降低含细胞的生物组合物中化合物的批量设备和使用方法

专利名称：降低含细胞的生物组合物中化合物的批量设备和使用方法
技术领域：
本申请涉及降低生物组合物中化合物的方法和设备。这些化合物的分子量为约100g/mol-约30000g/mol。
背景技术：
大量研究都集中在从血液制品中除去物质。该研究中大多数都导致白细胞降低。参见，例如M.N.Boomgaard等人的Transfusion34311(1994)、F.Bertolini等人的Vox Sang 6282(1992)和A.M.Joustra-Dijkhuis等人的Vox Sang6722(1994)。过滤血小板是用于降低血小板浓缩物中白细胞的最常见方法。参见，例如M.Bock等人的Transfusion 31333(1991)(Sepacell PL-5A，Asahi，Tokyo，Japan)、J.D.Sweeney等人的Transfusion 35131(1995)(Leukotrap PL，Miles Inc_Covina，CA)和M.van Marwijk等人的Transfusion3034(1990)(Cellselect，NPBI，Emmer-Compascuum，TheNetherlands；Immugard Ig-500，Terumo，Tokyo，Japan)。然而目前这些过滤机械不能除去分子量相对较低的化合物，包括例如补骨脂素、补骨脂素光化产物以及处理生物流体时常用的其它化合物。
已将吸附方法用于磷脂聚合物上分离选择性血液组分。例如，已对具有不同电荷的几种共聚物与血液组分的相互作用进行了评价，包括血小板粘着和蛋白质吸附。K.Ishihara等人的J.Biomed.Mat.Res.281347(1994)。但是没有将这些聚合物设计用于吸附低分子量化合物。
各种透析装置可以从血浆和全血中除去低分子量化合物。例如，透析可以成功地除去低分子量毒素和药物化合物。因此，可以将透析用于，例如从血液制品中除去补骨脂素和补骨脂素光化产物。不幸的是，目前透析过程需要非常复杂和昂贵的设备。因此，将透析机械用于大量血液制品的去污染就不切实际。
以前已描述过使用聚苯乙烯二乙烯基苯、二氧化硅凝胶和丙烯酰酯聚合物吸附亚甲蓝。例如，PCT公开号WO91/03933描述了自由吸附剂树脂的批量研究(例如，Amberlite(Rohm and Haas(Frankfurt，Germany)和Bio Beads(Bio-Rad Laboratories(Munich，Germany))。但是，在暴露到血液制品中之后没有非常仔细地将这些吸附剂树脂除去，因此这些方法导致了转输树脂粒的危险。
此外，也已公开了除去白细胞和病毒灭活剂(例如，补骨脂素、金丝桃素和例如亚甲蓝、甲苯胺蓝和结晶紫的染料)的设备和方法。具体地说，PCT公开号WO95/18665描述了包括铺设的织物网的过滤器，该织物网含有机械稳定的聚合基质。该网本身含有形成具有间隙的基质的联锁织物纤维和在该间隙内分布的原纤维粒。但是，该设备使因子XI活性大大降低，这可能使处理过的产品不能适宜其预定的用途。
因此需要更简单、更安全且更经济的装置，以降低含细胞的生物组合物中低分子量化合物的浓度，同时基本上保留了含细胞的处理过的生物组合物的生物活性。
发明描述本发明提供了降低含细胞的生物组合物中化合物浓度的设备。该设备包括含有被惰性基质所固定的颗粒的吸附介质，且为批量结构。典型地，在生物组合物中使用该设备所降低的化合物的分子量为约100g/mol-约30000g/mol。该生物组合物所含的细胞包括例如悬浮在生物介质如血浆或组织培养基中的细胞。该生物组合物在与这些设备接触之后基本上保留了其生物活性。
例证化合物包括病原体灭活化合物、染料、硫醇、增塑剂和活化补体。所提供的设备包括被惰性基质固定的三维网络吸附剂颗粒。该固定化降低了松散吸附剂颗粒漏入血液制品的危险性。而且，由惰性基质固定吸附剂颗粒简化了减少与处理松散吸附剂颗粒相伴的问题的操作。固定吸附剂颗粒也可以提高吸附剂颗粒吸附含细胞的生物组合物中化合物的能力，且对细胞没有机械破坏。
本发明提供了降低含细胞的生物组合物中生物反应调节物的浓度方法，其中该方法基本上保留了生物组合物的所需生物活性。该方法涉及用一种设备处理该生物组合物。
在一个实施方式中，该设备包括含大量吸附剂颗粒的惰性基质，其中吸附剂颗粒的直径范围在约100μm-约1500μm，并且其中将该设备用于批量加工。
在另一实施方式中，该生物反应调节物为活化补体。
在另一实施方式中，该设备的吸附剂颗粒为具有优良可湿性的聚芳香族吸附剂颗粒。
在另一实施方式中，该设备的吸附剂颗粒为来自合成源的活性炭颗粒。
在另一实施方式中，该设备的惰性基质为合成聚合物纤维，该合成聚合物纤维包括被具有低熔解温度的鞘包围的具有高熔解温度的聚合物核心。
在另一实施方式中，该设备的惰性基质为颗粒网络，该颗粒网络包括聚乙烯颗粒。
在另一实施方式中，该生物组合物包括血小板。
在另一实施方式中，该生物组合物包括红血球。
在另一实施方式中，该方法还降低生物组合物中补骨脂素衍生物或吖啶衍生物的浓度。
在另一实施方式中，该方法还降低生物组合物中染料或猝灭剂的浓度。
附图简述

图1图示了纤维的一个实施方式的透视图，显示了其内部核心和外部鞘，它们形成了固定吸附剂介质的纤维网络。
图2图示了本发明固定吸附剂介质的一个实施方式的一部分。
图3图示了吸附剂珠固定在纤维中构成纤维化树脂的固定吸附剂介质的一个实施方式的横截面图。
图4图示了吸附剂珠固定在固定吸附剂介质的纤维中并且热封包围纤维化树脂样品的固定吸附剂介质的一个实施方式的横截面图。
图5为用Dowex_XUS-43493和Amberlite_XAD-16 HP松散吸附剂珠以及含Amberlite_XAD-16的固定吸附剂介质从血小板中除去氨基补骨脂素的吸附动力学的比较的示意图。
图6为用含Amberlite_XAD-16的固定吸附剂介质和具有两种不同载荷的活性炭的固定吸附剂介质从血小板中除去氨基补骨脂素的吸附动力学的比较的示意图。纤维化XAD-16数据由圆圈、实线表示；纤维化AQF-500-B数据由正方形、短划线表示；纤维化AQF-375-B由三角形、长划线表示。
图7为用p(HEMA)-涂敷的和未经涂敷的Dowex_XUS-43493珠从血小板中除去氨基补骨脂素的吸附动力学的比较的示意图。
图8为用含甘油的溶液将Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493预处理对氨基补骨脂素的相对吸附能力的影响的比较的示意图。
图9为润湿溶液对在100％血浆中Amberlite_XAD-16(下面)和Dowex_XUS-43493(上面)干燥吸附剂的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素吸附能力的影响的比较示意图，未在乙醇溶液中润湿的样品标为“No Tx”。吸附能力被报道为相对于最佳湿吸附剂能力的百分率。
图10为使用在几种不同溶液中润湿过的Amberlite_XAD-16从血浆中经过3小时吸附氨基补骨脂素的比较示意图。
图11为从血浆中经过2小时吸附亚甲蓝的动力学的比较示意图。
图12图示了吖啶、吖啶橙、9-氨基吖啶和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的化学结构。
图13为绘制不同树脂对腺嘌呤容量的数据(y-轴)和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶容量的数据(X-轴)的示意图。
图14A和图14B为用Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200以及Amberlite_XAD-16 HP除去5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附动力学的比较的示意图。
图15为用Dowex_XUS-43493除去9-氨基吖啶和吖啶橙的吸附动力学的比较的示意图。
图16描述了固定吸附设备(IAD)的批量结构。
图17为与Purolite MN-200相比较不同Ambersorb等温吸附线的比较的示意图。
图18为经过连续或终止暴露到纤维化Pica G277 IAD(500g/m2)中24小时后在4℃下贮藏4星期的300mL PRBC单元的上层清液中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的水平的比较的示意图。
图19为封闭材料对PRBC中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附动力学的影响的示意图。
图20为含未经固定和经过固定的吸附剂颗粒Purolite MN-200的吸附剂设备的溶血百分率的比较的示意图。
图21为未经固定和经过固定的吸附剂颗粒Pica G-277活性炭的溶血百分率的比较的示意图。
图22为从血小板浓缩物中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的动力学的示意图。
图23为纤维基质IAD(AQF，正方形)和颗粒基质IAD(Porex，三角形)的补骨脂素吸附动力学的示意图。
实施本发明的最佳方式本发明提供了降低含细胞的生物组合物中化合物浓度的设备。该设备包括由惰性基质固定的颗粒组成的吸附介质并且为批量结构。典型地，在生物组合物中使用该设备所降低的化合物具有约100g/mol-约30000g/mol的分子量。生物组合物所含的细胞包括例如悬浮在生物介质如血浆或组织培养基中的细胞。该生物组合物在与这些设备接触之后基本上保留了其生物活性。
例证化合物包括病原体灭活化合物、染料、硫醇、增塑剂和活化补体。所提供的设备包括被惰性基质固定的吸附剂颗粒的三维网络。该固定降低了松散吸附剂颗粒漏入血液制品的危险性。而且，由惰性基质固定吸附剂颗粒简化了减少与处理松散吸附剂颗粒相伴的问题的操作。固定吸附剂颗粒也可以提高吸附剂颗粒吸附含细胞的生物组合物中化合物的能力，且对细胞没有机械破坏。
定义术语“吖啶衍生物”是指含三环结构吖啶(二苯并[b，e]吡啶；10-氮杂蒽)的化合物。这些化合物对核酸具有亲和力，并且能通过插入非共价地粘附到核酸上。术语“氨基吖啶”是指这些吖啶化合物具有一个或多个含氮官能团。氨基吖啶的例子包括9-氨基吖啶和吖啶橙(图12所示)。
术语“吸附剂颗粒”广义上是指任意天然或合成的颗粒物，它能与液体中的分子相互作用，因此使该分子从液体中被除去。天然存在的吸附剂的例子包括但不限于活性炭、二氧化硅、硅藻土和纤维素。合成吸附剂的例子包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯酸和含碳吸附剂。吸附剂颗粒通常为多孔，通常具有高表面积，并且可以用各种可以影响该吸附剂与分子如何相互作用的官能团(例如离子的、疏水的、酸性的、碱性的)改性。
术语“芳香族”、“芳香族化合物”等广义上是指具有离域电子的原子环的化合物。该单环化合物苯(C6H6)为常见芳香族化合物。但是，在一个以上的相邻环(例如，萘(2个环)和蒽(3个环))上能够发生电子离域。不同类型的芳香族化合物包括，但不限于，芳族卤化物(芳基卤)、芳杂环化合物、芳族烃(芳烃)和芳族硝基化合物(芳基硝基化合物)。
术语“生物相容的包被”广义上是指用亲水聚合物覆盖表面(例如聚苯乙烯珠表面)，当该亲水聚合物与血液制品接触时不会导致有害、有毒或免疫反应，并且通过降低细胞粘附力、降低蛋白质粘附力或提高细胞功能赋予该表面更大的生物相容性。适宜的包被是生物相容的，即使它们对与其接触的生物材料具有微弱影响(如果有的话)。“微弱”影响意思是与对照相比看不出大的生物学差异。在优选实施方式中，生物相容的包被提高了聚合结构的表面血相容性。例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(pHEMA)经常被用于医疗设备(例如血液过滤器)的包被。
术语“生物相容的容器(housing)”广义上是指适宜装生物物料如含血小板或红血球的组合物的容器、袋、管、接受器等。适宜的容器是生物相容的，即使它们对包含其中的生物材料有微弱影响(如果有的话)。“微弱”影响意思是与本文中所述的对照相比在血液制品功能中对红血球、血小板和血浆看不出大的差异。因此，血液制品在输血到受血者之前可以在生物相容的容器中贮藏。在优选实施方式中，生物相容的容器为血袋，包括血小板贮藏容器或红血球贮藏容器。
术语“与生物组合物相容的容器”是指适宜装含细胞的生物组合物的容器，该组合物例如有细胞培养组合物和含血小板或红血球的组合物。这些容器对含细胞的生物组合物具有微弱的影响。这些容器的例子包括，但不限于，细胞培养板、细胞培养瓶和血袋。
术语“生物学液体”包括细胞培养基、贮藏细胞的合成培养基、人体或非人体的全血、血浆、血小板、红血球、白血球、血清、淋巴、唾液、乳、尿、或来自或含任意上述单个或混合物的产品，有或者没有化学添加剂溶液。优选地，该流体为血液或含有或不含化学添加剂溶液的血液制品，更优选血浆、血小板和红血球，最优选分离性输血血浆、红血球和血小板。
术语“血袋”是指一类血液制品容器。
术语“血液制品”是指通过体循环系统的液体和/或相关细胞成份等(例如红血球、白血球、血小板等)；血液制品包括，但不限于，血液细胞、血小板混合物、血清和血浆。术语“血小板混合物”是指一类血液制品，其中该细胞成份主要或仅有血小板。血小板浓缩物(PC)为一类血小板混合物，其中这些血小板伴随有比正常血浆部分更小的部分。在血液制品中，合成培养基可以弥补正常血浆所占的体积；例如，血小板浓缩物可以限定血小板悬浮在35％血浆/65％合成培养基中。经常，该合成培养基含有磷酸盐。
术语“血液分离装置”广义上是指能够将血液分离成血液制品(例如，血小板和血浆)的设备、机械等。分离性输血系统是一类血液分离装置。分离性输血系统通常包括血液分离设备、复杂管道和过滤器网络、收集袋、抗凝剂和控制所有组分的电脑化装置。
术语“经过交联的”广义上是指彼此连接形成两维或三维网络的线性分子。例如，二乙烯基苯(DVB)用作形成苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的交联剂。该术语还包含“超交联”，其中经过超交联的网络是将或者溶液中或者为溶胀状态的线性聚苯乙烯链与双官能试剂交联制得的。可以将各种双官能试剂用于交联(例如，参见Davankov和Tsyurupa，Reactive Polymers 1324-42(1990)；Tsyurupa等人，ReactivePolymers 2569-78(1995))。
术语“环化合物”是指具有一个(即，单环化合物)或一个以上(即，多环化合物)环原子的化合物。该术语不限于含特定数量原子的环的化合物。尽管大多数环化合物所含的环为5或6个原子，但是其它数量原子(例如3或4个原子)的环也被本发明所认同。尽管环中原子主要是碳原子，但是对这些原子的一致性没有限制。一般说来，多环化合物的环彼此相邻，但是，术语“多环”化合物包括那些含多个彼此不相邻的环的化合物。
术语“染料”广义上是指赋予色彩的化合物。染料通常含有连接到一个或多个环化合物上的发色团和助色团的基团。色彩是由于发色团，然而染色亲和力是由于助色团。染料已被分成许多类，包括吖嗪染料(例如，中性红、藏红和偶氮胭脂红B)；偶氮染料；偶氮胭脂红染料；脱苯甲烷染料；荧光黄染料；酮亚胺染料；品红染料；三苯基甲烷染料；酞菁染料；以及金丝桃素。应认为可以将本发明的方法和设备经实践与任意为环化合物的染料结合。
术语“纤维化树脂”通常是指固定的吸附剂材料，包括例如，包埋在纤维网络中或附着在纤维网络上的树脂。在一个实施方式中，该纤维网络由聚合物纤维组成。在另一实施方式中，这些纤维是由被相对较低熔解温度的聚合物鞘(例如，尼龙或改性PET)包围的较高熔解温度的聚合物核心(例如，聚对苯二甲酸乙二酯[PET])组成的。纤维化树脂可以通过在不致使树脂的吸附能力产生很大程度的负面影响的条件(温度足够融化鞘但不融化核心)下加热该纤维网络制成。在该树脂含有珠的地方，进行加热以便吸附剂珠附着在外部聚合物鞘上产生“纤维化珠”。通过生产每定义面积含已知数量吸附剂珠的纤维化树脂，可以通过切割定义面积的纤维化树脂，而不是称重吸附剂珠来获得用于除去环化合物(例如，补骨脂素，特别是氨基补骨脂素)和其它产品的纤维化树脂样品。
术语“过滤器”广义上是指能够使混合物中某些组分通过同时滞留其它组分的设备、材料等。例如，过滤器可以包括孔径允许血液制品(例如红血球组合物)通过同时保留例如树脂粒的其它组分的网状物。术语“过滤器”并不限于保留某些组分的装置。
术语“杂环化合物”广义上是指其中一个或几个环含一种以上原子的环化合物。通常，碳原子为主要原子，同时其它原子包括例如，氮、硫和氧原子。杂环化合物的例子包括呋喃、吡咯、噻吩和吡啶。
术语“高温活化过程”是指典型地由于原料热解和/或氧化致使表面积、孔隙率和经过处理的材料的表面化学发生改变的高温过程。
术语“固定的吸附剂设备(IAD)”是指包埋在惰性基质中或附着在惰性基质上的固定吸附剂材料。在惰性基质为纤维网络的地方，术语IAD可以与术语纤维化树脂交换地使用。例如，纤维化Ambersorb 572和Ambersorb IAD(AQF)指的是相同材料。
术语“惰性基质”是指任意合成或天然存在的纤维或聚合材料，可以将它们用于固定吸附剂颗粒，而基本上没有影响血液制品的所需生物活性。尽管该基质对吸附或除去过程几乎没有贡献，但是它可能对降低较小有机化合物的浓度有利。此外，该惰性基质可以与细胞或蛋白质组分相互作用，使得细胞除去(例如白细胞排除)或除去蛋白质或其它分子。
术语“分离”是指从含一种以上组分的混合物中分离出一种物质。例如，可以从全血中分离出血小板。所分离的产物不必是该产物从其它组分中完全分离。
术语“大孔的”通常意思是孔径大于约500_。术语微孔是指孔径小于约20_。术语中孔是指孔径大于约20_小于约500_。
将术语“大孔”用于描述大量孔径大于约500_的孔结构。
术语“大网络”是相对术语，意思是具有高度物理多孔性(即，存在大量孔)结构，多孔吸附剂结构既有大孔又有微孔。
术语“网封闭物”、“网袋”等是指加工成含多个开口的封闭物、袋、包或类似物。例如，本发明使用一种袋，它装有固定吸附剂颗粒，其孔尺寸使血液制品能接触固定的吸附剂颗粒，但将固定的吸附剂颗粒保留在袋中。
