯一的变化是在限制的构象空间。
如这里和下面的权利要求书中所使用的，更优选的主链环化的肽类似物中，氨基酸后面的上脚注指其在天然促生长素抑制素中的位置数。
更优选的主链环化的促生长素抑制素类似物是式(Ⅴa)
式(Ⅴa)最优选的类似物具有式(Ⅴb)
式(Ⅴb)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是Gly,(D)-或(L)-Ala,(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11独立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；R12不存在或者是Val,Thr或Nal，和Y2选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。在这些单环促生长素抑制素类似物中，主链环化取代了Cys6-Cys11二硫桥，留下和在天然促生长素抑制素中一样的苯丙氨酸侧链。还更优选的是其中Phe7被Tyr7置换和Thr10被Val10置换的类似物。
除了在位置6和11之外在活性区中的位置中固定分子的另一种优选的单环类似物是式Ⅵ(a和b)和Ⅶ(a-c)
式(Ⅵa)
式(Ⅵb)
式(Ⅶa)
式(Ⅶb)
式(Ⅶc)其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6是(D)-或(L)-Phe；R10不存在或者是Gly,Abu，或Thr；R11是(D)-或(L)-Phe；R12不存在或者是Thr或Nal，和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
还有其它优选的类似物如在式Ⅴ中在位置6和11加入主链环化，与如式Ⅵ和Ⅶ中的主链环化一起，得到刚性二环类似物。其它更优选的二环类似物与式Ⅴ-Ⅶ的不同在于形成二硫键的半胱氨酸取代了位置6和11的氨基酸，在式Ⅷ(a和b)和Ⅸ(a和b)中只留下一个主链环化
式(Ⅷa)
式(Ⅷb)
式(Ⅸa)，和
式(Ⅸb)其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)-或(L)-Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11独立地是Gly或Phe；R10不存在或者是Gly,Abu，或Thr；R12不存在或者是Thr或Nal；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
本发明最优选的实施方案是
(即，环[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X记为PTR 3046)
(即，环[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X记为PTR 3040)其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。这两种类似物显示出由于其对特定的促生长素抑制素受体亚型的选择性而具有出人意料的有用的性能。
更优选的单环促生长素抑制素类似物也可以制备成活性类似物库，其特别用于筛选最适宜的构象体。
根据本发明的还更优选的促生长素抑制素类似物包括式Ⅹ至ⅩⅣ的组成
式Ⅹ其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是Tyr或pClPhe；R10是Thr,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Thr Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式Ⅺ
其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或(L)-Phe,Ala或Lys；R6不存在或者是Phe；R7是Tyr或Phe；R10不存在或者是Thr,Val,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Trp,Thr,Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式Ⅻ
其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是Phe,(L)2-Nal或(D)-2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R10是(D)Thr,(D)Val(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12不存在或者是Thr或Val；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式ⅩⅢ
其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R8是(D)或(L)Trp；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Thr,Val,Ala,β-Ala,(L)2-Nal或(D)2-Nal；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
式ⅩⅣ
其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R1是Ala或(D)-2-Nal；R3是Phe,Gly,Ala或Lys；R4是Lys或Arg；R5是(L)Asn或(D)Asn；R7是Phe,Gly,Ala或Lys；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
本发明另一方面是制备通式(Ⅰ)环肽的方法
式(Ⅰ)其中a-c各自独立地代表1-8或0的整数；(AA)代表氨基酸残基，其中每条链中的氨基酸残基可以相同或不同；Q代表H或酰基；E代表羟基，羧基保护基或氨基，或者末端羧基可以还原为CH2-OH；R1至R4各自代表任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；线代表下式桥基(ⅰ)-X-M-Y-W-Z-；或(ⅱ)-X-M-Z-，其中M和W独立地选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；X,Y和Z各自独立地选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，同型-或杂-环烯和取代的环烯。
该方法包括插入至少一个式(Ⅲ)氨基酸的Nα-ω-功能化衍生物步骤
式(Ⅲ)其中X是选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，环烯和取代的环烯的间隔基团；R1是任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；B是选自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基羰基的保护基团；和G是选自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，醛，醇和烷基卤化物的官能团；和A是G的特定保护基团；进入肽序列并且顺序地将官能团与所述肽序列中氨基酸的侧链之一或者与另一个ω-官能化氨基酸衍生物环化。
优选的结构单元是共-官能化氨基酸衍生物，其中X是亚烷基；G是硫醇基团，胺基或羧基；R是苯基，甲基或异丁基；前提是当G是胺基时，R不是H。
另外优选的是ω-官能化氨基酸衍生物，其中R用特定保护基团保护。
更优选的是式(Ⅲ)ω-官能化氨基酸衍生物，其中G是氨基，羧基或硫醇基
其中X,R,A和B如上定义。
本发明另一方面是提供制备新的主链环化促生长素抑制素类似物的方法，包括插入至少一种氨基酸的Nα-ω-官能化衍生物，进入肽序列并且顺序地将官能团与所述肽序列中氨基酸的侧链之一或者与另一个ω-官能化氨基酸衍生物环化。本发明主链环化的类似物可以用作药物组合物和治疗疾病的方法，所述疾病包括术后疼痛，所有类型的炎症，特别是胰腺炎，癌症，内分泌失调和肠胃失调。
因此，本发明另一个目的涉及含有根据这里所公开的方法制备的药物活性主链环化肽激动剂和拮抗剂和药学可接受载体或稀释剂的药物组合物；和用其治疗炎症，癌症或内分泌失调和肠胃失调的方法。
附图的简要说明

图1图示作为主链环化促生长素抑制素类似物PTR3046的浓度的函数的对促生长素抑制素(SRIF-14)结合不同SSTR亚型的抑制作用。
图2图示作为主链环化促生长素抑制素类似物PTR3046和PTR3040的浓度的函数的对促生长素抑制素(SRIF-14)结合小鼠垂体AtT细胞系上促生长素抑制素受体的抑制作用。
图3是Octreotide和主链环化促生长素抑制素类似物PTR3046对大鼠生长激素释放的影响的图示比较。
图4是Octreotide和主链环化促生长素抑制素类似物PTR3046对大鼠胰岛素释放的影响的图示比较。