术语“隔离物”是指可以将一个整体分离或分开成区段或部分的任意类型的设备或元件。例如，本发明试图使用一种隔离物将适宜含血液制品的血袋分成两个部分。在处理之前和处理过程中血液制品占该袋的一部分，同时吸附剂树脂占另一部分。在一个实施方式中，在血液制品处理之后，将该隔离物移去(例如将该隔离物的完整性改变)，因此使得处理过的血液制品与吸附剂树脂接触。该隔离物可以位于袋的内部，也可以在其外部。当使用术语“隔离物”时，术语“移去”意思是血袋两个部分的分开不再存在，不必是该隔离物不再以某种方式与袋相连。
术语“光化产物”是指补骨脂素或其它染料(例如亚甲蓝、酞菁染料)经过暴露在紫外线辐射的光化学反应所至的产物。
术语“聚芳香族化合物”是指在主链中含芳香基的聚合物，例如聚对苯二甲酸乙二酯，或作为侧基的聚合物，如聚苯乙烯，或既在主链中含芳香基又作为侧基的聚合物。
术语“聚苯乙烯网络”广义上是指含苯乙烯(C6H5CH=CH2)单体的聚合物；这些聚合物可以是线性，由单个共价烷链与苯基取代基组成，或经交联，通常与间-或对-亚苯基残基或其它双官能或超交联结构交联，从而形成二维聚合物主链或三维网络。
术语“补骨脂素移去装置”是指可以从例如血液制品中除去大于约80％补骨脂素的一种物质或设备；优选地，大于约90％；更优选地大于约99％。补骨脂素移去装置还可以移去血液制品中的其它组分，例如补骨脂素光化产物。
短语“降低浓度”是指从生物组合物中除去一部分低分子量化合物。同时浓度的降低优选大于约70％，更优选约90％，最优选约99％。
短语“除去几乎所有溶液中自由的所述化合物部分(例如补骨脂素、补骨脂素衍生物、异补骨脂素、吖啶、吖啶衍生物、染料、增塑剂或活化补体)”优选地是指除去大于约80％的溶液中自由的该化合物，更优选除去大于约85％，再优选大于约90％，最优选除去大于约99％。
术语“树脂”是指一种固体载体(例如颗粒或珠等)，它能够与溶液或液体(例如血液制品)中包括补骨脂素的各种小有机化合物相互作用并吸附，因此降低了溶液中这些成分的浓度。不将该除去过程限制在任意特定的机理中。例如，可以通过疏水或离子相互作用除去补骨脂素。术语“吸附剂树脂”广义上是指天然有机物和合成物及其混合物。
术语“搅拌方式”是指可以混合生物组合物的任意方法。搅拌方式的例子包括，但不限于，以下机械搅拌器往复、轨道、三维旋转装置和旋转装置型搅拌器。
术语“震动器设备”是指能够充分混合血液制品样血小板浓缩物的任意类型的设备。该设备可以具有使混合限制在特定阶段的定时机构。
术语“烧结介质”是指通过施加热和压力形成多孔树脂的结构，包括例如颗粒热塑性聚合物。多孔树脂可以通过以下制成将熔点相对低的聚合物颗粒混合，将它们加热至该塑性颗粒部分熔融，但仍然以流体途径渗透到多孔树脂中。烧结吸附剂介质类似地可以通过将碳或其它高或不熔融的吸附剂颗粒与低熔点的粉混合并加热制成。生产多孔塑性材料的方法描述在US3975481、4110391、4460530、4880843和4925880中，引入本文作为参考。该方法使得低熔点颗粒熔融形成多孔固体结构。通过在烧结过程中将聚合物颗粒放置在成型工具中可以将该烧结介质形成各种形状。在进行烧结过程之前通过吸附剂颗粒与热塑性聚合物颗粒混合可以将吸附剂颗粒加入烧结介质中。
术语“稳定剂”是指在干燥条件下能够保留某些吸附剂(例如Amberlite)的吸附能力的化合物或组合物。一般来说，可接受的稳定剂应能溶于水和乙醇(或其它润湿剂)，相对于水和乙醇不挥发，并能安全地以少量输送。稳定剂的例子包括，但不限于，甘油和低分子量PEG。“润温剂”与“稳定剂”的区别在于前者被认为能再次打开未经超交联的树脂(例如Amberlite XAD-4、Amberlite XAD-16)的吸附剂孔。润湿剂一般不能防止干燥条件下孔塌陷，然而稳定剂能够。润湿和润湿剂的一般讨论在Pall等人的US5501795中有陈述，这里引入作为参考。
短语“基本上保留了生物组合物的所需生物活性”是指基本上保留了生物组合物的性能(例如细胞完整性)。在一些实施方式中，细胞完整性反应了治疗调整中组合物的潜在性能。例如，在涉及红血球的地方，如果ATP水平、细胞外钾漏出、溶血百分率基本上保留在通过本文所述方法处理的红血球中，那么体内活性未被破坏或没有大的降低。例如，处理过的红血球的ATP水平的变化应小于约10％。处理过的红血球在贮藏之后的溶血水平应小于约1％，优选小于约0.8％。处理过的红血球的细胞外钾漏出的变化应小于约15％。在涉及血小板的地方，如果例如血小板收率、pH、集聚反应、形状变化、GMP-140、形态或低渗休克反应基本上保留在通过本文所述方法处理的血小板中，那么体内活性未被破坏或没有大的降低。例如，贮藏之后生物组合物中的血小板损失优选小于15％；在贮藏5天之后更优选为15％；甚至在贮藏5天之后更优选为10％。还应认为短语“基本上保留与所述血液制品相关的每种性能”也可以包括文献中所述本领域技术人员可接受的值，该文献包括例如Klein H.G_ed.Standards for Blood Banks andTransfusion Services，17thEd_Bethesda，MDAmericanAssociation of Blood Banks，1996，引入本文作为参考。
术语“其同等物”当其用于本发明的设备时是指功能与保留生物组合物的生物活性相当的设备。例如，含吸附剂颗粒的“同等”设备或基质是同样地保留了细胞活力或适宜凝血因子水平的一种。
术语“低分子量化合物”是指分子量范围在约100g/mol-约30000g/mol的有机或生物分子。低分子量化合物包括，但不限于，以下化合物小有机化合物如补骨脂素、吖啶或染料；猝灭剂，如谷胱甘肽；塑性可提取物，例如增塑剂；生物调节物，如活化补体，具有约100g/mol-约30000g/mol的分子量；和聚胺衍生物。
术语“适宜输注的生物组合物”是指生物组合物保留了其必要生物性能(例如血小板形态)，同时含有足够低水平的任意不需要的化合物(例如失活化合物、反应调节物)，以便输注提供想要的功能，但无有害副作用。
术语“对照”当其用于例如“相对对照”的短语中时是指进行不同条件的相对效果研究的试验。例如，在生物组合物用一种设备进行处理的地方，“未经过处理的对照”应是指在相同条件下经过处理的生物组合物，只是没有用该设备处理，或者用另一形式的设备进行处理的(例如固定的颗粒与未固定的颗粒)。
术语“4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素”还称作“S-59”。
术语“N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸”还称作“5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶”。它还被称作“S-300”。
术语“XUS-43493”还被称作“Optipore 493”。
吸附剂颗粒为了降低含细胞的生物组合物中化合物的浓度同时基本上保留生物组合物的所需生物活性，提供用于一种设备中的吸附剂颗粒。典型地，在生物组合物中所降低的这些化合物具有约100g/mol-约30000g/mol的分子量。
吸附剂颗粒可以是使其加入到惰性基质中的任意规则或不规则形状，但是优选为大致球形。这些颗粒的直径大于约100μm且小于约1500μm；优选地，这些颗粒的直径在约200μm-约1300μm之间；更优选地，这些颗粒的直径在约300μm-约900μm之间。
表面积大是这些颗粒的特征。优选地，这些颗粒具有约750m2/g-约3000m2/g的表面积。更优选地，这些颗粒具有约1000m2/g-约3000m2/g的表面积。
适宜用于本发明设备的吸附剂颗粒可以是任意适宜的物料，其限制是该物料对与之接触的生物组合物的生物活性基本上没有副作用。该吸附剂颗粒可以是，例如，由例如活性炭、疏水树脂或离子交换树脂的材料制成的。
在一个优选实施方式中，这些吸附剂树脂是由天然或合成源得到的活性炭。优选地这些活性炭得自合成源。活性炭的非限制性例子包括可从PICA USA Inc.(Columbus，OH)获得的Picatiff Medicinal_，可从Norit Americas，Inc.(Atlanta，GA)获得的Norit_ROX 0.8，可从Rohm & Haas(Philadelphia，PA)获得的Ambersorb_572和可从PICA(Columbus，OH)获得的G-277_。
在另一优选实施方式中，这些颗粒可以是疏水树脂。疏水树脂的非限制性例子包括以下聚芳香族吸附剂Amberlite_吸附剂(例如，Amberlite_XAD-2，XAD-4和XAD-16)，可从Rohm & Haas(Philadelphia，PA)获得；可从Toso Haas(TosoHass，Montgomeryville，PA)获得的Amberchrom_吸附剂；Diaion_//Sepabeads_吸附剂(例如Diaion_HP20)，可从MitsubishiChemical America，Inc.(White Plains，NY)获得；Hypersol-Macronet_吸附剂树脂(例如Hypersol-Macronet_吸附剂树脂MN-200，MN-150和MN-400)，可从Purolite(Bala Cynwyd，PA)获得；和Dowex_吸附剂(例如Dowex_XUS-40323、XUS-43493和XUS-40285)，可从Dow Chemical Company(Midland，MI)获得。
优选的颗粒是含超交联聚苯乙烯网络的聚芳香族吸附剂的疏水树脂，例如Dowex_XUS-43493(已知商业上为Optipore_L493或V493)和Purolite MN-200。
如Dowex_XUS-43493和Purolite MN-200的超交联聚苯乙烯网络为非离子大孔和大网络树脂。非离子大网络和大孔Dowex_XUS-43493对包括例如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的补骨脂素具有高的亲和力，并且它具有优良的可湿性。短语“优良的可湿性”意思是干(例如基本无水)吸附剂在为了有效地降低血液制品中小有机化合物的浓度而与血液制品接触之前不必用润湿剂(例如乙醇)润湿。
例如Dowex_XUS-43493和Purolite MN-200的超交联聚苯乙烯网络优选其形状为直径范围在约200μm-约1300μm的球形颗粒。包括例如Dowex_XUS-43493的吸附剂颗粒优选具有特别大的内表面积和相对小的孔(例如平均直径46_)。颗粒的内表面积可以在约300-约1100m2/g；优选地约900-约1100m2/g；最优选地约1100m2/g。颗粒的大部分孔可以大于25_且小于800_；优选约25_-约150_；最优选约25_-约50_。当不打算将本发明限制在进行小有机化合物的降低的机理中时，疏水相互作用被认为是吸附的主要机理。其孔性能通过使小分子进入相对大分子(例如大蛋白质)和细胞的更大比例的表面积从而选择性地授予吸附过程。Purolite_具有许多与Dowex_XUS-43493相似的特性，例如对补骨脂素高的亲和力和优良的可湿性，并且它也是最好的吸附剂颗粒。
可以按照其合成机理和物理和功能特性将聚苯乙烯分成ⅰ)传统网络和ⅱ)超交联网络。优选的吸附剂具有大的表面积，干燥时不塌陷的孔，用于包括红血球或血小板的生物组合物时不需要润湿，并具有特别少的小颗粒和外来颗粒(例如灰尘、纤维、非吸附剂颗粒和未经确认的颗粒)。此外，优选的吸附剂具有少量可提取的残余单体、交联剂和其它有机可提取物。
该传统网络主要是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，其中二乙烯基苯(DVB)用作交联剂(即，将线性聚苯乙烯链连接在一起的试剂)。这些聚合网络包括“凝胶型”聚合物。该凝胶型聚合物为通过单体共聚合获得的均匀、无孔苯乙烯-DVB共聚物。大孔吸附剂代表第二类传统网络。它们是通过在沉淀生成的聚苯乙烯链的稀释剂存在下共聚合单体获得的。通过该步骤形成的聚苯乙烯网络具有相对大的内表面积(每克聚合物高达几百平方米)；Amberlite_XAD-4是由该步骤生产的。
与上述的传统网络相比，本发明的优选吸附剂(例如Dowex_XUS-43493)为超交联网络。这些网络是通过将线性聚苯乙烯链或者以溶液或者以溶胀状态与双官能试剂交联制得的；优选的双官能试剂产生构象约束的交联桥，据信这样防止了当该吸附剂处于基本无水(即“干燥”)状态时孔塌陷。
超交联网络据信具有与传统网络相区别的三个主要特性。首先，由于这些桥使聚苯乙烯链保持分离，因此聚合物链的密度低。结果，吸附剂通常具有相对大的孔表面积和孔径。其次，这些网络能够膨胀，即，当聚合物相接触有机分子时其体积增加。最后，该超交联聚合物处于干燥状态时是“直”的；即，干燥状态网络的刚性阻止了链与链的吸引。但是，当吸附剂被润湿时这些链松弛，这增加了网络在液体介质中膨胀的能力。Davankov和Tsyurupa，Reactive Polymers1327-42(1990)；Tsyurupa等人Reactive Polymers 2569-78(1995)，本文引入作为参考。
已成功地利用几种交联剂生产聚苯乙烯链之间的桥，包括二氯代对二甲苯(XDC)、一氯二甲醚(MCDE)、1，4-二-氯甲基联苯(CMDP)、4，4′-二-(氯甲基)联苯(CMB)、二甲基甲缩醛(DMF)、p，p′-二-氯甲基-1，4-二苯基丁烷(DPB)和三-(氯甲基)-均三苯(CMM)。通过这些交联剂之一与苯乙烯苯环通过弗瑞德-克来福特反应来反应在聚苯乙烯链之间形成这些桥。因此，所得桥连接在两个不同聚苯乙烯链上出现的苯乙烯苯酚环上。参见例如US3729457，这里引入作为参考。
因为这些桥通常消除了对“润湿”剂的需要，因此这些桥是特别重要的。即，这些桥防止了当吸附剂处于基本上无水(即“干”)状态时孔塌陷，因此在吸附剂与血液制品接触之前不必用润湿剂再次打开。为了防止孔塌陷，应形成构象约束的桥。一些双官能试剂如DPB不导致一般限制的构象；例如，DPB含有对构象重排敏感的四个连续亚甲基单元。因此，DPB不是用于本发明的优选双官能试剂。
上述吸附剂颗粒的一些与结构有关的特性列于表A中。
表A
加工吸附剂颗粒可以进一步对这些吸附剂颗粒加工以除去微细颗粒、盐、潜在可提取物和内毒素。这些可提取组分的除去典型地是通过用有机溶剂、蒸汽或超临界流体处理实现的。优选地这些颗粒经过灭菌。
目前几个公司销售“净化”(即加工过的)型的可商购获得的吸附剂颗粒。除了对这些吸附剂颗粒(例如树脂)进行加工之外，这些公司试验这些吸附剂，并且最终吸附剂保证无菌(USP XXI)、无热原(LAL)并且无可检测的提取物(DVB和总有机物)。
热加工(例如蒸汽)是加工吸附剂颗粒的一种有效方法。F.Rodriguez，Principles Of Polymer Systems，(HemispherePublishing Corp.)，pp.449-53(3rd.Ed_1989)。Supelco公司(Bellefonte，PA)使用一种无溶剂、热专有过程净化Dowex_XUS-43493和Amberlite吸附剂。使用蒸汽的主要好处在于没有向吸附剂中添加任何潜在的可提取物。但是，一个大的缺陷是该过程能够从树脂珠的孔中夺走水分；一些吸附剂的有效性能需要这些珠在接触血液制品之前被再次润湿。
净化/加工过的吸附剂的一个优点是特别低水平的颗粒的直径小于30μm。对Supelco加工的吸附剂(Dowex_XUS-43493和Amberlite_XAD-16)的初步试验是测定颗粒数。这些试验的结果显示出没有外来颗粒(例如灰尘、纤维、非吸附剂颗粒和未经确认的颗粒)并且基本上没有微细颗粒(＜30μm)。
将润湿剂和稳定剂与吸附剂树脂一起使用可以使用一些方法防止颗粒干燥和吸附能力的丧失，例如Amberlite_在某些条件(例如干燥)下丧失一些吸附能力。
在一种方法中，颗粒、材料或设备可以在密闭且不能变干的润湿状态下加工。该方法伴随有几个重要缺陷。由于超过期限材料中可提取物的水平可能增加，因此这些产品的保存期限可能缩短。由于润湿聚合物典型地未经过γ-辐照，因此灭菌可能被限制在蒸汽过程。加工要求组件保持湿润状态的设备通常比加工干燥设备更困难；例如，如果设备组装和最终灭菌之间时间拖延太长，可能得考虑生物负荷和内毒素。
防止吸附能力丧失的第二种方法是使用经过干燥没有副作用的吸附剂。如上所述，具有高度交联孔结构的大网络吸附剂(例如，Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200)通常不需要润湿剂，这是因为该交联阻止了孔塌陷。不象Amberlite_XAD-16，这些大网络吸附剂当其被干燥时保留了非常高比例的起始活性。
在第三种方法中，在非挥发性润湿剂存在下通过使Amberlite_XAD-16和所涉及的吸附剂(例如，Amberlite_XAD-4)成水合物可以防止因干燥的吸附能力的丧失。例如，当使用Amberlite_XAD-16作为吸附剂时，在使用之前在操作、灭菌和贮藏过程中该吸附剂珠可以部分地干燥。当这些吸附剂的水分含量低于临界水平时，发生吸附能力的快速丧失(可能由于孔“塌陷”)；因此，为了达到最佳效果，在使用前这些孔不得不用润湿剂“再打开”。
当某些吸附剂树脂暴露在干燥条件下时，稳定剂对保持吸附能力在其最大值附近是有效的。据信使用稳定剂防止了吸附剂孔塌陷。
可接受的稳定剂应是可溶于水和乙醇，相对乙醇和水不挥发，且以少量转输安全。甘油和低分子量聚乙二醇(例如PEG-200和PEG-400)是具有这些特性的稳定剂的例子。甘油具有正的血相容性历史。在红血球制品的冷冻贮藏中经常将其添加到血液中作为防冻剂。参见例如Chaplin等人Transfusion 26341-45(1986)；Valeri等人Am.J.Vet.Res.42(9)1590-94(1981)。将含高达1％甘油的溶液按常规转输，甘油溶液可以商购获得(例如Glyerolite 57 Solution，FenwalLaboratories，Deerfield，IL)。象Amberlite_XAD-16的吸附剂珠可以在乙醇和甘油中经过稳定。
通常被用作药物基料的低分子量聚乙二醇也可被用作稳定剂。PEG为化学通式H(OCH2CH2)nOH的液态和固态聚合物，其中n大于或等于4。PEG制品通常接着相应其平均分子量的数量；例如，PEG-200的分子量为200，分子量范围为190-210。PEG可以许多制品(例如Carbowax、Poly-G和Solbase)商购获得。