图5是Octreotide和主链环化促生长素抑制素类似物PTR3046对铃蟾肽诱导后胰腺内分泌释放的影响的图示比较。
图6是PTR3046和Octreotide对MiaPaca-2细胞抗增殖效果的图示比较。
发明的详细描述这里所描述化合物具有不对称中心。本发明包括所有的手性，非对映异构，和外消旋形式。这里所描述的化合物中还存在很多烃的几何异构体等，本发明包括所有这样稳定的异构体。
这里“稳定化合物”或“稳定结构”指足以稳定存在以从反应混合物中分离至有用程度的纯度，和配制成有效治疗药剂。
如这里和权利要求书中使用的，“烷基”或“亚烷基”意指包括具有1-10个碳原子的支链和直链饱和的脂肪烃基团；“链烯基”意指包括具有2-10个碳原子和沿链任何稳定位点存在的一个或多个不饱和的碳-碳键的直链或支链的构型的烃链，例如乙烯基，丙烯基等；“炔烃基”意指包括具有2-10个碳原子和沿链任何稳定位点存在的一个或多个碳-碳三键的直链或支链的构型的烃链，例如乙炔基，丙炔基等。
如这里和权利要求书中使用的，“芳基”意指任何稳定的5-至7-元单环或二环或7-至14-元二环或三环碳环，所有的环可以是饱和的，部分饱和的或芳香的，例如苯基，萘基，2,3-二氢化茚基，或十氢化萘,四氢化萘等。
如这里和权利要求书中使用的，“烷基卤”意指包括具有1-10个碳原子，其中1-3个氢原子被卤原子例如Cl,F,Br和I置换的支链和直链饱和的脂肪烃基团。
如这里和权利要求书中使用的，词组“治疗有效量”指对受者施用新的主链环化的肽类似物或含有该类似物的组合物以达到对于这里所描述的病症的期望的效果的量，所述病症例如但不限于炎症，癌症，内分泌失调和肠胃失调。
如这里和权利要求书中使用的，术语“取代的”指指定原子上的任何一个或几个氢原子被选出的指定基团置换，前提是指定原子正常价态不过剩，并且取代结果产生稳定化合物。
当任何变数(例如R,X,Z等)在任何组成或在任何结构式中存在一次以上时，各存在情况下其定义独立于任一其它存在情况下的其定义。而且只有如果组合产生稳定的化合物时才允许取代基和/或变数的组合。
如这里所使用的“肽”指肽键连接的氨基酸序列。本发明促生长素抑制素肽类似物包括4-24个氨基酸残基的氨基酸序列，优选6-14个残基，每个残基的特征在于具有一个氨基和一个羧基末端。
“结构单元”指通式Ⅳ Nα-衍生的α氨基酸
式(Ⅳ)其中X是选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，环烯和取代的环烯的间隔基团；R1是任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；和G是选自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，和烷基卤化物的官能团；其结合到肽序列中并且顺序地通过官能团G与所述肽序列中氨基酸的侧链之一或者与另一个ω-官能化氨基酸衍生物选择性环化。
制备结构单元的方法公开于国际专利申请PCT/IB95/00455，其在这里全文引作参考。结构单元缩写为相应的修饰过的氨基酸的三字母码，其后接反应类型(N对于胺，C对于羧基)，和间隔亚甲基基团数的指出。例如Gly-C2指用羧基反应基和一个两个碳的亚甲基间隔修饰的Gly残基，Phe-N3指用氨基反应基和一个三个碳的亚甲基间隔修饰的苯丙氨酸基团。
这里所使用的“线性肽”指只由氨基酸残基构成的并且没有任何结构单元的肽序列。
这里所使用的“主链环化的肽”指含有至少一个可能已经通过肽主链的α氮与另一个结构单元或者与序列中另一个氨基酸形成桥的结构单元的线性肽的类似物。这里所使用的“成环前的肽”指除了保留在非环化形式中以作为生物或其它筛选测试期间的对照物外和环类似物相同的类似物。术语非环的可以与术语成环前的互换使用。这里使用一些缩写来描述本发明和其制备和使用的方法。例如，AcOH指乙酸，Ada指金刚烷乙酰基，Adac指金刚烷羰基，Alloc指烯丙基氧基羰基，Boc指叔丁氧羰基，BOP指苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，BSA指牛血清白蛋白，Cbz指苄氧羰基，DCC指二环己基碳化二亚胺，DCM指二氯甲烷，Dde指1-(4,4-二甲基-2,6-二氧环己基-1-亚基-乙基)，DIEA指二异丙基-乙基胺，DMF指二甲基甲酰胺，DPPA指二苯基磷酰基叠氮化物，Dtc指5,5-二甲基噻唑烷-4-羧酸，EDC指N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺，EDT指乙二硫醇，Fmoc指芴基甲氧羰基，GPI指豚鼠回肠，HATU指[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐，HBTU指1-羟基苯并三唑基四甲基-尿鎓六氟磷酸盐，HF指氢氟酸，HOBT指1-羟基苯并三唑，HPLC指高压液相色谱，MALDI-TOF MS指基质辐助激光解吸飞行时间质谱，Mts指4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基，NBT指氮蓝四唑鎓，NMM指N-甲基吗啉，NMP指1-甲基-2-吡咯烷酮，PBS指磷酸盐缓冲盐水，Pmc指五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基，PNPP指磷酸对-硝基苯酯，PPA指1-丙磷酸环酐，PyBOP指苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐，PyBrOP指溴-三-吡咯烷-鏻六氟磷酸盐，RT指室温，SMPS指同时发生的多肽合成，SRIF指促生长素释放抑制因子，TBTU指2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐，t-Bu指叔丁基，TFA指三氟乙酸，TIS指三异丙基甲硅烷，Tpr指噻唑烷-4-羧酸，Trt指三苯甲游基，Ts指甲苯磺酰基。
本发明中所使用的氨基酸是商售的或者通过常规合成方法可得到的。一些残基可能需要结合到肽中的特定方法，肽序列的按顺序的，零散的和会聚性合成方法在本发明中是有用的。天然编码氨基酸及其衍生物用根据IUPAC惯例的三字母码代表。没有指明时，用的是L异构体。D异构体用残基缩写前的“D”表示。列出非编码氨基酸Abu指2-氨基丁酸，Aib指2-氨基-异丁酸，Cha指环己基丙氨酸，Hcys指高半胱氨酸，Hyp指S-顺式-4-羟基脯氨酸，1Nal指1-萘基丙氨酸，2Nal指2-萘基丙氨酸，Nva指正缬氨酸，Oic指八氢吲哚羧酸，Phg指苯基甘氨酸，pClPhe指对-氯-苯丙氨酸，pFPhe指对-氟-苯丙氨酸，pNO2Phe指对-硝基-苯丙氨酸，Thi指噻吩基丙氨酸。合成途径根据本发明，肽类似物是通过与允许新的非肽键的氨基酸的α氮连接的桥基而环化的。一般情况下，用来从其结构单元构建这样的肽类似物的方法依据已知的肽合成理论；最方便的是，根据已知的固相肽合成理论进行该方法。该新方法需要用下面通式的新的结构单元来置换肽序列中一个或多个氨基酸
其中R是氨基酸侧链，X是间隔基团，G是终端官能团，通过该官能团进行环化作用。侧链R是选择来结合到选择的肽序列中的任何天然的或合成的氨基酸的侧链。X是为了实现肽类似物合适的构象受限而选择来提供更大或更小揉性度的间隔基团。这样的间隔基团包括亚烷基链，取代的，支链的和不饱和的亚烷基，亚芳基，环烯，和不饱和的和取代的环烯。此外X和R可以结合生成杂环结构。
本发明优选实施方案使用含有2-10个碳原子的亚烷基链。
要用于肽类似物环化作用的末端(ω)官能团包括但不限于a．胺，用于与亲电子试剂例如活化的羧基，醛和酮(有或没有接下来的还原作用)，和烷基或取代的烷基卤的反应。b．醇，用于与亲电子试剂例如活化的羧基的反应。c．硫醇，用于生成二硫键和与亲电子试剂例如活化的羧基，和烷基或取代的烷基卤的反应。d．1,2和1,3二醇，用于生成缩醛和缩酮。e．炔或取代的炔，用于与亲核试剂例如胺，硫醇或阴碳离子；自由基；亲电子试剂例如醛和酮，和烷基或取代的烷基卤；或者有机金属配合物反应。f. 羧酸和酯，用于与亲核试剂(有或没有事先的活化)例如胺，醇，和硫醇的反应。g．烷基或取代的烷基卤或酯，用于与亲核试剂例如胺，醇，硫醇和阴碳离子(来自活化的亚甲基，例如乙酰乙酸酯或丙二酸酯)反应；和生成用于接下来的与烯烃或取代的烯烃和炔或取代的炔的反应的游离基。h．烷基或芳基醛和酮，用于与亲核试剂例如胺(有或没有接下来的还原作用)，阴碳离子(来自活化的亚甲基，例如乙酰乙酸酯或丙二酸酯)，二硫醇(用于生成缩醛和缩酮)的反应。i．烯或取代的烯，用于与亲核试剂例如胺，硫醇，阴碳离子，游离基，或有机金属配合物反应。j．活化的亚甲基，例如丙二酸酯，乙酰乙酸酯，和其它，用于与亲电子试剂例如醛和酮，烷基或取代的烷基卤的反应。
应该理解，在肽的合成中，这些末端活性基团，以及任何反应性侧链必须用合适的保护基团保护。
用于胺的合适的保护基团是烷基氧基，取代的烷基氧基，和芳基氧基羰基，包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)，芴基甲氧羰基(Fmoc)，烯丙基氧羰基(Alloc)和苄氧羰基(Z)。
用于环化作用的末端羧基可以被保护成其烷基酯或取代的烷基酯或硫酯或芳基酯或取代的芳基酯或硫酯。例子包括但不限于叔丁酯，烯丙酯，苯甲酯，2-(三甲基甲硅烷基)乙酯和9-甲基芴酯。
用于环化作用的硫醇基团可以被保护成其烷基硫醚或取代的烷基硫醚或二硫化物或芳基硫醚或取代的芳基硫醚或二硫化物。这样的基团的例子包括但不限于叔丁基，三苯甲游基(三苯基甲基)，苄基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基，pixyl(9-苯基咕吨-9-基)，乙酰胺基甲基，羧基甲基，2-硫-4-硝基吡啶。
另外技术人员还要理解各种反应部分要通过不同的保护基团保护，使其选择性去除。因此，当Nα被例如保护基团A保护时，特定的氨基酸将与其肽序列中相邻氨基酸偶联。如果胺要被用作反应方案中的环化作用的末端基团时，Nω将会被保护基团B保护，或者序列中所有的赖氨酸的ε氨基要用保护基团C保护等。
正如肽合成领域所公知的，氨基酸相互偶联是作为一系列反应进行的。本发明新的结构单元，也就是Nα-ω官能化氨基酸衍生物结合到肽序列中来置换一个或多个氨基酸。如果只选择一个Nα-ω官能化氨基酸衍生物，则其将与序列中另一个氨基酸侧链环化。例如(a)Nα-(ω-氨基亚烷基)氨基酸可以连接天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基；(b)Nα-(ω-羧基亚烷基)氨基酸可以连接赖氨酸残基的ε-氨基；(c)Nα-(ω-硫代亚烷基)氨基酸可以连接半胱氨酸残基的硫醇基；等等。本发明最优选的实施方案插入两个这样的可以相互连接生成N-主链与N-主链环肽类似物的Nα-ω官能化氨基酸衍生物。三个或多个这样的结构单元可以插入到肽序列中，产生下面将利用的二环肽类似物。因此，肽类似物可以用两个或多个环化作用构建肽类似物，包括N-主链与N-主链，还有主链与侧链或者任何其它肽环化作用。
如上所述，用来从新的结构单元构建本发明促生长素抑制素类似物的方法一般依据已知的肽合成理论。但是，应该理解可能需要供应本发明较大结构单元的方法。固相肽化学中氨基酸的偶联可以通过利用偶联剂来实现，偶联剂例如但不限于二环己基碳化二亚胺(DCC)，双(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦(BOP-Cl)，苯并三唑基-N-氧三二甲基-氨基磷鎓六氟磷酸盐(BOP)，1-氧代-1-氯磷烷(Cpt-Cl)，羟基苯并三唑(HOBT)，或其混合物。
现在已经发现将下面的氨基酸偶联到本发明大结构单元上可能需要使用另外的偶联剂，包括但不限于偶联剂，例如PYBOp(苯并三唑-1-基-氧-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐)，PyBrOP(溴-三-吡咯烷-磷鎓六氟磷酸盐)，HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐)，TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基尿鎓六氟硼酸盐)。
可以使用新的偶联化学试剂，例如预先生成的氨基甲酸乙酯保护的N-酸酐(UNCA’S)和预先形成的酰基卤最优选酰氯。这样的偶联可以在室温下发生，也可以在高温下，在溶剂中，例如甲苯，DCM(二氯甲烷)，DMF(二甲基甲酰胺)，DMA(二甲基乙酰胺)，NMP(N-甲基吡咯烷酮)或上述溶剂的混合物。
本发明的一个目的是制备通式(Ⅰ)主链环化的促生长素抑制素类似物的方法
式(Ⅰ)其中取代基如上定义；包括插入至少两个式(Ⅲ)氨基酸的Nα-ω官能化衍生物步骤
式(Ⅲ)其中X是选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，环烯和取代的环烯的间隔基团；R′是任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链例如H,CH3等；B是选自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基羰基的保护基团；和G是选自胺，硫醇，醇，羧酸和酯，醛，醇和烷基卤化物的官能团；和A是G的特定保护基团；进入肽序列，得到下式化合物
式(Ⅳ)(ⅱ)选择性去除保护基A和A′，并且与末端基团G和G′反应生成下式化合物
式(Ⅰ)其中d,e和f各自独立地是1-10的整数；(AA)是氨基酸残基，其中每条链中的氨基酸残基可以相同或不同；E是羟基，羧基保护基或氨基；R和R′各自是氨基酸侧链，例如H,CH3等；线代表下式桥基-X-M-Y-W-Z-其中M和W独立地选自二硫化物，酰胺，硫醚，亚胺，醚，和链烯烃；X,Y和Z各自独立地选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，环烯和取代的环烯；(ⅲ)去除所有的剩余的保护基团，得到式(Ⅰa)化合物。
以相同方法制备二环类似物，就是通过重复步骤(ⅱ)和(ⅲ)。通过选择保护基来进行确定哪一个残基是与其它残基环化的测定。各种各样的保护基可以选择性去除，从而露出用于环化的选择的反应基。
优选的是制备式(Ⅰ)主链环化的肽类似物的方法，其中G是胺，硫醇或羧基；R和R1各自不是H，例如CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，苄基，甲基吲哚，和甲基咪唑，和其中E共价连接于不溶的聚合物载体。
本发明另一个目的是制备通式(Ⅱ)主链环化的肽类似物的方法H(AA)d-N-CH(R1)-CO-(AA)e-NH-CH-CO-(AA)f-E式(Ⅱ)其中取代基如上定义；包括插入至少一个通式(Ⅲ)ω官能化氨基酸衍生物步骤
式(Ⅲ)其中X是选自亚烷基，取代的亚烷基，亚芳基，环烯和取代的环烯的间隔基团；R是氨基酸侧链例如H,CH3等；B是选自烷基氧基，取代的烷基氧基或芳基氧基羰基的保护基团；和G是选自胺，硫醇，醇，羧酸和酯或烷基卤化物的官能团；和A是其保护基团；进入肽序列，并且顺序地与所述肽序列中氨基酸侧链中的一个选择性环化官能团。
优选的是制备式(II)主链环化的肽类似物的方法，其中G是羧基或硫醇基；R是CH3,(CH3)2CH-,(CH3)2CHCH2-,CH3CH2CH(CH3)-,CH3S(CH2)2-,HOCH2-,CH3CH(OH),HSCH2-,NH2C(=O)CH2-,NH2C(=O)(CH2)2-,HOC(=O)CH2-,HOC(=O)(CH2)2-,NH2(CH2)4-,C(NH2)2NH(CH2)3-,HO-苯基-CH2-，苄基，甲基吲哚，和甲基咪唑，和其中E共价连接于不溶的聚合物载体。制备主链与侧链环化肽制备期望的主链环化的肽的优选的方法包括在固相载体上逐步合成线性肽和在固体载体上或者在从载体上脱离下来以后将肽主链环化。C-末端氨基酸通过羧酸酯或者其它键例如酰胺共价键合不溶性聚合物载体。这样的载体的例子是聚苯乙烯-共-二乙烯基苯树脂。使用的聚合物载体是与象Fmoc和Boc这样的化学部分相容的那些，包括例如PAM树脂，HMP树脂和氯甲基化树脂。树脂键合的氨基酸例如用TFA去保护，并且用偶联剂象BOP向其上偶联第二个在Nα上例如被Fmoc保护的氨基酸。第二个氨基酸用例如20％吡啶的DMF溶液去保护。然后可以偶联下面的保护的氨基酸并且在室温下去保护。数个偶联和去保护循环后得到肽，向期望的肽偶联具有例如羧基侧链的氨基酸。一种这样的氨基酸是Fmoc-天冬氨酸叔丁酯。将NαFmoc保护基去保护后，再次通过本领域公知的方法将肽延长。去保护后，用例如偶联剂BOP向肽树脂偶联用于主链环化的结构单元。一种这样的结构单元是例如Fmoc-Nα-(ω-Boc-氨基亚烷基)氨基酸。去保护后通过本领域公知的方法将肽延长至期望的长度。用这样的偶联剂例如PyBrOP进行接着该结构单元的保护的氨基酸的偶联以保证高产率。制备了线性，树脂结合的肽后，通过弱酸例如TFA去除共-亚烷基保护基团，例如Boc和t-Bu。然后将树脂键合的肽分成几份。使一部分用例如TBTU为环化剂在DMF中在树脂上进行环化作用以保证环化作用的高产率，得到N-主链与侧链环肽树脂。在树脂上环化后，通过试剂例如哌啶去除末端氨基保护基，用强酸例如HF处理后得到主链与侧链环肽。或者，在从树脂上去除主链环肽之前，用试剂例如乙酸酐，苯甲酸酐或任何其它酸例如偶联剂例如BOP活化的金刚烷羧酸，通过酰化来保护末端氨基。
肽-树脂的另一部分进行用于环化的侧链保护，例如ω-氨基和羧基。这通过使ω-氨基和例如Ac2O和DMAP在DMF中反应，并且通过例如DIC和HOBT活化游离的ω-羧基，得到活性酯，其然后与例如CH3NH2反应，得到环肽的非环类似物来进行。从树脂上去除肽，接着通过强酸例如HF去除侧链保护基，得到主链与侧链环化的肽的非环类似物。
线性和/或非环的类似物被用作其相应的环化合物的生物活性的参照化合物。产生主链环化的促生长素抑制素库的合成方法制备本发明环肽库的一般方法包括应用正交保护方案的固相肽合成，其使链延长，选择性去除保护基，环化保护的肽和在从树脂上裂解下来或未裂解下来时去除所有的侧链保护基。期望以基本上相同的量在库中存在不同的肽序列。
偶联反应通过产生酰胺键或酯键的方法进行，并且通过如这里所述本领域公知的方法进行。典型的偶联剂是碳化二亚胺，活化的酸酐和酯和酰卤。试剂例如EDC,DCC,DPPA,PPA,BOP,PyBOP,PyBrOP,HATU,TBTU,HOBT和N-羟基琥珀酰亚胺是典型的。