用于颗粒固定的惰性基质通过惰性基质固定吸附剂颗粒。该惰性基质可以由合成或天然聚合物制备。例如，该惰性基质可以是合成或天然聚合物纤维，例如纤维网络。该惰性基质可以为烧结聚合物。该惰性基质与该设备的其它组件优选为可生物相容的，并且基本上不会因接触对物料的生物活性有副作用。
最优选地，这些合成纤维为聚酯纤维(Air QualityFiltration(AQF)，Hoechst Celanese处(Charlotte，N.C.))。合成纤维的其它优选例子是聚乙烯或聚酰胺纤维。其它例证合成纤维包括聚烯烃、聚乙烯醇和聚砜纤维。
在一个优选实施方式中，该合成聚合物纤维包括被具有低熔解温度的鞘包围的具有高熔点的第一个聚合物核心。该聚合物核心可以是聚酯(聚对苯二甲酸乙二酯)。该鞘可以是尼龙或改性聚酯。纤维可从Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira GmbH & Co.(Augsberg，Germany)商购获得。
例证的天然聚合物纤维包括得自不同来源的纤维素纤维，这些来源例如有黄麻、kozu、牛皮纸和马尼拉麻。已将合成或天然聚合物纤维的网络用于制备US4559145和5639376中所述的过滤器，本文引入作为参考。
适宜构造烧结颗粒的合成聚合物为高密度聚乙烯、超高分子量聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚四氟乙烯、尼龙6。更优选地该烧结颗粒为聚烯烃，如聚乙烯。
如上所述的聚合纤维可以是没有粘附吸附剂颗粒的吸附剂树脂。可以将这些纤维形成纤维网络或可以将其固定在更少吸附剂纤维的纤维网络上。本发明包含这些纤维；这些纤维优选含有大、多孔、吸附性的表面积或易于降低低分子量化合物浓度的其它吸附性工具。
颗粒的固定在一个实施方式中，吸附剂颗粒被惰性基质固定，从而制得用于降低物料中小有机化合物浓度的吸附介质。该惰性基质可以是含合成或天然纤维网络和固定其中的吸附剂颗粒的三维网络。
优选地，该吸附介质含有具有高度多孔结构和非常大的内表面积的小孔吸附剂颗粒，如上所述，被该惰性基质所固定。优选地，当将生物材料与吸附介质接触时，吸附介质对材料的生物活性或其它性能基本上没有副作用。
将吸附剂珠固定在纤维网络上构成空气过滤器的技术已在US5486410和US5605746中有描述，引入本文作为参考。如图1所述，纤维网络的聚合物纤维600由具有相对低熔解温度的聚合物鞘604(例如，尼龙)包围的具有较高熔点的聚合物核心602(例如，聚对苯二甲酸乙二酯(PET))组成。参见Heagle等人的US5190657，本文引入作为参考。纤维化树脂是通过在纤维网络中首先均匀分布吸附剂珠制成的。接下来，将该网络快速加热(例如，180℃×1min.)使纤维600的聚合物鞘熔融并粘附在吸附剂珠606和其它纤维上，从而形成交联的纤维网络，如图2所示。如图3和图4所述(不按比例)，一般来说，该纤维网络含有三层两个用纤维600稠密地包裹着的外层607和一个含吸附剂珠606和较少纤维600的不太稠密的内层609。在一优选实施方式中，纤维化树脂的边缘可以用聚氨酯或其它聚合物密封。或者，如图3和图4所述，可以在所得纤维化树脂中以预定间隔制备热封件608；例如，可以在纤维化树脂中以正方形图案制备热封件。之后，可以通过这些热封件将该纤维化树脂切割，从而形成含所需吸附剂珠质量(例如，优选小于5.0g并且更优选小于3.0g)并且大小适宜放置在血液制品容器内的树脂样品。这些热封件用于防止切割的纤维化树脂被磨损并且有利于固定吸附剂珠。但是，为了实践本发明不需要使用这些热封件。在一选择性实施方式中，如图4所述，没有将吸附剂珠固定在这些纤维本身上，但是仍然固定在纤维的较稠密外层607之间并带有热封件608；该实施方式也可以通过这些热封件切割之后使纤维化介质样品含一定量的吸附剂。
本发明也尝试使用粘附剂(例如，粘合剂)将吸附剂树脂固定在纤维上。而且，尽管优选将吸附剂珠化学地粘着到纤维网络上，但是也可以将这些珠物理地限制在纤维网络中；这可以通过例如用足够的纤维包围这些珠以便使这些珠处于适当位置来实现。
也尝试了可以将这些吸附剂颗粒固定在纤维网络中的其它方法。可以使用干铺法固定这些颗粒，如US5605746和5486410(AQF专利)中所述，本文将其引入作为参考。可以使用湿铺法固定这些颗粒，如US4559145和4309247中所述，本文将其引入作为参考。可以使用熔融吹制法固定这些颗粒，如US5616254中所述，本文将其引入作为参考。在使用湿铺法由天然聚合物纤维构建基质时，该惰性基质优选包括结合剂以将吸附剂珠结合到纤维上。结合剂的非限制性例子包括蜜胺、聚胺和聚酰胺。该基质典型地含1％或更少的这些结合剂。
在用吸附剂颗粒经烧结的合成聚合物颗粒构建惰性基质时，吸附剂颗粒比基质具有较高的熔解温度是很重要的。
在一优选实施方式中，将吸附剂颗粒固定在通过生物组分纤维网络的热粘合形成的纤维基质中。另一实施方式涉及将吸附剂颗粒固定在非生物组分纤维中并使用强度树脂系统、粘附剂或其它可熔纤维，从而在纤维和吸附剂颗粒之间形成粘合。有用的纤维的非限制性例子包括聚酯、尼龙和聚烯烃。(用于无纺工业的纤维的供应商已列于“AGuide to Fibers for Nonwovens，”Nonwovens Industry，June 1998，66-87.)湿强度树脂系统的例子包括蜜胺/甲醛、表氯醇基树脂、聚胺和聚酰胺。使用可热熔纤维将颗粒固定在纤维基质中已经公开。参见例如US4160059。
优选地，所得吸附介质单位面积含已知量的吸附剂。单位面积的吸附剂为约100g/m2-约500g/m2，优选地从约250g/m2-约350g/m2。这样，可以通过切割纤维化树脂的预定面积简单地测定试图用于特定目的的适当量的吸附剂(即，不用称纤维化树脂)。
该吸附介质优选生物相容(即，不产生有毒、有害或免疫反应)；对例如血液制品(例如，血小板和凝血因子)的材料的性能具有最小影响；并且不伴有有毒可提取物。吸附介质所固定的吸附剂颗粒优选具有高的机械稳定性(即，没有微细颗粒产生)。用于批量设备的吸附介质含约25-85wt％的吸附剂，优选以载荷约100-500g/m2含约50-80％的吸附剂，更优选以载荷约250-350g/m2含约50-80％的吸附剂。
包被吸附剂颗粒颗粒、基质或吸附介质的表面血相容性可以通过使用亲水聚合物包被其表面得到改善。例证的亲水聚合物包括聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(pHEMA)，它可以从例如Scientific Polymer Products，Inc.(Ontario，NY)获得，以及纤维素基聚合物，例如乙基纤维素，它可以从Dow Chemical(Midland，MI)获得。参见例如Andrade等人，Trans.Amer.Soc.Artif.Int.Organs XVII222-28(1971)。包被的其它例子包括聚乙二醇和聚氧化乙烯，也可从Scientific Polymer Products，Inc.获得。该聚合物包被可以增加血相容性并减少由于机械故障产生小颗粒的危险。
该吸附剂表面也可以用固定的肝素调节。此外，可以经过肝素吸附调节强阴离子交换聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂。肝素，一种聚阴离子，将非常牢固地吸附在具有强阴离子交换特性的吸附剂的表面上。可商购获得各种季铵调节的聚苯乙烯二乙烯基苯吸附剂。
可以使用大量不同的方法进行包被，包括如US5455040中所述的射频辉光放电聚合，本文引入作为参考和Wurster包被法(由International Processing Corp.(Winchester，KY)完成)。
在一个实施方式中，可以通过将吸附剂颗粒(通常经过气压)悬浮在一个室中以便例如pHEMA的亲水聚合物可以均匀喷射在吸附剂颗粒的整个表面上来实施该Wurster包被法。如实施例3所述，用pHEMA均匀喷射的Dowex_XUS-43493显示出血小板收率增加以及用增加量的包被对血小板形状改变产生了预料不到的效果。已发现该Wurster包被法选择性地包被吸附剂表面的外表面，对内部孔表面几乎没有影响。
在一优选实施方式中，可以将固定吸附介质浸在亲水聚合物中进行包被(参见实施例3)。该方法比用亲水聚合物喷射吸附剂颗粒更简单且成本更低。
该方法并不限制在任何特定时间内包被该吸附介质的方法。例如，在一个实施方式中，在制得吸附介质之后但在热封该吸附介质之前进行pHEMA包被。在另一实施方式中，将该吸附介质首先热封，然后进行该pHEMA包被。除了包被该吸附介质之外，将与pHEMA应用相伴的烧结过程用于除去松散颗粒和纤维。
随着包被量增加，一些小有机化合物通过包被到达颗粒表面将变得更困难，这使得吸附动力降低。因此，随着包被量增加，通常必需使用增加量的吸附剂达到与所包被的吸附剂相同的除去动力。在一个实施方式中，pHEMA包被的最佳水平是能观察到对血小板收率和体外血小板功能的保护作用的最少的包被(0.1-0.5％)。
这些包被可能对灭菌敏感。例如，γ灭菌可能导致包被交联和/或裂开。因此，灭菌的类型(E-射线束与γ辐照)和剂量可能影响所包被的吸附剂的性能。通常，优选E-射线束。
设备提供设备用于减少含细胞的生物组合物中的化合物。该设备为批量设备。批量设备的例子示于图16。批量设备已在文献中已知并描述在例如PCT申请WO96/40857，引入本文作为参考。
本发明的批量设备可以包括一种例如血袋的容器，包括含固定颗粒的吸附剂介质。在一个实施方式中，将血液制品添加到含吸附剂介质的血袋中并将该袋搅拌一定时间。
例如，在一个实施方式中，将例如固定Dowex_XUS-43493的吸附介质放置在血液制品容器(例如，PL 146塑料容器(BaxterHealthcareCorp.(Deerfield，IL))中，将该容器在血小板摇动器(HelmerLaboratories(Novesvill，IN))或者旋转装置(HelmerLaboratories(Novesvill，IN))上在室温下保持约24小时并在不同温度条件下贮藏。血液制品容器的大小可以为约600-约1200mL。贮藏温度可以为约4℃-约22℃。
可以使用方法减少可能从吸附剂介质中变松散的吸附剂颗粒的出现。
本发明涉及一种批量设备，含有保留在例如网袋/囊的容器中的固定吸附剂介质。该网/囊可以由织制、无纺或膜密封件构成。在一个实施方式中，该编织网袋可以由药用聚酯或尼龙构成。优选的实施方式是聚酯。可商购获得的膜包括，但不限于，Supor_200、800、1200亲水聚磺酸乙二酯(PES)膜(Gelman Sciences(Ann Arbor，MI))；Durapore_亲水改性的聚偏二氟乙烯(PVDF)(Mantee AmericaCorp.(San Diego，CA))和具有整体疏水出口的亲水改性的聚砜膜，例如Gemini膜(Millipore(Marborough，MA))；和具有聚偏二卤乙烯包被的含聚碳酸酯的膜(Poretics(Livermore，CA))。这些容器可以在添加吸附基质之后进行灭菌。
用于含细胞的生物组合物的优选实施方式本发明提供了降低含细胞的生物组合物中低分子量化合物的浓度的设备。这些设备包括由惰性基质固定的颗粒组成的吸附介质。
已显示如脱眉毒素C3a和末端膜攻击复合物SC5b-9的生物反应调节物是通过对全血和其组分处理(例如流血过滤白细胞、单采、回收等)和贮藏生产的。在手术和输血的不利情况中已牵涉这些生物反应调节物。
在一些实施方式中，本发明的设备降低或控制含细胞的生物组合物中活化补体的浓度。与没有用该设备处理的组合物相比，当用该设备处理该组合物时，其中活化补体的浓度被降低或控制。在一个实施方式中，该吸附设备包括例如通过AQF生产的纤维化Ambersorb IAD。在该实施方式中，将含细胞的生物组合物暴露到该设备中与对照相比使得C3a补体片段和SC5b-9末端组分复合物减少。在一个实施方式中，暴露到该设备中持续5天与对照相比使得C3a补体片段至少减少了约10％。在另一实施方式中，暴露到该设备中持续5天与对照相比使得C3a补体片段至少减少了约30％。在另一实施方式中，暴露到该设备中持续5天与对照相比使得C3a补体片段至少减少了约50％。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于降低含血小板的生物组合物中化合物的浓度的设备。在用该设备处理之后血小板的生物活性基本上得到保留。该实施方式的吸附介质包括被惰性基质固定的吸附剂颗粒。优选的颗粒为很多孔且具有大于约750m2/g的表面积。
用于本实施方式的特别优选的颗粒是含有超交联聚苯乙烯网络的聚芳香族吸附剂，例如Dowex_XUS-43493或Purolite MN-200。优选惰性基质包括合成或天然聚合物纤维。在优选实施方式中该惰性基质包括合成聚合物纤维，它包括被具有较低熔解温度的鞘包围的具有高熔点的第一个聚合物核心。该聚合物核心可以是聚对苯二甲酸乙二酯核心。该鞘可以是尼龙鞘或改性聚酯鞘。人造纤维可从Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira商购获得。
通过本实施方式的这些设备、材料和方法降低或控制的例证化合物是补骨脂素、补骨脂素衍生物、异补骨脂素、补骨脂素光化产物、吖啶、吖啶衍生物、亚甲蓝、塑性可提取物、生物反应调节物、猝灭剂和聚胺衍生物。
典型地将含血小板的生物组合物用于3天内捐赠，但可以在室温下贮藏高达7天，因此，将这些血小板组合物在整个贮藏过程中保持与吸附介质接触应是有利的。优选地，该过程应获得可接受的血小板收率(例如，损失低于10％)。本发明尝试的一种方法通过改善吸附剂表面的血相容性使得贮藏延长。
使用含由惰性基质固定的吸附剂颗粒的吸附介质允许在血小板数基本上没有损失的情况下使低分子量化合物的浓度降低。短语“基本上没有损失”是指适宜用于其想要目的例如，适宜输入人体的血小板制品，并且可以是例如在整个过程中，更优选至少5天血小板数或功能损失低于约10％，优选低于约5％。而且，在血小板数基本上没有损失的情况下，血小板可以与吸附介质接触的时间大于血小板可以单独与吸附剂颗粒接触的时间。颗粒的固定出乎意料地使接触时间延长以及血小板损失数降低。在血小板数没有大的损失例如损失约20％的情况下，典型地血小板不能与未经固定的吸附剂颗粒接触超过约20小时。相反，在血小板数基本上没有损失的情况下，可以将血小板与含被惰性基质固定的吸附剂颗粒的吸附介质接触超过20小时，例如约1-7天。
此外，与没有吸附介质超时贮藏血小板相比，存在吸附介质的情况下贮藏的血小板的体外血小板功能(例如形状改变、GMP-140、pH)得到改善。存在吸附介质的情况下贮藏的血小板可以具有大于约6-小于约7.5的pH。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于降低含红血球的室温组合物中低分子量化合物(例如小有机化合物)的浓度同时基本上保留了红血球生物活性的设备。典型地，通过该设备除去的化合物具有约100g/mol-约30000g/mol的分子量。该吸附介质含有被惰性基质固定的吸附剂颗粒。用于本实施方式的优选颗粒有很多孔且具有大于约750m2/g的表面积。
优选地，用于红血球组合物的设备是在降低低分子量化合物的浓度之后基本上保留了红血球生物活性的设备。在一个实施方式中，该红血球设备基本上没有因接触而对液体的生物活性有负面影响。该设备实施方式包括含被惰性基质固定的颗粒的吸附介质和选择性地颗粒保留设备。
在一个实施方式中，用于红血球组合物的设备中的颗粒为活性炭。优选该活性炭得自合成源。活性炭的非限制性例子包括可从PicaU.S.A.(Columbus，Ohio)获得的Picactif Medicinal；可从NoritAmericas Inc.(Atlanta，GA)获得的Norit ROX 0.8；和可从PicaU.S.A.(Columbus，OH)获得的G-277。
在一个实施方式中，该吸附剂优选为得自合成源的活性炭，如Ambersorb 572。这些Ambersorb是Rohm & Haas(Philadelphia，PA)生产的合成活化含碳(即，富含碳)吸附剂。Ambersorb通常为比典型活性炭更耐久的大的球形(300-900μm)颗粒。这些Ambersorb是通过用专用高温活化方法处理高度磺酸酯化的多孔聚苯乙烯珠合成生产的。这些吸附剂不需要预膨胀达到最佳吸附活性。
在另一实施方式中，用于含红血球组合物的设备(“红血球设备”)中的颗粒可以是疏水树脂。疏水树脂的非限制性例子包括以下聚芳香族吸附剂Amberlite_吸附剂(例如，Amberlite_XAD-2，XAD-4和XAD-16)，可从Rohm & Haas(Philadelphia，PA)获得；可从Toso Haas(TosoHass，Montgomeryville，PA)获得的Amberchrom_吸附剂；和Diaion_//Sepabeads_吸附剂(例如Diaion_HP20)，可从MitsubishiChemical America，Inc.(White Plains，NY)获得。在一个特别优选的实施方式中，这些颗粒为可从Purolite(Bala Cynwyd，PA)获得的Hypersol-Macronet_吸附剂树脂(例如Hypersol-Macronet_吸附剂树脂MN-200，MN-150和MN-400)或可从Dow Chemical Company(Midland，MI)获得的Dowex_吸附剂(例如XUS-43493和XUS-40285)。
红血球的优选惰性基质包括合成或天然聚合物纤维。在一优选实施方式中，该惰性基质包括合成聚合物纤维，它包括被具有较低熔解温度的鞘包围的具有高熔点的第一个聚合物核心。该聚合物核心可以是聚对苯二甲酸乙二酯或聚酯核心。该鞘可以是尼龙鞘或改性聚酯鞘。纤维可从Unitika(Osaka，Japan)和Hoechst Trevira(Augsberg，Germany)商购获得。
在一些实施方式中，红血球设备的吸附介质处于密封件中。在一个实施方式中，该设备包括吸附介质和容器。在另一实施方式中，包括吸附介质和容器的该设备也可以包括颗粒滞留介质。在一个实施方式中，该容器包括体积为约600ml-约1L的血袋。在另一实施方式中，该容器包括体积为约800ml-约1L的血袋。该颗粒保留介质可以包括聚酯织制、聚酯无纺或合成膜的密封件。