完成固相肽延长后，通过任何方案，肽的部分通过与结构单元的主链胺键合的氮连接的桥基环化。优选非环化形式中保留的部分用作生物或其它筛选测试中的对照。含有与主链环化的库相同但是避免后者构象受限的结构单元的肽类似物库的这部分称之为“成环前的”。或者，在任何合成方案中，可以进行主链环化步骤，然后另外进行氨基酸残基的偶联循环。
肽部分可以从树脂上裂解下来，并且去除保护基，这在生物活性测试之前是必须的。通过本领域公知的方法从树脂载体上裂解肽，具体方法取决于树脂的特性。本领域技术人员应该理解去除某些保护基可以和从树脂上裂解肽同时进行。
一般情况下，树脂和第一个氨基酸之间的偶联会生成酯键，当其从树脂上裂解时会在肽上得到羧酸基团。例举的是HMPB,Rink,PAM,Hycram和羟甲基树脂。另外，羧基末端氨基酸基团可以转化成酰胺，酯，或者还原为末端醇。
每个氨基酸或肽的侧链的反应官能团如肽领域公知的合适地保护。例如Boc,Cbz或Fmoc基团可以用来保护氨基，特别是α-氨基。烷基(例如t-Bu,Me),cHex，苄基或烯丙基酯可以用来保护Asp或Glu的侧链羧基。苄基，或者合适地被取代的苄基，三苯甲游基，Alloc或T-Bu基团用来保护半胱氨酸的巯基，或者其它含有硫醇的残基；或者Tyr,Ser或Thr的羟基。Cys和其它含硫的氨基酸也可以通过Acm基团或者通过与硫代烷基(例如乙硫醇)或硫代芳基生成二硫化物来保护。苄基/苄基氧基甲基，或合适地被取代的苄基/苄基氧基甲基，Boc或甲酰基可以用来保护His的咪唑基；Pmc，硝基，或合适地被取代的苯磺酰基(例如Ts,Mts)用于保护胍氮或Arg。邻苯二酰胺，Boc,Fmoc,Alloc，羧基苄基氧基或苄基，或者合适地被取代的苄基或苄基氧基可以用来保护赖氨酸的ε-氨基。苄氧羰基或苄基保护基合适的取代作用是用1-5个氯，溴，硝基，甲氧基或甲基，通常是在邻位和/或对位取代，并且用来改变保护基的反应性。这些保护基通过这样的方法去除，如催化氢化，液氨中的钠，肼，碱，TFA或HF处理，这是本领域公知的。选择对侧链保护基的选择，使其在用来将在生成肽链的肽主链的偶联反应中使用的反应官能团(例如一般是α-氨基)去保护的条件下不被去除。反应性官能团的保护基在偶联每一个顺序氨基酸之前去除。
根据使用正交保护方案的本发明使用结构单元(例如式Ⅳ中的G)的桥基，使得在不影响在侧链上保护基团或者从树脂上裂解肽的条件下，选择性去除这些保护基团。这使得在优选合成地树脂上主链环化。或者完全保护的肽可以从树脂上去除，在选择性去除结构单元保护基后在溶液中进行环化。
环化反应通过选择性偶联一个结构单元的桥基和另一个结构单元的桥基或氨基酸侧链来进行。作为举例，PyBOP是生成酰胺键情况下进行偶联反应的特别有用的试剂。为了生成二硫桥，使用氧化条件。
在本发明最优选的实施方案中氨基酸序列骨架以来自具有促生长素抑制素活性的天然或合成肽的已知的活性序列为基础。因此通过使活性构象刚性化有可能进一步提高这些已知序列的活性。
某些位置上的氨基酸被主链环化作用结构单元或者被天然的和非天然的三官能的氨基酸例如Asp,Glu,Cys,Hcys,Lys,Om和D对应物置换。这样的位置及结构寻找通过改变环化作用的位置，环与主链的连接，环化作用位置处的手性，成环键，环的大小和环中键的准确位置来进行。也可以结合改变肽的氨基酸序列来进行这些变化。促生长素抑制素类似物库的一般合成为了确定最佳化合物，产生不同受限类似物库后进行了筛选。用常规固相合成(本领域技术人员公知的)在TentaGel酰胺树脂(0.2-0.3mmol/g取代度)上合成肽库。在大多数情况下用NMP为溶剂，少数情况下用DMF。合成规模是库中或子库中每一种肽0.2-2μmol。除非另有说明，所有的反应都是在室温下进行的。
在其中一个以上氨基酸被偶联的每一偶联步骤中，将树脂分成合适的分数，向各部分加入不同的氨基酸。进行偶联，对于每一位置，用3摩尔过量每种氨基酸，3摩尔过量PyBrop和6摩尔过量的DIEA偶联1-16小时，偶联两次。所有的氨基酸用FMOC以其α-胺被保护。侧链保护如下His(Trt)；Lys(Boc或Dde)；Orn(Boc)；Ser(tBu)；Thr(tBu)；Tyr(tBu)。
两次偶联后，洗涤树脂部分，再化合，并且用20％哌啶的NMP溶液进行FMOC去保护共20-40分钟。另外洗涤后树脂又被分开(如果需要)，用于下一个氨基酸(多个氨基酸)的偶联。
环化之前，通过用溶解于含有2.5％AcOH和5％NMM的氯仿中的2摩尔当量(1当量用于肽中一个烯丙基/Alloc分子)的Pd(PPh3)4的溶液处理2-2.5小时或者处理1小时两次，来去除结构单元的胺和羧基的烯丙基/Alloc保护，用上述没有钯的溶液在处理前和处理后洗涤树脂，另外在去除过程后用NMP洗涤树脂。
用DCM洗涤后，通过用TFA70％,H2O5％,TIS1％,EDT2.5％,DCM(混合物A)或TFA70％,H2O5％,TIS1％，苯酚5％,DCM(混合物B)或TFA60％,H2O10％和30％DCM(混合物C)加另外用纯TFA洗涤两次处理，从树脂部分裂解肽。将每种树脂部分的三份裂解溶液收集在一起，用氮汽蒸发，向每个样品中加入0.5-1ml水后冻干。然后在C-18 SEP-PAK(Millipore Corp.)上部分纯化肽混合物，用0.1％乙酸或TFA水溶液为缓冲液A,50-80％于0.1％乙酸中的乙腈/水为缓冲液B，并冻干。
每个合成的子库用质谱(MALDI-TOF MS)和氨基酸分析表征。
结构单元缩写成相应的修饰过的氨基酸的三字母码，后面接反应基类型(N对于胺，C对于羧基)，和间隔亚甲基数目的指示。例如，Gly-C2指带有羧基反应基和两个碳亚甲基间隔的修饰的Gly残基，Phe-N3指带有氨基反应基和三个碳亚甲基间隔的修饰的苯丙氨酸基团。促生长素抑制素类似物的一般筛选合成的促生长素抑制素类似物一般在体外测试其对天然肽(SRIF-14)结合其7-跨膜受体的抑制作用，和其对第二信使和细胞生长的影响；和体内测试对激素和酶分泌的抑制作用。
进一步在体外测试类似物对环腺苷一磷酸(cAMP)水平，酪氨酸磷酸酶活性，生长激素分泌和细胞生长的影响。体内对库进一步测试对动物生长激素释放，淀粉酶，胃酸，胰岛素和胰高血糖素分泌的抑制作用。作为选择参数的代谢稳定性测试通过在血清或组织匀浆中温育，分离蛋白质，并且在温育之前和之后通过HPLC记录肽峰，通过其对酶降解的抗性来测试类似物的稳定性。不随延长的温育时间变化的肽峰是最稳定的。分离这些峰，并用质谱，N-末端序列和与纯化的肽峰的比较来表征。在该方法中快速鉴定了来自库或子库的最稳定的肽。
部分以已知的生物活性肽的数目的序列为基础或者以事先不知道的新的序列为基础构成的构象受限的促生长素抑制素类似物在下面的实施例中说明。
下面的实施例是为了详细说明怎样制备和使用这些化合物和本发明方法，在任何方面不作为一种限制。实施例合成实施例合成不同系列促生长素抑制素类似物，或者作为独立的主链环化的肽或者作为库。
分别合成和表征本发明相应于通式(Ⅴa)的三系列Octreotide促生长素抑制素类似物，并且测试其生物活性。
1)第一系列化合物相应于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe；R10是Thr；R12是Thr。因此该系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-R11-Thr-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亚烷基氨基酸结构单元。
2)第二系列化合物相应于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe；R10不存在；R11是Thr。因此该系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R11-Thr-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亚烷基氨基酸结构单元。
3)第三系列化合物相应于通式(Ⅴa)，其中R5是(D)Phe；R7是Phe。因此该系列包括下式化合物H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2其中R6和R11是Nαω-官能化的亚烷基氨基酸结构单元。
这些其中插入Nαω-官能化氨基酸结构单元的新的合成的肽类似物的结构总结在表1,2和3中。在这三个系列中，使用的结构单元甘氨酸结构单元，其中改变了通过α氮与肽主链连接的桥基。
为了简化起见，这三个系列在这里分别记为SST Gly6,Gly11；SST Gly6,Gly10；及SST Gly6Gly11R10R1-。
在各系列中，环化点的位置是不变的；在第一和第二系列中，改变了桥的长度和取向，而在第三系列中，桥不变而改变了位置10和12处的残基。因此，C2,N2指由酰胺键组成的桥，其中羰基紧邻肽的氨基端，其在桥酰胺和桥中包括的主链氮的每一个之间含有两个碳原子的亚甲基。
肽的装配可以用人工或者用自动肽合成仪(Applied,BiosystemsModel 433A)进行。肽装配之后，生成环化臂的桥基的去保护在烯丙基/Alloc保护基情况下用Pd(PPh3)4(四三苯基膦钯)进行，或者在tBu/Boc保护基情况下用TFA进行。为了获得非环类似物，在该阶段从树脂上裂解肽。用PyBOP进行肽的环化。从聚合物载体上裂解肽根据使用的肽的类型用合适的试剂进行，例如对于Rink酰胺类型树脂用TFA，对mBHA(对-甲基二苯甲基胺)型树脂用HF。粗产物用HPLC分析表征。通过制备反相HPLC纯化肽。纯化的产物用HPLC分析，质谱，和氨基酸分析来表征。
表1 SST Gly6,Gly11类似物
*线性指带有R6和R11位置没有衍生物化的Gly残基的相同的序列。**NA指没有得到。表1方法1)在mBHA树脂上人工合成。HF裂解。
2)在Rapp TentaGel树脂上人工合成。TFA裂解。
3)Rink树脂；在自动肽合成仪中装配，0.1mmol规模。
表2 SST Gly6,Gly10类似物
线性指带有R6和R10位置Gly残基的相同的序列。**这些类似物由其中N末端D-Phe5不存在和N-末端酰化的相同的SST序列组成。表2方法1)在自动肽合成仪中装配，0.1mmol规模。(HBTU)。
2)人工合成；PyBrop。
3)在自动肽合成仪中装配，0.25mmol规模。(HBTU)。
表3．以H-(D)Phe-R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2为基础的促生长素抑制素类似物<
实施例41.SST Gly6,Gly10N3,C2类似物的详细合成在装备有烧结玻璃底的反应器中用N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶胀5克Rink酰胺树脂(NOVA)(0.49mmol/g)，并且置于摇动器上。通过用20％哌啶的NMP溶液反应(10分钟2次，每次25ml)从树脂上去除Fmoc保护基。在290nm处紫外吸收测定监测去除Fmoc。室温下，用NMP(20ml)中Fmoc-Thr(OtBu)-OH(3当量)PyBrop(3当量)DIEA(6当量)进行偶联循环2小时。通过定性水合茚三酮测试(Kaiser测试)监测反应完全。偶联后，用NMP洗涤肽-树脂(用25mlNMP7次，每次2分钟)。通过肽-树脂与乙酸酐(封端混合物HOBt 400mg,NMP20ml，乙酸酐10ml,DIEA4.4ml)在室温下反应0.5小时进行封端。封端后，如上所述进行NMP洗涤(7次，每次2分钟)。如上所述进行Fmoc去除。以相同方式偶联Fmoc-Phe-OH,并且如上所述去除Fmoc基团。肽树脂与Fmoc-Gly-C2(烯丙基)结构单元反应偶联条件和上述一样。如上进行Fmoc去除。通过与HATU(3当量)和DIEA(6当量)在室温下反应过夜后在50E反应1小时将Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联到肽树脂上。反应期间加入另外的DIEA以保持碱性介质(如pH试纸测定是大约9)。重复偶联。通过Fmoc测试监测反应完全(取肽树脂并称重，如上去除Fmoc，并且测定紫外吸收)。如上所述，用PyBrop将Fmoc-D-Trp-OH与肽树脂偶联。去除Fmoc后，以相同方式偶联Fmoc-Phe-OH。用1/5肽树脂继续合成。
去除Fmoc后，引入第二个结构单元如上所述，用PyBrop反应Fmoc-Gly-N3(Alloc)-OH。如上所述进行封端。去除Fmoc后，将肽树脂分为两个相等的部分。用这些部分之一继续合成。如上对于Fmoc-Lys(Boc)-OH所述，通过用HATU反应偶联Fmoc-D-Phe-OH。如上所述进行封端。
通过在氩气下在室温下，用Pd(PPh3)4和乙酸5％，于氯仿中的吗啉2.5％反应2小时，去除烯丙基和Alloc。如上所述用NMP洗涤肽树脂。取2/3树脂用于环化。用PyBOP 3当量，DIEA6当量，于NMP中进行环化作用，在室温下过夜。洗涤肽树脂并干燥。通过用TFA81.5％，苯酚5％，水5％,EDT2.5％,TIS(三异丙基-硅烷)1％，和5％二氯甲烷在0EC下反应15分钟和在室温下在氩气下反应2小时，从树脂上裂解肽。混合物过滤到冷的醚(30ml,OEC)中，树脂用少量TFA洗涤。滤液置于旋转蒸发器中，并且去除所有的挥发成分。得到油状产物。用乙醚研制并且滗析乙醚，三次。得到白色粉末。干燥该粗产物。粗产物的重量是93mg。
根据式Ⅴb的另一系列新的主链环化的促生长素抑制素类似物是各个合成的，包括如下1)七肽系列NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe-Thr-NH22)七肽系列NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-R10-NPhe-R12-NH23)七肽系列NPhe-Phe-Trp-Lys-Gly-NPhe-R12-NH2在第一系列中(表4)，改变桥的长度和取向，而在第二系列中(表5)和在第三系列中(表6)，改变位置10和/或12处的残基。
表4．以R6-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-R11-Thr-NH2为基础的七肽促生长素抑制素类似物
*PTR-3046表5．以R6-Phe-(D)Trp-Lys-R10-R11-R12-NH2为基础的另外的七肽促生长素抑制素类似物
表6．以R6-Phe-Trp-Lys-Gly-R11-R12-NH2为基础的七肽促生长素抑制素类似物
实施例61．PTR3046的详细合成在装备有烧结玻璃底的反应器中在NMP中溶胀1克Rink酰胺MBHA树脂(NOVA)(0.55mmol/g)，并且置于摇动器上。通过用20％哌啶的NMP溶液反应(15分钟2次，每次5ml)从树脂上去除Fmoc保护基。用水合茚三酮测试监测Fmoc的去除。室温下，用NMP(5ml)中Fmoc-Thr(OtBu)-OH(4当量)PyBrop(4当量)DIEA(12当量)进行偶联循环0.5小时。通过定性水合茚三酮测试(Kaiser测试)监测反应完全。偶联后，用NMP洗涤肽-树脂(用5ml NMP 3次，每次2分钟)。通过肽-树脂与乙酸酐(封端混合物HOBt 40mg,NMP 5ml，乙酸酐1ml,DIEA 0.5ml和DNAP(cat))在室温下反应0.5小时进行封端。封端后，如上所述进行NMP洗涤。如上所述进行Fmoc去除。偶联Fmoc-Phe(C3)-烯丙基BU(BU 2当量，PyBrop 2当量DIEA6当量，NMP 5ML,0.5小时)，并且如上所述去除Fmoc基团。如上洗涤肽树脂。肽树脂通过双偶联与Fmoc-Val-Cl(4当量，colidingl 2当量，1小时，38C)反应。根据二肽至三肽的转化监测偶联完全(裂解肽树脂样品，使粗三肽进行HPLC(0.1％水/乙腈))。如上进行Fmoc去除。通过和对于Fmoc-Thr(OtBu)-OH一样的反应条件(参见上文)将Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联到肽树脂上。通过水合茚三酮测试监测反应完全。如上所述，用PyBrop将Fmoc-D-Trp-OH与肽树脂偶联。去除Fmoc后，以相同方式偶联Fmoc-Tyr(tBu)-OH。去除Fmoc后，引入第二个结构单元如上对于Fmoc-Phe(C3)-烯丙基B所述，用PyBrop反应Fmoc-Phe-N2(Alloc)-OH。通过用Pd(PPh3)4和乙酸5％，N-甲基吗啉2.5％于氯仿中在氩气下在室温下反应1.5小时，去除烯丙基和Alloc保护基。如上所洗涤肽树脂。用PyBOP 3当量，DIEA 6当量，于NMP中进行环化作用，在室温下反应0.5小时。如上洗涤肽树脂。去除Fmoc后，洗涤肽树脂(DCM3×5ml)，干燥，并且通过用TFA94％，水2.5％,EDT2.5％,TIS(三异丙基-硅烷)1％在0℃下反应15分钟和在室温下反应1.5小时，从树脂上裂解肽。混合物过滤，树脂用少量TFA洗涤。滤液置于旋转蒸发器中，并且去除所有的挥发成分。得到油状产物。用乙醚研制并且滗析乙醚。得到黄色粉末。干燥该粗产物。粗产物的重量是290mg。各促生长素抑制素类似物的其它实施例表7中总结了本发明制备的新的促生长素抑制素类似物的另外的各实施例。
表7．合成的其它促生长素抑制素类似物
促生长素抑制素类似物库促生长素抑制素序列中氨基酸的位置数目是以天然的促生长素抑制素肽为基础的(SRIF-14,Raynor等，上文)。实施例68VH-SST1库将该库设计成5个最后子库中含有40个主链环肽，每一个包含8个不同的肽。
在最后偶联步骤之前(R5)，将树脂分成5部分，对于每部分用不同的AA进行偶联，得到不同的子库用于下面步骤。这5个部分是表8中描述的子库，其表明用于产生40个类似物的每个位置所使用的全部残基。
表8．VH-SST1库的组成
实施例69IG-SST1库在该库中，带有Gly-C2的位置6和带有Gly-N2的位置10之间的桥是不变的。库包含在4个子库中的36个肽其R5残基不同。该库的组成见表9。
表9．IG-SST1库的组成
实施例70YS-SST1库该库代表在如表10所述的4个子库中的16个类似物。通过4个不同的桥基(位置R6和位置R11或R10之间)定义了这些子库，每个子库包含4个类似物。
表10．YS-SST1库的组成<
实施例71YS-SST2库该库包含4个子库中的48个肽。该子库其R7残基不同，并且每个子库包含12个肽。这些库的组成见表11。