优选该设备在约4℃或约22℃(室温)并在搅拌下与红血球组合物接触1-35天。在一个实施方式中，该红血球组合物在约22℃下与该设备接触不超过约36小时。在另一实施方式中，该红血球组合物在约22℃下与该设备接触不超过约24小时。在另一实施方式中，该红血球组合物在约22℃下与该设备接触不超过约12小时。在另一实施方式中，该红血球组合物在约22℃下与该设备接触不超过6小时。
在一些实施方式中，在红血球组合物与该设备接触之后改变温度。在一个实施方式中，该设备在约22℃下与该红血球组合物接触约0.5-约24小时，然后贮藏在约4℃下高达约5周。在另一实施方式中，该设备在约22℃下与该红血球组合物接触约0.5-约12小时，然后贮藏在约4℃下高达约5周。在另一实施方式中，该设备在约22℃下与该红血球组合物接触约0.5-约6小时，然后贮藏在约4℃下高达约5周。
使用含被惰性基质固定的吸附剂颗粒的吸附介质在红血球功能基本上没有损失的情况下处理该红血球组合物。短语“基本上没有损失“是指应适宜输血或其想要目的的产品，并且在某些情况下可以是指溶血低于约1％；优选溶血低于约0.8％，红血球回收大于约80％；优选红血球回收大于90％，ATP浓度的变化与无设备对照红血球的差异低于约10％，并且细胞外钾浓度的变化与无设备对照红血球的差异不到约15％。在35天内，与未经固定的颗粒相比，对于IAD溶血的变化至少低10％，优选地，低20％更优选50％。最优选地，与未经固定的颗粒相比，对于IAD溶血的变化至少低90％。
可以使用标准药盒评价红血球功能。具体地，可以通过测定红血球在Drabkin试剂((Sigma Chemical Company)，St.Louis，MO)中的上层清液在540nm下的吸光度来测定溶血。使用Na+/K+分析仪(Ciba-Corning Diagnostics，Medfield，MA)可以评价钾漏出。使用标准药盒(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)可以进行总红血球样品中ATP的定量酶测定并以水背景对照测定340nm下的吸光度。
在待处理的生物组合物为含红血球的组合物的地方，该设备可以降低红血球样品中低分子量化合物的浓度。优选该设备可以降低红血球样品中吖啶衍生物和硫醇的浓度。更优选该设备可以降低红血球样品中5-[(β-乙酯基乙基)氨基]-吖啶和谷胱甘肽的浓度。可以使用HPLC试验测定与该设备接触的红血球中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和谷胱甘肽的浓度。试验流动相为HPLC水中的10mM H3PO4和乙腈中的10mMH3PO4。Zorbax SB-CN和YMC ODSAM-303柱可从MacMod Analytical，Inc.(Chadds Ford，PA)和YMC，Inc.(Wilmingtion，N.C.)获得。
在有搅拌下设备与含细胞的生物组合物接触的地方，可以连续或间歇该搅拌。通过保留细胞功能度的任意适宜装置提供该搅拌，包括以下类型的机械搅拌器往复、轨道、三维旋转装置和旋转装置型搅拌器。在一个实施方式中，通过轨道搅拌器提供该搅拌并且是连续的。在另一实施方式中，通过轨道搅拌器提供该搅拌并且是间歇的。在另一实施方式中，通过往复搅拌器提供该搅拌。
应用本发明尝试降低含细胞的生物组合物中低分子量化合物的浓度。这些化合物包括，例如，如光活化产物的补骨脂素失活试剂、氨基吖啶、有机染料和吩噻嗪。例证的补骨脂素失活试剂包括呋香豆素，例如补骨脂素和吖啶。接着如US5459030和5559250(引入本文作为参考)所述用补骨脂素失活化合物处理血液制品，可以通过将处理过的血液制品与本发明的设备接触降低血液制品中补骨脂素失活化合物的浓度。
在一个实施方式中，本发明尝试一种失活溶液中补骨脂素的方法，其中该方法包括a)依次提供ⅰ)环化合物，ⅱ)用所述补骨脂素污染的悬浮液，和ⅲ)纤维化树脂；b)用所述环化合物处理所述溶液，以便产生其中所述补骨脂素失活的处理过的溶液产物；和c)将所述处理过的溶液产物与所述纤维化树脂接触，并进一步包括用于降低血液制品中小有机化合物的浓度同时基本上保留了血液制品的所需生物活性的设备，该设备包括很多孔的吸附剂颗粒，其中这些吸附剂颗粒被惰性基质固定。
除了补骨脂素失活化合物之外，例如在输血之前可以从例如血液制品的材料中减少其反应降解产物。
可以将本文所公开的材料和设备用于分离性输血方法中。可以将全血分成两种或多种特定组分(例如，红血球、血浆和血小板)。术语“分离性输血”广义上是指将血液从供体中取出并分成不同组分，收集并保留感兴趣的组分并将其它组分返回给供体的过程。在再输血过程中该供体接受替换液体以帮助弥补由于组分移去造成的体积和压力损失。分离性输血系统在PCT公开WO96/40857中有描述，本文引入作为参考。
低分子量化合物本发明的设备降低含细胞的组合物中低分子量化合物的浓度。术语“低分子量化合物”是指分子量在约100g/mol-约30000g/mol的有机或生物分子。低分子量化合物包括，但不限于，以下化合物小有机化合物如补骨脂素、吖啶或染料；如谷胱甘肽的猝灭剂；如增塑剂的塑性可提取物；如活化补体的生物调节物，它具有约100g/mol-约30000g/mol的分子量；和聚胺衍生物。
小有机化合物不同组的小有机化合物可以被本发明的设备所吸附。这些分子可以是环状或非环族。在一个实施方式中，这些化合物优选为例如补骨脂素、吖啶或染料的环状化合物。在另一实施方式中，这些化合物为硫醇。
环状化合物的非限制性例子包括放线菌素、蒽环酮、丝裂霉素、安曲霉素和有机染料和光反应化合物如苯并二吡喃酮、芴、芴酮、呋香豆素、卟啉、原卟啉、红紫素、酞菁染料、金丝桃素、Monostral FastBlue、Norphillin A、菲啶、phenazathionium salt、吩嗪、吩噻嗪、叠氮基苯、喹啉和噻吨酮。优选这些化合物为呋香豆素。
呋香豆素的非限制性例子包括补骨脂素和补骨脂素衍生物。特别注意的是4′-氨甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、卤代补骨脂素、异补骨脂素与季铵、糖或其它核酸结合基团相连的补骨脂素。还注意到以下补骨脂素5′-溴甲基-4，4′，8-三甲基补骨脂素、4′-溴甲基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(4-氨基-2-氮杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(2-氨乙基)-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(5-氨基-2-氧杂)戊基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(5-氨基-2-氮杂)戊基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(6-氨基-2-氮杂)己基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(7-氨基-2，5-氧杂)庚基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(12-氨基-8-氮杂-2，5-二氧杂)十二烷基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(13-氨基-2-氮杂-6，11-二氧杂)十三烷基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(7-氨基-2-氮杂)庚基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(7-氨基-2-氮杂-5-氧杂)庚基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(9-氨基-2，6-二氮杂)壬基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(8-氨基-5-氮杂-2-氧杂)辛基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(9-氨基-5-氮杂-2-氧杂)壬基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、4′-(14-氨基-2，6，11-三氮杂)十四烷基-4，5′，8-三甲基补骨脂素、5′-(4-氨基-2-氮杂)丁基-4，4′，8-三甲基补骨脂素、5′-(6-氨基-2-氮杂)己基-4，4′，8-三甲基补骨脂素和5′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，4′，8-三甲基补骨脂素。优选该补骨脂素为4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。
吖啶吖啶的非限制性例子包括吖啶橙、吖啶黄、奎纳克林、N1，N1-二(2-羟乙基)-N4-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)-1，4-戊二胺、9-(3-羟丙基)氨基吖啶、N-(9-吖啶基)甘氨酸、S-(9-吖啶基)-谷胱甘肽。在一个优选实施方式中该吖啶为N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸，或者称为5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
染料染料的非限制性例子包括例如亚甲蓝、中性红、甲苯胺蓝、结晶紫和天蓝A的吩噻嗪；如亚甲紫Bernthsen的吩噻嗪酮；如1，8，15，22-四苯氧基-29H，31H-酞菁氯化铝和硅石类似物的酞菁染料；以及金丝桃素。优选该染料为亚甲蓝或甲苯胺蓝。更优选该染料为亚甲蓝。
术语“噻嗪染料”包括在一个或多个环中含有硫原子的染料。最常见的噻嗪染料是亚甲蓝[氯化3，7-二(二甲基氨基)-吩噻嗪-5-鎓]。其它噻嗪染料包括，但不限于，天蓝A、天蓝C和劳思氏紫，如Schinazi的US5571666所述。
术语“呫吨染料”是指为化合物呫吨衍生物的染料。可以将这些呫吨染料分入三个主要分类之一ⅰ)芴或氨基呫吨、ⅱ)对甲氨基酚或氨基羟基呫吨和ⅲ)芴酮羟基呫吨。尝试用于本发明的呫吨染料的例子包括玫瑰红和曙红Y；如Schinazi的US5571666所述，这些染料可以从许多源(例如，Sigma Chemical Co_St.Louis，MI)商购获得，本文引入作为参考。
猝灭剂可以降低各种化合物的浓度。其它例证化合物包括猝灭化合物。猝灭方法不希望包括含有或能够形成的官能团、亲电子基团的补骨脂素失活化合物的副反应，如1998年1月6日申请的摘要号28217300600的共有美国专利申请“Methods for Quenching Pathogen Inactivatorsin Biological Systems”，将其公开的内容引入本文。在本方法中，用补骨脂素失活化合物和猝灭剂处理如血液制品的材料，其中该猝灭剂包括能够共价地与亲电子基团反应的亲核官能团。在一个实施方式中，该补骨脂素失活化合物包括连接配体和例如芥子基团的官能团的核酸，它能够就地反应形成亲电子基团。猝灭剂的例子包括，但不限于，含亲核基团的化合物。例证的亲核基团包括硫醇、硫羰酸、二硫碳酸、硫代氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、胺、磷酸酯和硫代磷酸酯基团。该猝灭剂可以是或含，例如吡啶的氮杂环。该猝灭剂可以是含例如葡萄糖-6-磷酸酯的化合物的磷酸酯。该猝灭剂也可以是含以下化合物(但不限于)的硫醇谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、氢硫基乙醇、二巯基丙醇、硫醇、氢硫基乙基磺酸和其盐，例如，MESNA、高半胱氨酸、氨乙基硫醇、二甲氨基乙基硫醇、二硫苏糖醇和其它含硫醇的化合物。例证的芳香族硫醇化合物包括2-巯基苯并咪唑磺酸、2-巯基烟酸、萘烯硫醇、喹啉硫醇、4-硝基-苯硫酚和苯硫酚。其它猝灭剂包括硝基苄基吡啶和无机亲核试剂如硒化物盐或有机硒化物、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、硫代磷酸盐、焦磷酸盐、氢硫化物和二硫代亚硝酸盐。该猝灭剂可以是含亲核基团的肽化合物。例如，该猝灭剂可以是含半胱氨酸的化合物，例如，如GlyCys的二肽或如谷胱甘肽的三肽。
可以通过本发明的设备除去的化合物可以包括硫醇如氢硫基醋酸甲酯、硫乳酸、苯硫酚、2-巯基吡啶、3-巯基-2-丁醇、2-巯基苯并噻唑、硫代水杨酸和硫辛酸。
塑性可提取物来自用于装生物组合物的塑料贮藏容器和管中的可提取物的一组低分子量化合物的浓度也可以使用本发明的设备从生物组合物中降低。可提取物的例子包括，但不限于，增塑剂、残余单体、低分子量低聚物、抗氧化剂和润滑剂。参见例如R.Carmen，TransfusionMedicine Reviews 7(1)1-10(1993)。塑性组分通过蒸汽、γ射线或电子束的灭菌可以产生氧化反应和/或聚合物裂开，导致形成其它类型的可提取物。
增塑剂常被用于提高塑料的性能如可加工性和透气性。在血液贮藏容器中发现的最常见增塑剂是用于PVC制品中的邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯。DEHP已被确定为潜在致癌物。已开发出其它增塑剂，包括，但不限于，以下化合物1，2，4-苯三酸三(2-乙基己)酯(TEHTM)、乙酰柠檬酸三正己酯(ATHC)、丁酰柠檬酸三正己酯(BTHC)和邻苯二甲酸二正癸酯。
可以将本发明的设备用于降低或控制各种环境中的生物组合物中的塑性可提取物的浓度。这些环境包括，但不限于，以下血液处理；血液贮藏；以及例如血液透析和体外膜氧化的体外应用。
生物反应调节物(BRMs)一组广义上称之为生物反应调节物(BRMs)的低分子量化合物的浓度也可以使用本发明的设备从生物组合物中降低和控制。BRMs是指“改变免疫反应的光谱分子”。Illustrated Dictionary of Immunology，J.M.Cruse and R.E.Lewis。一般的BRMs组包括，但不限于例如组胺和血清素的小分子；例如凝血噁烷、前列腺素、白三烯和花生四烯酸的脂类；例如缓激肽的小肽；含其它基团的更大多肽，包括活化补体片段(C3a，C5a)；例如IL-1、IL-6和IL-8的细胞因子；以及例如RANTES和MIP的趋化因子。
在贮藏过程中血液制品中BRMs的集聚可能对生物组合物的所需生物活性有副作用。例如已证实在标准血库条件下贮藏血小板的过程中发生补体活化。补体活化伴随着称之为“血小板贮藏损害”血小板功能和活力的的丧失。参见例如V.D.Mietic and O.Popovic，Transfusion 32(2)150-154(1993)。在所贮藏的血液制品中BRMs的集聚也可能对例如接受该血液制品的患者有副作用在贮藏过程中在血小板浓缩物中BRMs的集聚在接受血小板的患者中伴随有非溶血性发热输血反应。参见例如N.M.Heddle，Current Opinions inHematology 2(6)478-483(1995)。
聚胺衍生物一组已知为聚胺衍生物的低分子量化合物的浓度例如也可以使用本发明的设备从生物组合物中降低。聚胺衍生物为在碳主链中含多个氮原子的化合物。
聚乙二醇其它例证化合物包括活化聚乙二醇(aPEG)，可以将其用于改变细胞或材料的表面以便分别提供免疫掩蔽性能或稳定蛋白结合。可以将该设备用于降低过量的活化聚乙二醇或PEG的未反应衍生物，从而使活化PEG与水或例如磷酸盐、磷酸酯或如谷胱甘肽的硫醇的小亲核试剂反应。可以被除去的其它化合物包括活化PEG制品中的杂质，它可以影响血液制品的功能或使它们不适宜输血(例如有毒化合物)。最后，也可以将例如aPEG与细胞表面亲核试剂反应过程中释放的N-羟基琥珀酰亚胺的小分子降低。
可以通过本发明的设备除去的化合物的例子包括粘附在活性分子上的线性或支链聚乙二醇，这些活性分子包括氰尿酰氯、琥珀酰亚氨基酯、氧化碳酰咪唑衍生物、碳酸硝基苯酯衍生物、缩水甘油醚衍生物和醛。
应理解为本发明并不局限在所示和所述的这些精确的详细操作或精确化合物、组合物、方法或步骤中，各种改变和等价物对本领域技术人员应是显而易见的。由上述内容可知，应清楚地指出这些方法和设备可以与分离性输血系统和目前用于加工输血用血液制品的其它设备和步骤混合。
实施例下面的实施例用于说明本发明的某些优选实施方式和特征，但不构成对其范围的限制。