表11．YS-SST2库的组成<
实施例72YS-SST3库该库包含2个子库中的12个肽。这些子库其R6结构单元不同，并且每个子库包含6个肽。该库的组成见表12。
表12．YS-SST3库的组成<
实施例73YS-SST4库该库包含2个子库中的48个肽。这些子库B不同于A，如表13所示在R5位置存在Thr。
表13．YS-SST3库的组成
实施例74YS-SST5A和B库设计这些库用来优化位置6和11之间桥的大小和取向，同时确定位置5处各种萘基丙氨酸残基的影响。YS-SST-5A库由4个子库组成，每个子库有16个肽。代表子库C和D的简单合成方案的YS-SST-5B库由8个子库组成，每个子库有4个肽。下面的图示中详述了肽的合成。Ys5A库
Ys5B库
实施例75YS-SST6库表14描述了包含24个六肽的该库。在位置R6插入两个不同的Phe-结构单元，在位置R7,R8和R9处有另外的变化。肽在主链之间位置R6和R10之间环化。缺失了位置5和12处的氨基酸。
表14．VH-SST6库的组成
实施例76VH-SST7和VH-SST7A库这些库各包含45个子库中的280304个主链环化的肽。在非裂解树脂(TentaGel-NH2)上合成肽，得到连接小球的肽，用于固相分析中的筛选。表Ⅲ中描述了这些库的组成。库相互不同之处只是在于VH-SST7在位置8处包含Trp，而VH-SST7A在相同位置包含D-Trp。
表15．VH-SST7库的组成
这些子库对于其确定的位置定为A1,A2,…An,B1…Bn,…H1…Hn。对于每一组，除定义外的位置包含混合的氨基酸。在各偶联步骤中，每个没有定义的位置得到在该位置存在的混合的氨基酸(为了促进完成每一次氨基酸偶联和为了减少动力效果，各步骤中共1摩尔当量氨基酸，得到不等呈现的肽)。在每一个A至H组中通过固相测试鉴定最活性的子库，将从库中存在的290304个肽中引出最活性环肽的组成。实施例77YS-SST6库该库包括表16所述的8个子库中的128个主链环化的促生长素抑制素类似物。应用了两个基础的环化作用位置3与位置7和位置2与位置6。每个子库不同在于桥的位置，桥的类型和取向或者位置1处的氨基酸(Ala或D2Nal)。
表16．YS-SST6子库的结构
实施例78IG-SST9库为了更系统地测试SRIF序列中任何给定框架对于类似物的生物活性的必要性，平行合成出SRIF结构跨不同部分相互不同的Octreotide类似物库。每个Octreotide子库一个残基与下一个顺序偏移。因此第一个子库跨SRIF的残基7-14，第二个子库跨SRIF的残基6-13，依此类推。该库包括共14个搭接的主链环化的Octreotide，每个子库之间有一个残基位移。
通过从不同起点同时合成类似物来实现合成，使得结构单元的偶联对于所有子库同时进行。在所有这些子库中，肽序列N末端远处的一个甘氨酸-C2单元和肽序列N末端近侧的一个甘氨酸-N3单元之间完成主链环化作用。
下面的示意图中表示了库IG-SST9
IG-SST9库
实施例79SST14库在该库中使用不同的苯丙氨酸结构单元(PheBU:Phe-N2,Phe-N3,Phe-C2,Phe-C3)作为用于产生SRIF序列4-11主链环化的类似物(IG-SST9库中子库D)的桥臂。另外，非桥Phe残基(位置6或7)被各种Phe和Nal衍生物取代DPhe,pNO2Phe,pCLPhe,pFPhe,(Phg),Dphg,L2Nal,D2Nal。这提供了18个组的库和每个库16个类似物，如下面表中所述表17．SST14库的组成
实施例80YS-SST7库该库包含具有下面组成的48个类似物表18．YS-SST7库的组成
实施例81YS-SST10库该库包含5个子库，每个子库24个肽，如下面图中描述。
实施例82YS-SST12库表19描述的该库代表后主链环化的促生长素抑制素类似物，并且由6个子库组成，每个子库有18个类似物。通过桥的类型(Phe-C2至Gly-N36或Phe-N311至Gly-C26)和位置R10处的残基定义不同的子库。
表19．YS-SST12库的组成
实施例83YS-SST15库该六肽库由通过位置R6和R7处残基定义的8个子库中的96个类似物组成。
表20．YS-SST15库的组成
生理实施例对本发明促生长素抑制素类似物体外和体内测试其在生物分析中的活性，与下面相比较天然的促生长素抑制素肽，即SRIF；已知的促生长素抑制素类似物Octreotide；非环化的促生长素抑制素衍生物和/或作为负对照的无关的肽。实施例84促生长素抑制素的体外放射性配体结合试验对促生长素抑制素类似物测试其对I-Tyr11-SRIF结合表达跨膜促生长素抑制素受体(SSTR-1,2,3,4或5)的膜制剂的抑制作用的效力(根据Raynor等，分子药理学(Molecular Pharmacology)43,838-844,1993描述的方法为基础)。用于该试验的受体制剂是来自在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中选择性和稳定表达的克隆受体或者来自天然表达SSTRs的细胞系。一般情况下，在Tris缓冲液中在蛋白酶抑制剂存在下将细胞膜匀浆，并且与不同浓度的试验样品125I-Tyr11-SRIF温育30-40分钟。过滤结合反应物，冲洗过滤器，并且在γ计数器上计数结合的放射性。非特异性结合定义为在1μM未标记的SRIF-14存在下保持结合的放射性。
为了证实结合试验的正信号，和为了减少非特异性信号，用相同方法合成和操作的不相关的肽样品例如GnRH作为负对照样品在相同测试中试验。在所有的测试中这些样品都没有结合活性。实施例85环肽类似物的受体结合特异性认为在不同信号转导途径中涉及不同的促生长素抑制素受体亚型。关于选择显示出与和要治疗的疾病相关的那些受体亚型特异性和选择性结合的促生长素抑制素类似物这将具有意义。根据Reisine和Bell的综述(内分泌评论(Endocrine Rev.)16,427-442,1995)，认为几种受体亚型的活性如下SSTR-1和SSTR-2激活导致EGF受体自身磷酸化的抑制的酪氨酸磷酸酶，一种与SST抗增殖作用相关的过程。
SSTR-2抑制生长激素和促胃液素释放，与治疗肢端肥大症和通过生长因子的抗增殖作用相关的过程。
SSTR-5抑制胰岛素，脂肪酶，淀粉酶释放，与抑制钙流入量相关的和与SST抗增殖作用相关的活性。
SSTR-3在血管发生中涉及。
体外在表达各种受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中测试实施例1-50代表性肽与不同的促生长素抑制素受体的结合。表21给出了用环肽获得的选择性的实施例。出现的IC50值是抑制50％放射性碘化促生长素抑制素(SRIF-14)结合所需要的浓度。
表21估算出通过选择的主链环化的类似物抑制125I-SRIF-14结合克隆的SSTRs的IC50值(nM)。
通过在实施例84描述的放射配体结合测试中以10-6,10-7,10-8M浓度测试类似物来计算IC50值。
图1给出了PTR3046(合成实施例No.42)对克隆SSTRs的亲和性。PTR3046超过其它促生长素抑制素类似物的出人意料的优点是其选择性。该类似物以高亲和性结合人SSTR-5，而对其它SSTRs的结合小得多。
此外，PTR3046对大鼠和人SSTR5的亲和性相类似，因此大鼠模型给出的药物剂量可以预测对人的药效。为比较起见，表22给出了PTR3046的亲和性和已知SST类似物获得的亲和性。
表22．PTR3046对已知的SST类似物的对SSTR亚型的选择性
*Reisine和Bell(1995)，内分泌评论(Endocrine Rev.)16,427-442。**L.Buscail等(1995),PNAS92；1580-1584。
另一种环肽类似物表现出令人感兴趣的选择性曲线。该类似物表现出对受体亚型SSTR-1相对高的亲和性和对于其它受体亚型非常低的亲和性。PTR3040表现出对大鼠SSTR-5高度结合的同时，其对克隆的人受体的亲和性明显较低。
也对各种类似物测试了125I-SRIF结合小鼠垂体AtT20细胞的抑制作用。用PTR3046和PTR3040获得的结果与SRIF-14相比较在图2中给出。这些结果表示每种化合物每具体浓度的抑制百分率。实施例86环肽类似物库的受体结合特异性体外在表达各种受体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中测试实施例68-83代表性子库肽与不同的促生长素抑制素受体的结合。用环肽库获得的选择性实施例在表23中给出。这些值表示放射性碘化促生长素抑制素(SRIF-14)结合的抑制百分率。
表23．通过选择的主链环化的子库抑制125I-SRIF-14结合克隆的SSTRs的估算的IC50值(nM)
各子库中不同肽的数。