在以下的实验说明中，使用以下缩写eq(等价物)；M(容积克分子)；μM(容积微克分子)；N(当量)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；Kg(千克)；L(升)；mL(毫升)；μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；min.(分钟)；s和sec.(秒)；J(焦耳，或瓦特.秒)；℃(摄氏度)；TLC(薄层色谱)；HPLC(高压液相色谱)；pHEMA和p(HEMA)(聚[甲基丙烯酸2-羟乙酯])；PC(s)(血小板浓缩物)；PT(凝血酶原时间)；aPTT(活化部分凝血酶原时间)；TT(凝血酶时间)；HSR(低渗休克反应)；FDA(美国食品和药品管理局)；GMP(良好生产实践)；DMF(药物主文件)；SPE(固相提取)；Aldrich(Milwaukee,WI)；Asahi(Asahi Medical Co_Ltd_Tokyo,Japan)；Baker(J.T.Baker,Inc_Phillipsburg,NJ)；Barnstead(Barnstead/Thermolyne Corp_Dubuque,IA)；BectonDickinson(Becton Dickinson Microbiology Systems；Cockeysville,MD)；Bio-Rad(Bio-Rad Laboratories,Hercules，CA)；Cerus(CerusCorporation；Concord,CA)；Chrono-log(Chrono-Log Corp.；Havertown，PA)；Ciba-Corning(Ciba-Corning Diagnostics Corp.；Oberlin，OH)；Consolidated Plastics(Consolidated Plastics Co_Twinsburg,OH)；Dow(Dow Chemical Co.；Midland,MI)；Eppendorf(Eppendorf North America Inc_Madison,WI)；Gelman(GelmanSciences,Ann Arbor,MI)；Grace Davison(W.R.Grace & Co_Baltimore,MD)；Helmer(Helmer Labs,Noblesville,IN)；HoechstCelanese(Hoechst Celanese Corp_Charlotte,NC)；InternationalProcesslng Corp.(Winchester,KY)；Millipore(Milford,MA)；NIS(Nicolet,a Thermo Spectra Co_San Diego,CA)；Poretics(Livermore,CA)；Purolite(Bala Cynwyd,PA)；Rohm and Haas(Chauny,France)；Quidel(San Diego,CA)；Saati(Stamford,CT)；Scientific Polymer Products(Ontario,NY)；Sigma(Sigma ChemicalCompany,St.Louis,MO)；Spectrum(Spectrum Chemical Mfg.Corp_Gardenia,CA)；Sterigenics(Corona,CA)；Tetko,Inc.(Depew,NY)；TosoHaas(TosoHass,Montgomeryville,PA)；Wallac(Wallac Inc_Gaithersburg,MD)；West Vaco(Luke,W.Va)；YMC(YMC Inc_Wilmington,NC)；DVB(二乙烯基苯)；LAL(Limulus AmoebocyteLystate)；USP(美国药典)；EAA(乙酰乙酸乙酯)；EtOH(乙醇)；HOAc(乙酸)；W(瓦特)；mW(毫瓦)；NMR(核磁共振；在室温下在Varian Gemini200 MHz Fourier Transform Spectrometer上获得的光谱)；ft3/min(每分钟立方英寸)；m.p.(熔点)；g/min和gpm(每分钟加仑)；UV(紫外线)；THF(四氢呋喃)；DMEM(Dulbecco′s改良的Eagles培养基)；FBS(胎牛血清)；LB(Luria Broth)；EDTA(乙二胺四乙酸)；Phorbol MyristateAcetate(PMA)；磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)；AAMI(药学仪器改进协会)；ISO(国际标准组织)；EU(内毒素单元)；LVI(可大量注射物)；GC(气相色谱)；M(兆)；kGy(1000格雷=0.1兆拉德)；MΩ(兆欧姆)；PASⅢ(血小板补充溶液Ⅲ)；dH2O(蒸馏水)；IAD(固定吸附设备)；SCD(无菌连接设备)。
以下实施例之一提到HEPES缓冲液。该缓冲液含8.0g的137mMNaCl、0.2g的2.7mM KCl、0.203g的1mM MgCl2(6H2O)、1.0g的5.6mM葡萄糖、1.0g的1mg/ml牛血清白蛋白(可从Sigma，St.Louis，MO获得)和4.8g的20mM HEPES(可从Sigma，St.Louis，MO获得)。
实施例1具有Amberlite_XAD-16的纤维化树脂该实施例是利用纤维化树脂和含未经固定的吸附剂珠的设备比较从血小板中除去氨基补骨脂素的动力学和血小板功能和形态。更具体地说，将含固定化Amberlite_XAD-16的纤维化树脂与含自由(即未经固定的)Amberlite_XAD-16 HP和Dowex_XUS-43493的设备相比较。
制备纤维化树脂和吸附剂珠由AQF获得干净且水合状态的含Amberlite_XAD-16的固定化吸附剂介质(Rohm and Haas)。这些Hoechst Celanese纤维网络的纤维是由聚对苯二甲酸乙二酯核心和尼龙鞘组成的，该鞘的熔解温度比该核心的低。该纤维化树脂的制备如下首先将这些吸附剂珠均匀分布在纤维网络中。接下来，将该纤维网络快速加热使纤维的聚合物鞘熔融并粘附到吸附剂珠和其它纤维上，从而形成交联的纤维网络。所形成的纤维化树脂含载荷为130g/m2(即，每平方米纤维含130g吸附剂珠)的Amberlite_XAD-16。
将该纤维化树脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含约2.5g的干Amberlite_XAD-16。然后通过将该纤维化树脂浸泡在30％乙醇中约10分钟将该Amberlite_XAD-16珠预润湿。润湿Amberlite_XAD-16的其它方法和其它吸附剂也是有效的并且被本发明所包含。应说明的是含其它类型珠的纤维化树脂(例如，经桥接或超交联的树脂如Dowex_XUS-43493)不需要用于有效除去补骨脂素的润湿步骤。
也可以直接从Rohm and Haas获得干净且水合状态的Amberlite_XAD-16 HP(高纯度)珠。在加入网袋之前对松散(即未经固定的)Amberlite_XAD-16 HP珠不需要预润温；但是，校正吸附剂的量以计算出珠的水分含量(2.5g干剂=6.8g带有62.8％的水分)。从Dow获得Dowex_XUS-43493珠，该干燥珠不需润湿并且不需要用水校正该珠的质量。然后将聚酯网袋(7cm×7cm正方形；30μm开口)用2.5g(干重)的松散Amberlite_XAD-16 HP或Dowex_XUS-43493珠填充。
含纤维化树脂和吸附剂的袋通过高压灭菌法在121℃下“湿”循环45分钟灭菌。之后，将含纤维化树脂和吸附剂的袋插入单独灭菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中。插入之后，在层流通风橱中使用无菌剪刀、止血钳子和脉冲封闭器将PL 2410塑料容器热封。
纤维化树脂和吸附剂珠与含补骨脂素的血小板浓缩物(PC)接触将2-3个单元的单供体单采血小板混合在35％自体血浆/65％血小板补充溶液(即合成介质)中制成血小板浓缩物库。向该溶液中添加氨基补骨脂素4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素(S-59)，其量实现150μM4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的最终浓度。将所得PC溶液分成300mL单元，然后将这些单元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，将经过处理的PCs转移到含带Amberlite_XAD-16、松散Amberlite_XAD-16 HP或松散Dowex_XUS-43493的纤维化树脂的固定化PL 2410塑料容器中，或者转移到空PL 2410塑料容器中作对照。然后将该PL 2410塑料容器(Baxter)放在22℃下的Helmer血小板恒温箱中并以约70转/分钟搅拌。
在首先的8个小时的贮藏中每隔1小时移出每一PC样品，通过HPLC分析残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。用含三甲基补骨脂素(TMP)的样品稀释剂(最终浓度=35％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)作为内标准将每种样品稀释5倍。通过在4℃下将这些样品培养30分钟，蛋白质和其它大分子沉淀。然后将这些样品离心分离且将上层清液过滤(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM 4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从65％溶剂A(25mM KH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的线性梯度进行分析。
通过在Baker System 9118 CP(Baker Instrument Co.；Allentown，PA)计数血小板每天监测用纤维化树脂或一种松散珠的5-天贮藏期间的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer评价血内气体和pH。使用用于形态、形状变化、低渗休克反应、聚集和GMP-140(p-选择蛋白)表达的试验评价与纤维化树脂或含自由吸附剂的设备接触5天后的体外血小板功能。形状变化、聚集和低渗休克反应是使用Lumi-Aggregometer(Chrono-Log)评价的，同时GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer(BectonDickinson)通过流式细胞术测定的。
补骨脂素的除去和血小板收率和功能图5比较了用XUS-43493、XAD-16 HP和含XAD-16的纤维化树脂从于35％血浆/65％合成介质(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学。具体地，实线连接的圆圈所示的数据代表含未经固定的吸附剂XUS-43493(2.5g珠；＜5％水分)的设备；虚线连接的三角形所示的数据代表含未经固定的XAD-16HP(6.8g珠；62.8％水分)的设备；并且虚线连接的正方形所示的数据代表纤维化树脂(带有在30％乙醇中的XAD-16湿珠的Hoechst纤维；14cm×14cm)。如图5中数据所示，含未经固定的吸附剂的设备和含纤维化树脂的设备的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学都是可比的。因此，纤维化处理对除去动力学没有明显的大的影响。
此外，研究了与松散珠相比较的纤维化树脂的血小板收率和功能。具体地说，该研究的试验使用了ⅰ)6.8g XAD-16 HP(62.8％水分)；ⅱ)在30％乙醇中的14cm×14cm温的纤维化XAD-16(130g树脂/cm2)；和ⅲ)2.5g XUS-43493(＜5％水分)。XAD-16 HP和纤维化树脂样品制备了双份血小板单元，但XUS-43493仅制得单份血小板单元。结果列于表1中。
如表1所示，与5天对照相比，含未经固定的珠(XAD-16 HP和XUS-43493)的样品的5天的pH和pO2值稍微上升。用纤维化树脂的试验具有相对对照更可比的pH和pO2。血小板数显示用纤维化介质和含未经固定的吸附剂的设备的对照接触5天之后血小板损失9-22％。如表1所列的，纤维化树脂具有更好的收率(5天损失9％)，并且与含未经固定的XAD-16的设备或XUS-43493吸附剂颗粒相比时所有体外评价呈现更好。
表1
尽管为了实现本发明不需要明白用含未经固定的XUS-43493和XAD-16 HP的设备观察到的pH和pO2更高的机理，但是较高值据信是由含未经固定的吸附剂存在下血小板代谢稍微降低所至。比较起来，相对对照，纤维化介质一致地比XUS-43493或XAD-16珠具有更可比的5天pH和pO2值。
相对于XUS-43493或XAD-16 HP吸附剂珠，纤维化介质也有较好的5天血小板收率。在几种情况下观察到XUS-43493介质观察的损失为22-28％。但是，应注意到用含具有XUS-43493的未经固定的吸附剂的设备的目前优选实施方式涉及8小时暴露之后从该设备转移这些血小板；该过程导致＜5％的血小板损失。
表1中所示的数据说明了纤维化介质相对含未经固定的吸附剂的设备具有更高的血小板收率。令人吃惊的是，该纤维化介质还获得通过pH/pO2、形状变化、聚集、形态和GMP-140所示的更好的5天的血小板功能。尽管为了实现本发明不需要理解该纤维化介质的增强性能的原理，但是可以提出几种假设。首先，粘附在吸附剂珠表面上的这些纤维可以阻止血小板和珠表面之间的相互作用。其次，将这些珠固定可以防止相互作用并消除对血小板有害的机械影响。第三，将这些珠固定可以增强流体在珠表面的剪切，因此减少了血小板和珠表面之间的相互作用；比较起来，未经固定的珠与流体自由流动使得流体相对珠的表面的流动降低。
血小板损失当复查上述数据时，看出一次研究与下一次研究之间的血小板损失存在一些可变性。但是，在最初血小板数较高的研究中以5天对照计数的百分率表示的血小板损失较小。进行研究是为了证实血小板损失的数量对给定的血小板粘着可利用的材料面积是否是恒定的。关于该研究，将两个血小板单元合并并将该合并物分成两个样品。一个样品用35％自体血浆/65％合成介质(PAS)稀释一倍，以便该血小板数为另一单元的一半。将这些血小板混合物用4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素+UVA处理并在前面讨论的标准血小板贮藏条件下与含未经固定的吸附剂(2.5g XUS-43493)的设备接触5天。
尽管按百分率计算的损失的差异很大，但是两个单元中损失的血小板总数事实上是相同的。因此，这些结果说明了在一段时间后总的血小板损失基本上是恒定的；即，尽管血小板损失的百分率随最初血小板数而变化，但是当达到平衡时血小板损失的总数几乎是恒定的。基于该实施例中提出的结果，纤维化树脂对体外血小板功能没有副作用。
实施例2具有活性炭的纤维化树脂该实施例是对含Amberlite_XAD-16的纤维化树脂和含经过固定的活性炭的纤维化树脂比较从血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的动力学和血小板功能和形态。
制备纤维化树脂Hoechst Celanese制备含Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)的纤维化树脂。含Amberlite_XAD-16的该纤维化树脂是如前面实施例中所述制备的，包括30％乙醇润湿步骤。Hoechst Celanese还制备了以载荷375g/m2(AQF-375-B)和500g/m2(AQF-500-B)含经过固定的活性炭(WestVaco)的纤维化树脂。#在一优选实施方式中，该吸附剂颗粒为合成活性炭，包括例如，Ambersorb和A-Supra。由于合成活性炭能够除去大量从经过固定的吸附介质上脱落的微粒物，因此它们为优选。该纤维化树脂是以与用于含Amberlite_XAD-16的纤维化树脂相似的方法制备的。每种纤维化树脂的纤维组成相同。
将该纤维化树脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含约2.5g的干Amberlite_XAD-16。接下来，将该纤维化树脂通过高压灭菌法在121℃下“湿”循环45分钟灭菌。之后，将该纤维化树脂插入单独灭菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并在层流通风橱中使用无菌剪刀、止血钳子和脉冲封闭器将该容器热封。
纤维化树脂与含补骨脂素的PC接触将2-3个单元的单供体单采血小板混合在35％自体血浆/65％合成介质(PASⅢ)中制成血小板浓缩物库。添加4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，其量实现150μM 4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的最终浓度。将所得PC溶液分成300mL单元，并将这些单元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，将经过处理的PCs转移到含带XAD-16、AQF-375-B、AQF-500-B的纤维化树脂的PL 2410塑料容器中，或者转移到空PL 2410塑料容器中作对照。然后将该PL 2410塑料容器放在22℃下的Helmer血小板恒温箱中并以约70转/分钟搅拌。
按照前面实施例中的进行，在首先的8个小时的贮藏中每隔1小时移出每一PC样品，通过HPLC分析残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。用含三甲基补骨脂素(TMP)的样品稀释剂(最终浓度=35％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)作为内标准将每种PC样品稀释5倍。通过在4℃下将这些样品培养30分钟，蛋白质和其它大分子沉淀。然后将这些样品离心分离且将上层清液过滤(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM 4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从65％溶剂A(25mM KH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的线性梯度进行分析。
通过在Baker System 9118 CP上计数血小板每天监测用纤维化树脂或含未经固定的吸附剂的设备的5-天贮藏期间的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer评价血内气体和pH。使用用于形态、形状变化、低渗休克反应、聚集和GMP-140(p-选择蛋白)表达的试验评价与纤维化树脂或含未经固定的吸附剂的设备接触5天后的体外血小板功能。形状变化、聚集和低渗休克反应是使用Chrono-Log Lumi-Aggregometer评价的，同时GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer通过流式细胞术测定的。
补骨脂素的除去和血小板收率和功能图6比较了用含XAD-16的纤维化树脂和具有两种不同活性炭载荷的纤维化树脂从于35％血浆/65％合成介质(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学。具体地，圆圈所示的数据代表使用纤维化XAD-16珠的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的除去；正方形所示的数据代表使用纤维化AQF-500-B的除去；并且三角形所示的数据代表使用纤维化AQF-375-B的除去。如图6中数据所示，不同纤维化树脂的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学都是可比的，并且该纤维化树脂都显示出非常好的除去动力学(4小时之后≤0.5μM的残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素)。