以各子库混合物中总的肽浓度为基础计算估计的IC50值。但是，各子库由不同的肽组成，它们可能具有不同的活性。在任何给定的子库中最好的肽的活性因此可能更高(即低于IC50值)，到由每个子库中数个肽瓜分的给定值的程度。另外，由于用来计算浓度的子库的总重量中盐和杂质的存在，纯化的各肽的活性值可能更好。体内实施例体内对选择的类似物测试对动物生长激素释放，淀粉酶，脂肪酶，促胃液素，胰岛素，缩胆囊素(CCK),VIP和胰高血糖素分泌的抑制作用。生长激素(GH)与肢端肥大症有关。促胃液素分泌与促胃液素瘤(Zollinger-ellison综合症)和溃疡有关。胰岛素释放与胰岛瘤，高胰岛素血症，肥胖和NIDDM有关。胰高血糖素分泌与高血糖，NIDDM和血胰高血糖有关。淀粉酶和脂肪酶释放与急性和慢性胰腺炎，肠皮肤性和胰腺瘘管和胰腺外科有关。VIP释放与VIP瘤和分泌性腹泻有关。另外，促生长素抑制素的抗增殖作用可以是直接的或通过GH-IGF或CCK释放的间接的。实施例87促生长素抑制素生物活性测试(体内测试)通过用商购RIA试验药盒测定这些激素的水平来测试SST类似物对生长激素，胰岛素和胰高血糖素释放的体内生物作用肠神经内分泌肿瘤患者SST的药学效果需要测定5-羟基吲哚乙酸(对于类癌瘤)和VIP(对于VIP瘤)。静脉内给药放射性碘化SST类似物后，进行SST受体-阳性肿瘤的体内目测，如Lambert等所述(New England J.Med.,323:1246-1249，1990)。实施例88对SST类似物生物降解的抗性测定人血清中SST环肽类似物,PTR3002的体外稳定性，并且与非环肽类似物(PTR3001)的相同序列，与Octreotide(SandostatinTM)，与天然促生长素抑制素(SRIF)相比较。在该项测试中，本发明环肽和Octreotide一样稳定，比相应的非环肽结构更稳定，比SRIF稳定得多。该测试以作为对时间的函数的37℃血清中肽的降解的HPLC测定为基础。实施例89SST类似物对生长激素释放的抑制作用根据公知方法，对大鼠进行环肽SST类似物药物动力学性质的体内测定。对Sprague-Dawley雄性大鼠测定作为肽给药结果的生长激素(GH)释放的抑制作用。在该项研究中，每组用4只大鼠，将SST环肽类似物活性与SRIF或与Octreotide相比较。测定不变试验条件下对于GH释放的时间函数曲线。方法没有特异病原体(SPF)，重200-350g成年雄性Sprague-Dawley大鼠保持不变日-夜周期(光照自8:00至20:00小时)，温度(21±3℃)和相对湿度(55±10％)。随意进食实验室食物和自来水。在试验的这一天，用戊巴比妥(50mg/kg)麻。大鼠。用戊巴比妥麻醉的大鼠门静脉血管中具有低促生长素抑制素水平(Plotsky,P.M.，科学，230,461-463,1985)。从暴露的套了管的颈静脉取一个血样(0.6ml)，用于基础GH水平测定(-15分钟)。其后紧接着给予合适的肽处理。动物接受了10mg/kg或者天然促生长素抑制素(SRIF)，合成的类似物Octreotide(Sandostatin)，或者环肽类似物。给与生理盐水溶液(0.9％氯化钠)作为对照。以最终体积0.2ml皮下给与所有的肽。给药肽后15,30,60和90分钟再次取样。将血样收集到含有肝素的试管中(每毫升血15个单位)并且立即离心。分离血浆并且保持在-20℃下冷冻直到测试。
利用放射免疫测试药盒(Amersham)测定大鼠生长激素(rGH)[125I]的水平。该试剂盒中的标准物已经对国际糖尿病消化病和肾病研究所得到的参考标准制剂(NIH-RP2)进行了校正。所有的样品重复测定。
这些试验结果表明Octreotide明显抑制生长激素的释放，而不结合SSTR-2的环类似物PTR3046与该项试验中的盐水没有明显区别，这一点正是对选择用于SSTR-5受体亚型的促生长素抑制素类似物所期望的。
这些研究数据总结在图3中。实施例90环肽类似物没有毒性剂量为1.5mg/kg的PTR3007在一次腹膜内施用后耐受性很好。即使用4mg/kg剂量PTR3013对大鼠也没有毒性。这两个剂量是比达到期望的内分泌作用所需要的剂量大得多的等级。溶解在盐水中的肽对动物中枢神经系统，心血管系统，体温和外周不产生副作用。给药肽后对大鼠观察4小时。PTR3007和3013不产生呼吸障碍，不导致刻板动作行为的出现，或者肌紧张变化。3小时后，尸体解剖检查在肝，肾，动脉和静脉，肠胃道，肺，生殖系统或脾都没有检查到任何不正常。实施例91促生长素抑制素类似物对大鼠葡萄糖诱导的胰岛素释放的体内作用以作为胰岛素释放抑制剂的天然促生长素抑制素已知的方法学为基础，进行该项研究以评价主链环化类似物PTR3046对饭后胰岛素分泌的作用。试验使用没有特异病原体(SPF)，重200-220g成年雄性Wister大鼠。动物保持不变日-夜周期(光照自8:00至20:00小时)，温度(21℃)和湿度(55％)。使动物随意进食食物和水，直到实验前18-20小时，取走所有的食物(但是不取走水)。动物豢养在带有宽网线底的塑料笼中以防止食粪(食用粪便)。在试验的这一天，用戊巴比妥(60mg/kg IP)麻醉大鼠。用戊巴比妥麻醉后15分钟将导管插入右外部静脉中取血样。用直肠温度数字温度计监测体温，除了自50cm的距离用两个100W灯泡照射操作台外，通过加热大鼠下面的热垫使温度保持在不变水平(37-37.5∞C)。插入套管后，从颈静脉取0.7ml血样，并且转移到事先加入20IU肝素溶液5000IU/ml的试管中。收集该血样用于测定基础胰岛素水平。此后紧接着给与合适的肽预处理。
动物接受了下面的肽10μg/kg的合成的类似物Octreotide(n=15)，7μg/kg的主链环化的肽PTR3046(n=18)。给与0.2ml盐水(0.9％氯化钠)作为对照(n=16)。所有的肽以0.2ml最终体积皮下给药。给药10分钟后，以最终剂量0.5g/kgⅣ给与葡萄糖后紧接着取下一个血样。在给与葡萄糖后2和5分钟进行进一步的取样。
采集各血样后立即Ⅳ给与合适体积(0.7ml)盐水。将血样收集到含有肝素(每毫升血15个单位)的试管中并且立即离心(1500g)，分离血浆并在-20℃下冷冻保存(直到测试)利用大鼠胰岛素RIA药盒测定大鼠胰岛素(rlns)[125I]水平。该药盒使用特异性制备抗大鼠胰岛素(Linco)的抗体。药盒的灵敏性是0.1ng/ml。所有的样品重复测定。结果与未处理的对照大鼠相比，给药7μg/kgPTR3046导致胰岛素释放的明显(p＜0.05)降低(43％)。该试验中Octreotide预处理大鼠胰岛素水平的降低统计学上不明显。
这些结果证明主链环化的肽PTR3046在体内是有药效的饭后胰岛素释放的抑制剂。以该研究和制备者对于Octreotide报道的数据为基础(胰岛素释放的ED50是26μg/kg)，得出结论体内PTR3046对胰岛素释放比Octreotide的效力大4倍。
高胰岛素血症是与肥胖症和早期非胰岛素依赖型糖尿病糖尿(NIDDM)的病理相关的病原学因素之一。因此，着眼于该新的SST类似物对胰岛素分泌的高度抑制，PTR3046作为抗促分泌素对胰岛素释放的有潜力的应用应该被考虑。
这些研究的数据总结在图4中。实施例92促生长素抑制素类似物对铃蟾肽刺激的血浆淀粉酶和脂肪酶释放的作用据报道(Reisine和Bell，上文)，对胰岛素或淀粉酶释放与对SST受体亚型SSTR-5的亲和性高度相关，而对垂体生长激素(GH)释放，胰腺胰高血糖素，和胃酸分泌的抑制作用是SSTR-2介导的。上面(实施例85)给出的结合亲和性数据证明与其对SSTR-1,2,3和4低亲和性(＞1000nM)相比的环六肽PTR3046对hSSTR-5(亲和性20nM)的选择性。以这些结果为基础，用铃蟾肽刺激的脂肪酶和淀粉酶释放的体内模型评价PTR 3046的生理活性的初期评价。以三个不同的剂量，即3μg/kg,12.5μg/kg和25μg/kg给药肽类似物后对大鼠测定PTR3046抑制淀粉酶和脂肪酶释放的剂量效应。这些剂量与以剂量10μg/kg给药的合成的类似物SMS-201 995相比较。方法通过腹膜内途径(IP)用戊巴比妥(60m/kg)麻醉雄性Wister大鼠(重200-220g)。使动物随意进食食物和水，直到实验前18小时，取走所有的食物(但是不取走水)。而且动物豢养在带有宽网线底的笼中以防止食粪(食用粪便)。采集样品插入套管后，从颈静脉取0.7ml血样，并且转移到含有20IU肝素溶液5000IU/ml的Eppendorf试管中。1分钟后皮下给药肽(SC，于0.2ml0.9％氯化钠中)。用0.2ml0.9％氯化钠预处理对照大鼠。0时(收集基础血样-1后5分钟)对所有的动物开始注入铃蟾肽(50nmol/kg/hr)。在注入铃蟾肽期间在60,90和120分钟恒定的时间间隔收集另外的血样。处理样品将血样收集到含有肝素(20IU/ml)的冰冷却的试管中，并离心(1500g×10分钟)。冷冻血浆样品，并且在-20℃下冷冻保存直到用于测试淀粉酶和脂肪酶。分析-测试用商售(RaichemTM)淀粉酶试剂测定血浆中淀粉酶水平。
用商售药盒(RandoxTM)测定血浆中脂肪酶水平。结论SST类似物抑制铃蟾肽刺激的淀粉酶分泌对照(盐水预处理)以50nmol/kg/hr的剂量I.V.注入铃蟾肽导致血浆淀粉酶(在60和90分钟高于基础10倍)和脂肪酶(在60和90分钟高于基础14倍)时间依赖性增加。PTR3046用PTR3046预处理导致与对照大鼠相比的铃蟾肽诱导的血浆淀粉酶释放明显的剂量依赖性抑制。对于3μg/kg剂量，抑制在90分钟时是31％，在120分钟时是23％，对于25μg/kg剂量，抑制在90分钟时是60％，在120分钟时是52％。用10μg/kg Octreotide预处理导致在这些时间点23％明显抑制作用。SST类似物抑制铃蟾肽刺激的脂肪酶分泌PTR3046用PTR3046预处理导致与对照大鼠相比的铃蟾肽诱导的血浆脂肪酶释放明显的剂量依赖性抑制。对于3μg/kg剂量，抑制在90分钟时是33％，在120分钟时是26％，对于25μg/kg剂量，抑制在90分钟时是51％，在120分钟时是35％。而用10μg/kg SMS预处理在90和120分钟分别导致27％和30％明显抑制作用。