还评价了每种纤维化树脂的血小板收率和体外血小板数据列于表2中。
表2 参照表2，炭基纤维化树脂提供了损失小于10％的良好血小板收率；正如前面实施例的研究，含XAD-16的纤维化树脂具有稍高的血小板损失(约17％)。至于pO2，炭纤维化树脂的5天值与对照可比较。尽管为了实现本发明不需要明白炭纤维化树脂为什么具有稍高的pH值，但是它可能是从生物曝气法中由残余可提取物(例如磷酸盐)人为造成的；带有炭基纤维化树脂的PC贮藏8小时之后观察到pH(pH=7.3-7.4)快速上升支持了该观点。使用伴随有非常少可提取物的USP炭可以消除观察到的pH最初升高。
碳基纤维化树脂在形状变化和聚集试验上都提供了良好结果。尽管AQF-500-B纤维化树脂所至的形状变化好于对照的，但是与AQF-500-B相伴的血小板呈现出稍差的聚集试验。
实施例3pHEMA包被对吸附剂血相容性的影响该实施例是对用pHEMA包被的Dowex_XUS-43493和含Amberlite_XAD-16的纤维化树脂比较从血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的动力学和血小板功能和形态。
制备pHEMA包被的吸附剂珠和纤维化树脂含约50wt％水的Dowex_XUS-43493(商业上称之为Optipore_L493)是从Dow获得的，并且具有300kD的粘度平均分子量的聚合HEMA是从Scientific Polymer Products获得的。在包被之前，将这些吸附剂珠干燥到水分含量＜5％。通过将该聚合物溶解在95％变性醇/5％水中以使pHEMA浓度达到50mg/ml，从而制备pHEMA的储备溶液。
由International Processing Corp.在具有载荷为约4kg(干)吸附剂的9-英寸Wurster流化床包被器中进行该包被过程。该包被过程涉及60-70g/min的pHEMA流速、50℃的入口温度和约200ft3/min的空气流速。在包被过程中移出50g的包被吸附剂样品，以便获得3-18％(w/w)pHEMA的包被水平；将用3.7％、7.3％和10.9％pHEMA(w/w)包被的吸附剂珠用于下述研究中。
含未经固定的干(未经过包被的)Dowex_XUS-43493(2.5g)和用pHEMA包被的Dowex_XUS-43493(3.0g或5.0g)的设备是通过将所需质量的吸附剂放入正方形30μm聚酯网袋(7cm×7cm)中制成的。将填充吸附剂的袋插入单独灭菌的1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并用脉冲封闭器热封。之后，含有填充吸附剂的袋的PL-2410塑料容器通过电子束或γ射线(SteriGenics)到2.5MRad灭菌；如上所述，通常优选电子束灭菌。
根据实施例1中所述的方法，Hoechst Celanese制备含Amberlite_XAD-16的纤维化树脂。将该纤维化树脂切成正方形(14cm×14cm)，所得片段含约2.5g的干Amberlite_XAD-16。将该纤维化树脂的Amberlite_XAD-16通过浸泡在含50mg/mL pHEMA的95％乙醇/5％蒸馏水的溶液中同时润温和包被。在10分钟内在生理盐水中冲洗两次除去残余乙醇。该过程获得约6％(w/w)pHEMA的包被。然后将该纤维化树脂通过高压灭菌法在121℃下“湿”循环45分钟灭菌。之后，将该纤维化树脂插入单独灭菌、1-升PL 2410塑料容器(Baxter)中，并在层流通风橱中使用无菌剪刀、止血钳子和脉冲封闭器热封。
pHEMA包被的吸附剂珠和纤维化树脂与含补骨脂素的PC接触将单供体单采血小板单元混合在35％自体血浆/65％合成介质(PASⅢ)中制成血小板浓缩物库。添加4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素，其量实现150μM 4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的最终浓度。然后将所得PC溶液分成300mL单元，并将这些单元放在PL 2410塑料容器(Baxter)中并用3J/cm2的UVA照射。照射之后，将经过处理的PCs转移到含以下所得片段所示的设备的PL2410塑料容器中。也制备没有吸附设备的对照样品。然后将这些PL2410塑料容器放在22℃下的Helmer血小板恒温箱中并以约70转/分钟搅拌。
在首先的8个小时的贮藏中每隔1小时移出每一PC样品，通过HPLC分析残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。用含三甲基补骨脂素(TMP)的样品稀释剂(最终浓度=35％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)作为内标准将每种PC样品稀释5倍。通过在4℃下将这些样品培养30分钟，蛋白质和其它大分子沉淀。然后将这些样品离心分离且将上层清液过滤(0.2微米)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从65％溶剂A(25mMKH2PO4，pH=3.5)，35％B(甲醇)到80％B的线性梯度进行分析。
通过在Baker System 9118 CP上计数血小板测定用纤维化树脂或含未经固定的吸附剂的设备的5-天贮藏期间之后的血小板收率。使用Ciba-Corning 238 pH/Blood Gas Analyzer评价血内气体和pH。使用用于形态、形状变化、低渗休克反应、聚集和GMP-140(p-选择蛋白)表达的试验评价与纤维化树脂或含未经固定的吸附剂的对照设备接触5天之后的体外血小板功能。形状变化、聚集和低渗休克反应是使用Chrono-Log Lumi-Aggregometer评价的，同时GMP-140是使用Becton-Dickinson FACScan Fluorescence Analyzer通过流式细胞术测定的。
pHEMA包被对补骨脂素的除去的影响图7比较了用经pHEMA包被的和未经包被的Dowex_XUS-43493珠从于35％血浆/65％合成介质(PASⅢ)的血小板中除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学。具体地，用3.0g用3.7％(w/w)pHEMA包被的Dowex_XUS-43493除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素是用圆圈表示的，用7.3％(w/w)pHEMA包被的是用三角形表示的，并且用10.9％(w/w)pHEMA包被的是用菱形表示的；正方形代表用2.5g(干)未经包被的Dowex_XUS-43493除去4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。如图7中数据所示，4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素吸附的动力学随pHEMA包被水平的增加而降低。尽管为了实现本发明不需要明白该机理，但是该降低据信是由于4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素扩散到吸附剂颗粒内的抗性增加。
同样用3.7％、7.3％和10.9％(w/w)pHEMA包被的Dowex_XUS-43493测定4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素除去的吸附动力学。结果(未显示)说明包被有10.9％pHEMA的珠的除去动力学是可与未经包被的(对照)珠相比较的。
pHEMA包被对血小板收率的影响在两个研究中在每种中使用不同量吸附剂(3.0g和5.0g)但相同水平的pHEMA包被(3.7％、7.3％和10.9％[w/w])测定pHEMA包被对血小板收率的影响。相对未与含未经固定的吸附剂的设备接触的经过处理的PC的5天的血小板数计算血小板收率。如表3中结果所示，当试验3.0g的XUS-43493时，随着pHEMA包被水平的增加在5天的血小板上存在稍许的剂量反应；因此这些结果建议低水平的pHEMA包被可能是最有效的，这是因为低水平的pHEMA包被对4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的除去动力学的影响更小同时其仍然抑制血小板粘附到吸附剂表面上。与用3.0g的XUS-43493看到的稍许影响相反，当试验5.0g时观察到剂量反应-pHEMA包被水平的增加增加了5天血小板收率。但是，收率仍然比使用3.0g吸附剂珠时观察的低。
表3

表3中所示的结果建议使用较低量的吸附剂(例如，2.5-3.0g)和低水平pHEMA包被(例如，≤3.0％w/w)将提供最好的血小板收率。如上所述，pHEMA包被的最佳水平是观察到对血小板收率和体外血小板功能的保护效果的最小包被。
pHEMA包被和灭菌对血小板功能的影响前面说明了由于pHEMA包被可以通过辐照交联或裂开，因此灭菌方法可以对吸附剂功能有很大影响。为了评价该影响，用经pHEMA包被(3.7％w/w)和未经包被的未经固定的XUS-43493的设备经2.5 MRad电子束或2.5MRadγ射线灭菌进行试验。将含2.5g(干)的未经固定的包被或未经包被的XUS-43493的每一设备装入正方形30μm聚酯网袋(7cm×7cm)中；含经过处理的PC的对照单独贮藏在PL 2410塑料容器中。结果列于表4中。
表4
参照表4，与对照相比5天的pH值显示是非常稳定的。用含未经固定的未包被的吸附剂的设备测定的pO2值稍微升高，这暗示代谢稍稍降低；用pHEMA包被显示出降低该影响，含未经固定的吸附剂的电子束灭菌的设备的结果比γ射线灭菌的设备的更接近对照。
经pHEMA包被的样品都具有非常好的血小板收率，电子束灭菌的样品呈现稍稍更好些。形状变化和聚集呈现出与收率相似的模式，含未经固定的未包被吸附剂的设备提供最低值并且经pHEMATF/电子束灭菌的样品提供与对照相似的较高值。用含未经固定的吸附剂的设备处理的样品在低渗休克反应(HSR)试验方面与对照相同或比对照好。用含未经固定的吸附剂的设备处理的样品比对照具有更低的形态得分，但GMP-140试验显示出更低水平的活化。
进行另一血相容性研究以比较含未经固定的未经包被的XUS-43493的设备(2.5g珠；30μm聚酯网袋；7cm×7cm)、含Amberlite_XAD-16的未经包被的纤维化树脂(14cm×14cm)和含经pHEMA包被的Amberlite_XAD-16的纤维化树脂。表5中所示的结果显示了pHEMA在纤维化树脂上的良好效果。
表5
由表5中关于体外血小板功能和血小板收率的数据说明，用pHEMA包被给纤维化树脂带来的pO2值更接近对照所观察到的。经pHEMA包被的纤维化树脂也比未经包被的纤维化树脂呈现出更高的血小板收率。结果显示出经pHEMA包被的纤维化树脂在所有体外血小板功能试验中比未经包被的XUS-43493珠表现得好。而且，未经包被的纤维化树脂在大多数体外血小板功能试验中比未经包被的XUS-43493珠表现得好。
实施例4甘油和聚乙二醇对吸附剂能力的影响该实施例试验甘油和聚乙二醇作为稳定剂对从血浆中除去氨基补骨脂素的吸附剂能力和动力学的影响。在该实施例的试验中使用自由(即未经纤维化)Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493吸附剂珠。
方法在80℃的烘箱中将Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas(Philadelphia，PA))和Dowex_XUS-43493(Supelco，Bellefonte，PA)干燥到水分＜5％。将已知量的吸附剂浸泡在含0-50％甘油、50％PEG-200或50％PEG-400(甘油、PEG-200和PEG-400来自Sigma)的乙醇溶液中。接着在室温下培养15分钟，除去过量溶剂并将这些样品在80℃下干燥一整夜；避免在＞120℃的温度下干燥该吸附剂，这是因为在更高温度下优先观察到吸附剂性能(例如，孔熔融)改变。干燥之后，称重吸附剂样品以确定单位质量吸附剂中稳定剂的量。
进行几个单独的研究。在如下所述的研究中包括“未经润湿”吸附剂的对照样品和“经最佳润湿”的吸附剂。未经润湿的吸附剂样品是未经受任何预处理的干燥吸附剂，而且经最佳润湿的吸附剂样品是通过用30％乙醇/70％dH2O润湿吸附剂制成的。将经最佳润温的吸附剂用dH2O冲洗以除去残余乙醇。为了确保不发生干燥，在吸附研究之前制备该吸附剂。
使用含150μM掺加有3H-4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的100％人体血浆进行每种吸附研究。将血浆(6.0mL)添加到含有用不同稳定剂处理过的吸附剂的小瓶中。校正吸附剂的量以便甘油或PEG内容物提供0.2g吸附剂。将这些小瓶放在旋转装置中并在室温下搅拌。在不同时间移出血浆样品并测定残余3H-4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的水平。将样品(200mL)稀释在5.0mL的OptiphaseHiSafe Liquid Scintillation Cocktail(Wallac)中并在Wallac 1409Liquid Scintillation Counter(Wallac)中计数。
用甘油处理过的Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493的吸附能力图8比较了用含不同水平甘油的乙醇溶液对Amberlie_XAD-16和Dowex_XUS-43493的预处理对100％血浆中相关4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素吸附能力的影响。在80℃下干燥48小时之前将吸附剂样品在乙醇/甘油溶液中润湿15分钟。在4小时的接触之后进行吸附能力的单个测定。参照图8，在X-轴上所示的甘油含量为甘油在乙醇中的重量/体积百分率。在Y-轴上所示的吸附能力是相对经最佳润湿的吸附剂样品的吸附能力的百分率。XUS-43493的吸附能力用正方形表示，XAD-16的用圆圈表示。
如图8中数据所示，XAD-16的能力从干燥样品中的约30％增加到在205甘油溶液中润湿的样品中的90％以上。这些结果说明了干燥之后为了保持高吸附能力需要非常低水平的甘油。在干燥之前在50％乙醇/50％dH2O(无甘油)中润湿的对照样品显示出与经过干燥的未经处理的样品相同的吸附能力。相反，这些XUS-43493样品未显示出甘油对吸附能力的任何影响；在所有水平的甘油下吸附能力接近100％。尽管对本发明的试验没有决定性作用，但是该发现支持甘油起到干燥过程中防止吸附剂孔塌陷的假说；因为XUS-43493具有高度交联结构，进行干燥时它不遭受孔塌陷。
用甘油处理的样品显示出对干燥非常稳定。样品在层流通风橱中贮藏7天观察不到吸附能力的变化(数据未显示)。
在本发明的一个优选实施方式中，将2.5g干燥吸附剂用于从每个单元的血小板中除去补骨脂素和补骨脂素光合产物。在30％甘油/70％乙醇中浸泡该吸附剂，接着干燥，使吸附剂含约50％甘油。因此一个5.0g的样品应含2.5g干吸附剂和2.5g甘油。这样，典型的300mL单元的血小板应含0.8％的甘油，一个被认为可接受用于输血的水平。
用甘油或PEG处理过的Amberlite_XAD-16和Dowex_XUS-43493的吸附能力用低分子量聚乙二醇PEG-200和PEG-400、非挥发性且能溶于乙醇和水中的低毒性试剂进行另外的研究。在乙醇中的50％的PEG-400、PEG-200或甘油溶液中将吸附剂样品处理15分钟。图9比较了稳定剂对干燥吸附剂Amberlite_XAD-16(下面)和Dowex_XUS-43493(上面)在100％血浆中的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素吸附能力的影响；未经润湿的样品标为“No Tx”。吸附能力是以相对经最佳润湿的吸附剂的能力的百分率来报道的。
正如图9中数据所示并以其“大网络”结构为基础预测，Dowex_XUS-43493的能力不受干燥(“No Tx”样品)影响。相反地，干燥后Amberlite_XAD-16约为最大能力的35％。用甘油、PEG-200和PEG-400处理XAD-16都提高了干燥吸附剂的能力；每个吸附剂能力都大于90％，其中甘油＞PEG-200＞PEG-400。尽管为了实现本发明不需要明白其准确作用机理，但是甘油和两种PEG溶液之间的能力的差异可能是稳定剂的渗透随分子量的增加而降低造成的。也就是说，在15分钟的应用过程中，甘油(MW=92.1)可能比由于其尺寸大因此扩散更慢的PEG-200(MW=190-210)或PEG-400(MW=380-420)能够更完全地渗透到吸附剂孔中。
用甘油或PEG处理过的Amberlite_XAD-16的吸附动力学同样进行研究以确定用甘油或PEG填充吸附剂的孔是否导致相反动力学降低。图10比较了使用几种不同溶液中的Amberlite_XAD-16从100％血浆中经过3小时的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附。具体地说，图10中的数据代表XAD-16 ⅰ)干燥前用50％甘油溶液润湿过(实线连接的空心正方形)，ⅱ)干燥之前用50％的PEG-400溶液润湿过(虚线连接的黑圆圈)，ⅲ)预润湿过，即在开始研究之前用50％乙醇/50％dH2O润湿过(虚线连接的黑三角形)，和ⅳ)未经过任何处理的(实线连接的黑正方形；“No Tx”)。图10中的数据证实了在50％甘油/50％乙醇或50％PEG-400/50％乙醇溶液中润湿的Amberlite_XAD-16样品的吸附动力学与在乙醇中经最佳润温的样品(即用乙醇预处理的样品)的吸附动力学非常接近。经干燥但未经处理的XAD-16样品(No Tx)通过3小时仅仅实现约30％的除去。
本实施例中所示的数据说明了用含50％乙醇和50％甘油、PEG-200或PEG-400的溶液形式的稳定剂处理Amberlite_XAD-16可以防止与干燥相伴的吸附能力的丧失。用这些稳定剂获得的结果暗示低分子量润湿剂代表用于增强吸附剂功能的可使用的方法。
实施例5从FFP中除去亚甲蓝本实施例涉及各种不同聚合吸附剂材料从鲜冻血浆中除去亚甲蓝的能力。
本实施例的试验评价“自由”吸附剂树脂(即，未加入含未经固定的吸附剂的设备)和纤维化树脂。所试验的这些自由吸附剂树脂是Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)、MN-200(Purolite)和Dowex_XUS-43493(Dow Chemical Co.)。该XAD-16 HP以水合状态进来以便不需要预处理(即，不润湿)，并且该MN-200也以完全水合的状态提供；该XUS-43493为干的。
含XAD-16的纤维化树脂通常是以实施例1中所述制备的。简单地说，将含130g/m2XAD-16的2cm×7cm(即14cm2)的纤维化树脂条首先在70％乙醇中润湿，然后用蒸馏水彻底冲洗。
亚甲蓝(10mM)储备溶液是通过将U.S.P.亚甲蓝(Spectrum)溶于蒸馏水中制成的。将该亚甲蓝储备溶液添加到100％血浆样品中得到10μM的最终浓度。将“自由”吸附剂树脂样品(即，XAD-16 HP、MN-200和XUS-43493)称入50mL聚丙烯管中用于吸附研究。通过干燥测定质量丢失确定每种吸附剂的水分含量。用水分含量校正每种吸附剂的质量以便每种相当于使用0.25g干吸附剂。
向每一小瓶中添加30mL含10μM亚甲蓝的100％血浆样品。在室温下将这些小瓶放在旋转装置上。以间隔15分钟从每一小瓶中除去样品(200mL)并通过HPLC鉴定剩余亚甲蓝。用样品稀释剂(最终浓度=35％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)将每种血浆样品稀释5倍。通过在4℃下将这些样品培养30分钟使蛋白质和其它大分子沉淀。将样品离心分离并将上层清液过滤(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从65％溶剂A(25mM KH2PO4，pH=3.5)、35％B(甲醇)到80％B的线性梯度经过分析。HPLC试验的检出极限为约0.5μM亚甲蓝。
图11比较了在2小时内从100％血浆中吸附亚甲蓝的动力学。参照图11，XAD-16 HP数据由虚线连接的空心菱形所示，MN-200数据由实线连接的黑三角形所示，XUS-43493数据由虚线连接的空心圆圈所示，并且含XAD-16的纤维化树脂由实线连接的黑正方形所示。正如这些数据所示，该XAD-16 HP和MN-200提供了最快的吸附动力学，接着是XUS-43493。正如XUS-43493以其干燥状态时使用的，其动力学稍慢些可能是由于其润湿较慢所至。最后，含XAD-16的纤维化树脂具有最慢的吸附动力学。这可能是在批次培养过程中，由于14cm2的纤维化树脂条的一部分在整个吸附研究中未完全浸泡在血浆中，因此降低了吸附剂和血浆之间的有效接触面积，致使纤维化树脂和血浆之间接触较差。
这些数据说明了可以使用在本发明中尝试使用的树脂和纤维化树脂从血液制品中除去如酚噻嗪染料的非补骨脂素的补骨脂素失活化合物。
实施例6从经过包装的红血球中除去吖啶化合物本实施例涉及各种不同树脂材料将吖啶化合物从经过包装的红血球(PRBC)中除去的能力。更具体地说，本实施例的试验评价从PRBC中除去该吖啶化合物，5[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
几种吖啶的化学结构列于图12中。如图12所示，9-氨基吖啶和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶为氨基吖啶。
树脂选择性用几种类型的树脂研究化合物5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的平衡吸附。所评价的聚合吸附剂树脂是Amberlite_XAD-2、XAD-4、XAD-7和XAD-16 HP(Rohm and Haas)；Purolite_MN-150、MN-170、MN-200、MN-300、MN-400、MN-500和MN-600；和Dowex_XUS-43493和XUS-40285(Dow Chemical Co.)。此外，试验几种Amberlite_阴离子交换树脂(IRA-958、IRA-900、IRA-35、IRA-410和IRA-120；Rohm andhaas)和Amberlite_弱阳离子交换树脂(DP-1；Rohm and haas)。而且，评价几种炭，包括Hemosorba_AC(Asahi)、PICA G277和Norit ASupra(都可从American Norit商购获得)。最后，还试验Porapak_RDx(Waters)，一种具有硝基芳香族化合物亲和力的苯乙烯乙烯基吡咯烷酮共聚物。
最初，用每种树脂样品评价5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和腺嘌呤(6-氨基嘌呤)的能力来进行平衡吸附研究。称重约0.1g树脂并转入6mL聚丙烯管中。将在蒸馏水中的含100μM5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的25％血浆/75％Adsol_(Baxter)的5.0mL等分试样添加到每一管中。典型地将例如红血球的细胞制品贮藏在含低百分率的血浆(10-35％)和剩余合成介质的介质中；Adsol_一种由在盐溶液中的腺嘌呤、葡萄糖和甘露糖醇组成的合成介质的例子。当然，本发明尝试使用在血浆和其它合成介质的混合物中的吖啶浓缩物而不是100μM。接下来，将这些管放在滚筒搅拌器上并在室温下培养3小时。培养之后，移出每种样品的等分试样通过HPLC分析残余5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和腺嘌呤。
就HPLC过程而言，用样品稀释剂(50％甲醇，25mM KH2PO4，pH=3.5)将每种样品稀释2倍，通过在4℃下将这些样品培养30分钟使蛋白质和其它大分子沉淀。然后将这些样品离心分离并将上层清液过滤(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从75％溶剂A(25mM KH2PO4，pH=3.5)、25％B(甲醇)到80％B的线性梯度进行分析。就5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶除去而言，在Cf=1μM下的估计能力(μmole/g)是由具有C0=100μM的单个吸附测定确定的；该结果列于表6第2列(ND=不能测出)。就腺嘌呤而言，在Cf=1mM下的估计能力(mmole/g)是由具有C0=1.5mM的单个吸附测定确定的；该结果列于表6第3列(ND=不能测出)。
表6
当尝试使用任何能够吸附吖啶化合物的树脂时，优选的树脂选择性地越过腺嘌呤吸附5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶并呈现出较低溶血。图13为不同树脂的腺嘌呤能力(Y-轴)和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力(X-轴)数据的曲线。如表6和图13中的数据所示，Dowex_XUS-43493和Purolite_MN-200树脂具有最高的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力；而且，当同时考虑高5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力和低腺嘌呤能力时，Amberlite_XAD-16 HP比较理想。
本实施例中所述的体外试验的结果暗示Dowex_XUS-43493和所述树脂Purolite_MN-200为从PRBC中除去吖啶化合物的优选树脂。
实施例7用苯乙烯-二乙烯基苯吸附剂从包装的红血球中除去吖啶化合物本实施例涉及各种不同苯乙烯-二乙烯基苯(苯乙烯-DVB)吸附剂从血液制品中除去氨基吖啶化合物的能力。更具体地说，本实施例的试验评价从血浆/Adsol_溶液中除去吖啶橙和9-氨基吖啶(如图12所述)。
A.试验步骤就本实施例的试验而言，在蒸馏水中制备5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶(Cerus)和吖啶橙(Aldrich)的储备溶液(10mM)，并在乙醇中制备9-氨基吖啶(Aldrich)的储备溶液(10mM)。将该5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶添加到含25％血浆/75％生理盐水的溶液中以达到最终浓度100μM，同时将该吖啶橙和9-氨基吖啶化合物添加到含25％血浆/75％Adsol_(Baxter)防腐溶液中以达到最终吖啶浓度100μM。
所用吸附剂为Amberlite_XAD-16 HP(Rohm and Haas)；Purolite_MN-200和Dowex_XUS-43493(Supelco)。通过测定干燥后质量丢失来测定每种吸附剂的水分含量；校正水分含量以便使用0.25g干的每种吸附剂的等价物。将吸附剂准确称取到50mL Falcon管中。向含吸附剂的每一管中添加30mL含100μM吖啶的25％血浆/75％Adsol_溶液。然后在室温下将这些管放在旋转装置上，并贮藏以后分析用。
通过HPLC分析样品中残余吖啶水平。用样品稀释剂(50％甲醇，25mMKH2PO4，pH=3.5)将每种样品稀释2倍，通过在4℃下将这些样品培养30分钟使蛋白质和其它大分子沉淀。然后将样品离心分离并将上层清液过滤(0.2μm)并在C-18反相柱(YMC ODS-AM，4.6mm×250mm)上通过在20分钟内流出从75％溶剂A(25mMKH2PO4，pH=3.5)、25％B(甲醇)到80％B的线性梯度进行分析。使用一二极管数组检测器通过可见吸光度在400nm下检测9-氨基吖啶、在490nm下检测吖啶橙并在410nm下检测5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
B.吸附动力学从25％血浆/75％生理盐水中经过3小时对5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的吸附比较Dowex_XUS-43493、Purolite_MN-200和Amberlite_XAD-16 HP的吸附动力学。图14A和图14B都显示了残余5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶与时间的函数，图14B显示对数刻度的数据。在图14A和图14B中，XAD-16 HP数据由虚线连接的黑圆圈所示，MN-200数据由虚线连接的黑正方形所示，XUS-43493数据由实线连接的黑三角形所示。由这些数据说明，XUS-43493和MN-200具有最快的吸附动力学并且几乎等价。XAD-16 HP显示具有较低的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶能力。
图15比较了用Dowex_XUS-43493从25％血浆/75％Adsol_中除去9-氨基吖啶和吖啶橙的吸附动力学。参照图15，虚线连接的黑正方形代表9-氨基吖啶，实线连接的黑圆圈代表吖啶橙。由这些数据说明，超过3小时检测不到9-氨基吖啶水平。比较起来，Dowex_XUS-43493对吖啶橙的能力较低，这可能是由于在吖啶橙上有两个季氨基。
实施例8制备用-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和谷胱甘肽处理过的PRBC。用新鲜的ABO-匹配的全血制备PRBC库。使用Beckman Sorvall RC3B离心分离机在3800rpm下将这些全血单元离心分离5分钟。使用一压榨器将血浆在另一干净袋中压榨。如果需要一个以上单元时，将这些PRBC单元合并在3.0L大小的Clintec Viaflex袋中。向每一单元的PRBC添加94mL的Erythrosol。通过将血液制品填充到毛细管中并将其旋转5分钟来测定血细胞比容(HCT)百分率。测定血细胞比容以确保其不低于55％。向每种100mL的PRBC中添加3.3mL的12％葡萄糖。测定最终血细胞比容百分率。将PRBC(300mL)再填充到塑料容器PL146(Baxter Healthcare)中。向血袋中添加6.0mL的150mM谷胱甘肽以达到3.0mM最终浓度以及添加3.0mL的30mM 5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物以达到300μM最终浓度。使用腕作用摇动器(厂商)将该PRBC混合物搅拌1分钟。将经5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和谷胱甘肽处理过的PRBC在室温下整夜培养以使该5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物分解成5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶。
实施例9在PRBC和PRBC上层清液中的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的HPLC试验。将该样品(100μL)用100μL生理盐水稀释并将所得混合物涡旋。向该溶液中添加300μL在CH3CN中的20mM H3PO4，将该混合物涡旋15秒钟。在13200rpm下将该样品离心分离5分钟。将该上层清液(200μL)稀释进800μL的冷0.1M HCL中并经涡旋。通过使用0.2μm GelmanAcrodisc过滤器将该样品填充到自动采样器中。HPLC条件如下(柱和常规柱的厂商和部件号)柱=Zorbax SB-CN，4.6mm×150mm，3.5μm颗粒；保护柱=(4.6mm×12.5mm，5μm颗粒(Mac Mod Analytical，Inc.(Chadds Ford，PA))；移动相A为在HPLC水中的10mM H3PO4；移动相C为在乙腈中的10mM H3PO4；温度为20℃；样品体积为100μL；梯度条件如下

DAD设置如下

实施例10在PRBC和PRBC上层清液中的谷胱甘肽的HPLC试验。该样品是按照如上所述HPLC试验制备的。HPLC条件如下分析柱=YMC ODS-AM-303，250mm×4.6mm，5μm颗粒；保护柱=Brownlee，15×3.2mm，7μm颗粒；移动相A为在HPLC水中的10mMH3PO4；移动相C为在乙腈中的10mMH3PO4；温度为15℃；样品体积为75μL；梯度条件如下

DAD设置如下

实施例11筛选吸附剂的方法。使用含25％血浆和75％Erythrosol的试验溶液代表PRBC中的上层清液。将Erythrosol制备作为两个经单独杀菌的分开的储备溶液部分(溶液C和溶液D)。将等体积的溶液C和溶液D混合制得最终溶液。

将血浆-Erythrosol溶液掺加5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶至300μM的最终浓度。向该混合物中添加谷胱甘肽(还原形式，Sigma Chemical Co.)以获得3mM的最终浓度。将吸附剂样品(0.2-0.8g)准确称取(±0.001g)在进确定空瓶重的7mL带螺旋塞盖的小瓶中。将需要预润湿的吸附剂样品悬浮在70％乙醇中，将该吸附剂静置并除去上层清液。通过将吸附剂再悬浮在蒸馏水中、使该吸附剂静置并倾析该上层清液以除去残余乙醇。当计算吸附剂能力时根据水分含量校正吸附剂质量。向每一管中添加5.0mL血浆/Erythrosol等分试样。将这些管放在旋转装置上并在室温下翻转24小时。从旋转装置中移去这些小瓶并将吸附剂静置。从每一管中除去上层清液样品。离心分离样品以除去残余吸附剂。通过HPLC分析样品以测定5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶残余水平。使用如上所述的反相试验检测谷胱甘肽的残余水平。吸附剂筛选的结果示于表7和8中。
表7吸附剂筛选-从25％血浆/75％Erythrosol中除去5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶(“LOD”为检测极限) 表8吸附剂筛选-从25％血浆/75％Erythrosol中除去谷胱甘肽 实施例12吸附剂的吸附能力。进行吸附等温线试验以测定各种类型的吸附剂的吸附能力(μmole5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶/g吸附剂)。图17显示了与Purolite MN-200的吸附等温线相比由几种Ambersorb获得的吸附等温线。在含0.2-3mM 5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和0.6-10mM GSH的25％血浆/75％Erythrosol溶液中进行吸附研究。在室温下将样品搅拌24小时。使用表7(22μmole/g)中吸附能力计算测定应需要约4gPurolite MN-200将300mL的PRBC单元中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的水平从300μM减少到最终水平1μM。需要低于1g的Ambersorb572(130μmole/g)以实现可比较的除去。简单的计算评价应需要低于1g的Ambersorb 572将300mL的PRBC单元中GSH的水平从150mL上层清液(50％HCT)中的6mM减少到最终水平500μM。
实施例13分解产物的长期除去。
本试验检验PRBC在暴露24小时之后除去纤维化PICA G-277活性炭设备(AQF，7.3g.500m2/g)后其中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的水平。在PRBC具有连续设备暴露的地方平行地进行该研究。图18显示了在1-4周的贮藏中在没有设备的情况下上层清液样品中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH的浓度高得多。