用PTR3010得到相似结果(数据没有给出)。
这些结果证明，如在初期结合测试和酶和内分泌分泌生理模型中所示，PTR3046是对于SSTR-5的选择性类似物。
铃蟾肽诱导的胰腺和胃分泌是评价铃蟾肽拮抗剂，铃蟾肽抗体和促生长素抑制素类似物抗分泌作用的常用体内模型。
铃蟾肽在人几种肺病和肠病中推断的作用提示抑制铃蟾肽，例如PTR3010和PTR3046的分泌作用的药物可以用作与铃蟾肽相关的各种治疗靶物的药物治疗剂，所述疾病包括分泌性疾病，例如胰腺炎，鼻炎和胃泌素瘤；神经内分泌细胞增生疾病例如支气管肺发育异常，和慢性支气管炎和气肿；增殖疾病例如前列腺肥大，前列腺癌，胰腺癌和胃癌。
此外，门静脉高血压，GI出血，和结肠直肠癌也可以是有效的应用。实施例93．十二指肠胰腺灌注用铃蟾肽或Caerulein模型的限制性是两个试验都是以非直接检测血清中酶的水平为基础。因为淀粉酶可以从唾液和GI道中其它位点释放，需要直接测定对酶的胰腺释放的作用。为了达到该目的，对大鼠建立灌注模型。结果表明如在十二指肠灌注液中直接测定的，PTR3046和Sandostatin(通过Ⅳ注入给药)两者都抑制酶的胰腺释放。
排出胰腺释放的十二指肠段近侧与胃无关，远侧与空肠无关。用生理盐水灌注该肠段，以15分钟时间间隔收集灌注液。分别通过Ⅳ注入1nMol/kg/h或4nMol/kg/h铃蟾肽或Caerulein。在灌注期间(酶的水平达到平稳状态之后)Ⅳ输入药物又2小时。测定灌注液样品中胰腺肽水平。数据以铃蟾肽诱导的平稳状态的平均酶百分含量表示。实施例94．抗增殖活性以对Caerulein(CCK类似物)诱导的外分泌释放的抑制为基础，并且因为CCK是GI道中潜在的生长因子，测试PTR3036对从GI肿瘤产生的癌细胞系的潜在的抗增殖活性是合理的。
发现PTR3036对人胰腺细胞系，MiaPaca-2的显著的抗增殖作用(图6)。
细胞在补加有10％FCS的DMEM培养基中生长。24小时后使细胞接触平板。以10-5M至10-11M浓度范围向培养基中加入药物。施用药物后24,48和72小时通过MTT测试评估细胞的增殖。
权利要求
1．具有通式(Ⅰ)的主链环化的促生长素抑制素类似物
式(Ⅰ)其中a-c各自独立地代表1-8或0的整数；(AA)代表氨基酸残基，其中每条链中的氨基酸残基可以相同或不同；Q代表H或酰基；E代表羟基，羧基保护基或氨基，或者末端羧基可以还原为CH2-OH；R1和R2各自代表任选与特定保护基团键合的氨基酸侧链；线代表下式桥基-(CH2)x-M-(CH2)v-；M选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物；x和y各自独立地代表1-10的整数。
2．具有通式(Ⅴa)的权利要求1的主链环化的促生长素抑制素类似物
式(Ⅴa)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是Gly,(D)-或(L)-Ala,Phe,Nal和β-Asp(Ind)；R6和R11独立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；R12不存在或者是Val,Thr或Nal，和Y2选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
3．具有通式(Ⅴb)的权利要求2的主链环化的促生长素抑制素类似物
式(Ⅴb)其中m和n是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R6和R11独立地是Gly或(D)-或(L)-Phe；R7是Phe或Tyr；R10不存在或者是Gly,Abu,Thr或Val；和Y2选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
4．具有下面结构的权利要求3的主链环化的促生长素抑制素类似物环[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
5．具有下面结构的权利要求4的主链环化的促生长素抑制素类似物
其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
6．具有下面结构的权利要求3的主链环化的促生长素抑制素类似物环[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
7．具有下面结构的权利要求6的主链环化的促生长素抑制素类似物
其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
8．具有通式(Ⅺ)的权利要求1的主链环化的促生长素抑制素类似物式Ⅺ
其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是(D)-Phe或(L)-Phe,Ala或Lys；R6不存在或者是Phe；R7是Tyr或Phe；R10不存在或者是Thr,Val,Ser或Abu；R11是Phe,Gly或Ala；R12是Trp,Thr,Val,2-Nal或(D)-2-Nal；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
9．具有通式(Ⅻ)的权利要求1的主链环化的促生长素抑制素类似物
式Ⅻ其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5是Phe,(L)2-Nal或(D)-2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe,Gly或Ala；R12不存在或者是Thr或Val；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
10．具有通式(ⅩⅢ)的权利要求1的主链环化的促生长素抑制素类似物
式ⅩⅢ其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R5不存在或者是(D)Phe或2-Nal；R6是Phe,Gly或Ala；R7是(D)Phe,pCl(D)Phe,pNH2Phe或(D)Tyr；R8是(D)或(L)Trp；R10是(D)Thr,(D)Val,(D)Ala,(D)Leu或(D)Glu；R11是Phe，Gly或Ala；R12是Thr,Val,Ala,β-Ala,(L)2-萘基丙氨酸或(D)2-萘基丙氨酸；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
11．具有通式(ⅩⅣ)的权利要求1的主链环化的促生长素抑制素类似物
式ⅩⅣ其中i和j独立地是1-5；X代表羧基末端酰胺或醇；R1是Ala或(D)-2-Nal；R3是Phe,Gly,Ala或Lys；R4是Lys或Arg；R5是(L)Asn或(D)Asn；R7是Phe,Gly,Ala或Lys；和Y1选自酰胺，硫醚，硫酯和二硫化物。
12．药物组合物，含有权利要求1-11任一项的促生长素抑制素类似物和制药可接受载体或稀释剂。
13．权利要求12的药物组合物，其中促生长素抑制素类似物是环[NPhe-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-NPhe]-Thr-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
14．单位剂量形式的权利要求13的药物组合物。
15．权利要求12的药物组合物，其中促生长素抑制素类似物是环[NPhe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-NPhe]-Val-X其中X代表羧基末端酸，酰胺，酯或醇。
16．单位剂量形式的权利要求15的药物组合物。
17．治疗内分泌失调，肿瘤或代谢失调的方法，包括对需要治疗的个体施用治疗有效量的权利要求1-11任一项的促生长素抑制素类似物。
18．权利要求1-11任一项的促生长素抑制素类似物在制备治疗内分泌失调，肿瘤或代谢失调的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了新的肽类似物。新的肽是构象受限的主链环化的促生长素抑制素类似物。也公开了合成这些促生长素抑制素类似物及制备这些促生长素抑制素类似物库的方法。此外,还公开了含有该促生长素抑制素类似物的药物组合物,以及应用这样的组合物治疗内分泌失调,肿瘤和代谢失调的方法。
文档编号C07K1/04GK1231672SQ97198197
公开日1999年10月13日 申请日期1997年7月30日 优先权日1996年7月31日
发明者V·霍尼克, A·塞里-利维, G·盖勒曼, C·吉洛 申请人:佩普特有限公司, 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司