在有除去设备(MN-200)的情况下在贮藏35天之后在最初摇动的PRBC中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的浓度减少到5μM。这说明在4℃下在静止贮藏条件中的确发生了5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶除去。
实施例14封闭材料(膜、编织、无纺)对IAD的影响经调查使用封闭材料包围吸附剂介质用于颗粒留住的最初目的。该最初目的是留住颗粒。但是，通过防止RBCs和膜之间接触膜可以改善设备的血相容性。可以容易地使用亲水聚合物(PEO、PEG、HPL)调节膜以改善血相容性但不改变功能。通过热封膜、编织聚酯或无纺聚酯材料包围约10g的纤维化Pica G277活性炭介质(AQF 500g/m2)。将PRBC单元(300mL)用300μM可降解的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和3mMGSH配料，在室温下在血小板震动器中保持20小时，然后输入IAD。在24小时内监测5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的浓度。图19显示了300mL暴露到由纤维化Pica G277活性炭(500g/m2)组成的IAD并用膜、编织或无纺材料封住的PRBC单元的上层清液中5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的水平。将PRBC(Erythrosol、葡萄糖、62％HCT)用300μM的可降解的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶衍生物和3mM GSH配料，在输入IAD之前在室温下在血小板震动器中搅拌。在室温下将含PRBC的IAD搅拌24小时。
这些研究说明Tetko封闭物显示出24小时内5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的最快的除去动力学。在2周后所有封闭材料达到的最终浓度是相似的，1天后5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶浓度降低到约2μM，但8天左右升回到10μM。
实施例15化合物吸附设备对红血球功能的影响。红血球功能指示器监测不同设备构型的5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶和GSH除去试验的整个过程。测定的参数包括溶解百分率、ATP和K+浓度。表9显示出ATP浓度一般不受化合物除去设备的存在影响使用MN-200或Pica G277设备的ATP浓度的降低与对照(没有IAD)的大致相同。发现PRBC中K+的水平随时间推移而增加。发生除去时的温度不影响在化合物除去设备中暴露20天的PRBC单元中的K+水平。但是，当暴露时间延长到35天时，PRBC中K+增加的速度随吸附剂类型而变化，MN-200和PICA G-277设备分别到达40和45mmol/L的最终水平，而没有设备的对照到达39mmol/L。在经设备暴露过的和没有设备的对照PRBC单元中溶解的红血球的百分率通常已发现在24小时之后为0.1-1％之间。如表10和表11所示和图20和21的图示，溶解百分率随所用吸附剂类型有很大的变化。表10显示了PRBC暴露到两类固定吸附设备中35天后的溶解值。表11显示了PRBC暴露在封闭在编织聚酯网中的松散吸附剂颗粒中42天后获得的溶解值。在1分钟内使用手腕作用震动器配制所有PRBC单元，之后将该PRBC在室温下静置4小时。将这些设备在血小板震动器上在室温下保持24小时，之后在研究期间将它们在4℃下静置。固定MN-200比固定PICA G-277显示出较低的溶血水平，同时松散颗粒吸附剂相比Ambersorb合成含炭吸附剂显示出最低的溶血水平。MN-200IAD显示出比相同但未经固定的吸附剂低的溶血。与未经固定的吸附剂相比对其它IAD观察到相似的观测。
表9.整个过程中PRBC中ATP的浓度(μmol/dL) 表10.在整个时间内暴露在不同IAD中的PRBC(56％HCT)溶解百分率 表11.暴露于封闭在织制网中的不同松散颗粒吸附剂中的PRBC(55％HCT)溶解百分率
举例说明了吸附剂颗粒在保持红血球功能方面的决定性性能。列出了五个不同吸附剂对红血球溶血的影响的比较性研究。Ambersorb 572在24小时暴露之后仅在PRBC(55％)中产生0.16％的溶血，而且Darco AC(Norit Americas，Inc.(Atlanta，GA))产生0.13％的溶血。这些吸附剂在使红血球溶血方面比Purolite MN-200、Hemosorba CH-350和Pica G277吸附剂好得多。
表12显示了含谷胱甘肽和5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶的红血球样品的上层清液与大量不同吸附剂接触的比较性研究。活性炭是基本上既能降低5-[(β-羧乙基)氨基]吖啶浓度又能降低谷胱甘肽浓度的仅有类型的吸附剂。天然活性炭(Norit和PICA)和合成活性炭(Ambersorb)在化合物降低方面都证明是有效的。
表12.几种不同吸附剂的性能 @PS-DVB=聚苯乙烯-二乙烯基苯，AC=活性炭＾所列为“＞”的值是在试验LOD之下对残余水平的单个测定*由25％血浆、75％Erythrosol中单点吸附研究得到的评价
+由25％血浆、75％Erythrosol中多点吸附研究得到的评价实施例16由粘附在无纺聚酯纤维基质(Hoechst-L493)上的Dowex OptiporeL-493组成的纤维化介质已由Hoechst Celanese的AQF部(Charlotte，NC)生产。在用于血小板的批量除去设备中进行该吸附剂介质的性能的评价。
血小板制备在300mL的35％自体血浆、65％PASⅢ中含3.5-4.5×1011血小板的单供体分离性输血血小板单元是从Sacramento Blood Bank Center获得的。将4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素(BaxterHealthcare)添加到每一血小板单元中以达到150μM的最终浓度。将血小板单元(4-5个)合并在单个PC-2410塑料容器中并充分混合。将该血小板混合液均匀分入4-5个1L PL2410塑料容器中，每个容器约含300mL血小板混合物。将这些单元用3.0J/cm2UVA处理并移入适当除去设备中进行研究。所有试验都包括经光化学处理(150μM补骨脂素，3.0J/cm2UV-A)但不与除去设备接触的对照血小板单元。
设备制备含2.5g Dowex XUS 43493的标准除去设备是由Baxter HealthcareCorporation(Lot FX1032 D96F20042R)制备的。试验的IAD是用供应作为轧辊原料的Hoechst-L493介质(Hoechst Celanese Corp.)制备的。将介质测定并切割成具有每个IAD的适宜吸附剂量(5.0g和7.5g)。将所切割的介质方在由脉冲焊30μm聚酯网(Tetko)构成的袋中。含这些介质的网袋经高压灭菌(121℃，20min)并放入无菌PL 2410塑料容器中。或者，将网袋放入PL 2410容器中，将这些容器密封并将该整个装置通过至2.5MRad的γ射线(SteriGenics)灭菌。在经过光化学处理的血小板转移之前使用注射器将设备中剩余空气手工抽空。
吸附动力学在用4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素+UVA的光化学处理之后，将这些血小板混合物送入带有除去设备的PL2410塑料容器中。将这些设备放在标准血小板培养箱(Helmer)中并在22℃下以70转/分钟搅拌。每隔1小时取出血小板混合物样品用于首先的8小时贮藏。这些样品在4℃下贮藏并且随后通过HPLC分析分析残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。该试验涉及溶解血小板并溶解4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素且无光合产物的最初样品制品。样品制品的上层清液是用在KH2PO4缓冲液中梯度增加的乙醇在C-18反相柱上分析的。
体外血小板功能将血小板混合物与除去设备搅拌接触7天。在一个研究中，血小板混合物与IAD接触24小时并使用无菌管焊机(Terumo SCD 312)转移到无菌1L PL2410塑料容器中。将血小板放回到血小板培养箱中并贮藏7天贮藏期间的剩余时间。
贮藏5或7天之后，测定每个血小板单元中的血小板数和pH。使用CIBA-Corning model 238 Blood Gas Analyzer测定pH和pO2/pCO2。使用Baker 9118+Hematology analyzer测定每个样品中的血小板数。。进行几个试验以评价体外血小板功能。使用Chrono-Log model 500 VSwhole blood aggregometer监测血小板样品的形状变化。形状变化是以添加ADP之后光传输的最大变化与添加EDTA之后光传输的变化之比来定量的。
血小板对低渗压的反应是通过低渗休克反应(HSR)试验来评价的。添加低渗溶液之后光传输的变化是使用Chrono-Log model 500 VSwhole blood aggregometer测定的。数据是以吸光度达到其最小值之后2分钟由低渗压回收的百分率来报道的。
血小板对ADP/胶原激动剂反应而集聚的能力是通过Chrono-Logmodel 500 VS whole blood aggregometer测定的光传输的变化来说明的。
血小板的状态是通过对血小板打分来评价的。样品被蒙蔽并且将100个血小板的形态学得分合计为每个样品的得分。最高可能得分为400(圆盘状=4，中间体=3，球状=2，树状=1，气球状=0)。
血小板活性是通过测定p-选择蛋白(Granular Membrane Protein，GMP-140)的表达来说明的。将CD62抗体用作试验样品，将老鼠对照IgG1用作负对照，将带有乙酸肉豆蔻氟波醇(PMA)的CD62抗体用于正对照。在FACScan(Becton Dickinson)上分析样品。报道的活性百分率是与正对照相比的并且是试验值和负对照值的差。
吸附动力学调查吸附剂珠加入纤维基质中的影响。含有于300mL的35％血浆、65％PASⅢ中4.0×1011个血小板的血小板单元经150μM 4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素+3.0J/cm2UVA处理。IAD是由具有450g/m2的吸附剂载荷的Hoechst-L493制备的。这些IAD经过γ射线灭菌。用补骨脂素+UVA处理之后，将这些血小板转移到除去设备中。每隔1小时移出样品并通过HPLC分析残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。图22比较了含5.0g和7.5gHoechst-L493介质的IAD和含2.5g松散珠的标准除去设备的IAD的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的除去动力学。IAD或者含5.0gHoechst-L493(三角形)、7.5g Hoechst-L493介质(正方形)或者含2.5g松散Dowex L493吸附剂珠(圆圈)。Hoechst-L493介质含载荷为450g/m2的吸附剂珠。
当与相同量松散吸附剂珠比较时Hoechst介质的4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的吸附动力学较慢。含2.5g松散珠的除去设备在短时间(1小时)内使残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的水平达到最低。但是，在较长时间时，7.5g和5.0g的Hoechst-L493介质的IAD表现的较好。在该研究中，在低于4小时的接触中所有三个除去设备的吸附动力学都相对快地达到＜0.5μM残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素的目标。
注意到在长时间(6-8小时)内含较高量吸附剂的Hoechst-L493获得较低水平的残余4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素。该观察暗示Hoechst-L493 IAD的较慢的吸附动力学使得材料输送受到限制(液体流速和扩散)并不使由于纤维吸附的功能性吸附面积损失。其它研究说明具有较低水平吸附剂载荷(200-300g/m2)的Hoechst-L493介质使得流体更容易地渗透到介质中，这使得吸附动力学更快。前面对含载荷为160g/m2的Amberlite XAD-16吸附剂的Hoechst介质的研究显示吸附动力学没有受到以低水平载荷加入纤维基质的影响。
血小板收率和体外血小板功能在这节中呈现两个独立研究的数据。每个研究中的血小板单元是由单个库得到的，以便能够清楚地评价IAD介质式样、吸附剂量和接触时间的影响。
第一个研究评价纤维化(Hoechst介质)对延长接触(5和7天)后血小板的收率和功能的影响。将从一个库中得到的总共四个血小板单元用于该研究。无IAD的对照经补骨脂素+UVA处理。将两个血小板单元与5.0g Hoechst-L493接触。一个单元在转移到一空的PL2410贮藏容器之前与IAD接触24小时。剩余的另一单元在研究过程中一直与IAD接触。将这些Hoechst-L493 IAD用蒸汽杀菌(120℃，20分钟)。从Baxter获得的标准除去设备(2.5g松散Dowex XUS-43493)经过γ射线灭菌。注意到在试验中典型地与利用松散吸附剂颗粒的设备接触8-16小时之后血小板没被从标准除去设备中移走。将贮藏5和7天后的血小板数和体外功能的结果分别汇集在表13A和表13B中。
表13A.(5天)Hoechst-L493纤维化介质与标准除去设备的比较贮藏5天后血小板收率和体外功能


表13B.(7天)Hoechst-L493纤维化介质与标准除去设备的比较贮藏7天后血小板收率和体外功能


Hoechst-L493 IAD(5.0g)的血小板收率明显好于标准除去设备(2.5g)的收率。在连续与Hoechst-L493 IAD(5.0g)接触7天的贮藏实现了损失＜10％。用Hoechst-L493 IAD处理的血小板单元都在形状变化、集聚和GMP-140方面比无IAD的对照呈现出较好的性能。保持与Hoechst-L493 IAD)(5.0g)接触整整5天的血小板比接触24小时之后转移的血小板显示出可比较的体外功能。有趣的是，保持与Hoechst-L493IAD接触的血小板在GMP-140试验中表现得较好。7天后两者中间性能的差异很大。这种观察暗示与IAD的接触降低了贮藏过程中通过血小板的p-分离蛋白表达的速度。
第二个研究是在含5.0g和7.5g的Hoechst-L493介质的IAD中寻找确定用更高量的介质是否在血小板收率或体外功能上有更大的降低。在该研究中，Hoechst-L493 IAD通过γ射线灭菌。标准除去设备(2.5g Dowex XUS-43493)包括在该研究中。在该研究的整个过程中血小板保持与除去设备接触。将贮藏5和7天后的血小板数和体外功能的结果分别汇集在表14A和表14B中。
表14A.(5天)γ射线灭菌的Hoechst-L493纤维化介质的评价贮藏5天后血小板收率和体外功能(不转移)


表14B.(7天)γ射线灭菌的Hoechst-L493纤维化介质的评价贮藏7天后血小板收率和体外功能(不转移)


在表14A和14B中汇集的结果与在第一个研究中观察到的结果相似。与Hoechst-L493 IAD接触的血小板的收率比与标准除去设备接触的血小板的收率高得多。7.5g Hoechst-L493 IAD的血小板收率略低于5.0g IAD的血小板收率。在所有体外试验中用Hoechst-L493 IAD处理过的血小板呈现出可与对照血小板相比。在第7天在集聚试验中与无IAD的对照相比与Hoechst-L493 IAD接触的血小板显示出改善了的性能。在第7天没有进行GMP-140试验。
当与血小板接触贮藏5天的标准除去设备(2.5g松散XUS-43493)相比，用Hoechst-L493介质(5.0，7.0g)制备的IAD使得体外功能优良。而且，经150μM 4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素+3.0J/cm2UVA处理的血小板当与Hoechst-L493 IAD(5.0g)接触5和7天时显示出通过形状变化、集聚和GMP-140所指示的改善的体外功能。比较带或不带IAD(5.0g Hoechst-L493)的血小板的5-7天贮藏的另一研究证明带IAD的贮藏可以提高血小板性能，如体外功能试验所示。
实施例17AQF纤维化珠与自由珠在PRBC中的比较。该研究比较使用Ambersorb 572的AQF纤维化珠和自由珠从PRBC中除去S-300(N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸)和谷胱甘肽。
通过在2100rpm下将全血离心分离5分钟并挤掉血浆，然后每单元添加84mL Erythrosol制得PRBC。将6个经ABO匹配过的单元合并在一个3.0L的Clintec Viaflex袋中。将约300mL返回到每个最初的PL 146袋中并用6.0mL的150mM谷胱甘肽定量至3.0mM的最终浓度和用3.0mL的30mM S-300衍生物定量至300μM的最终浓度。将其手工混合并使其在室温下培养4小时。
将这些PRBC转移到含于AQF纤维化介质中的4.8g Ambersorb珠(400g/m2)或4.8g松散Ambersorb珠的两个吸附设备之一的1L PL1813袋中。将这些纤维化介质或松散珠封闭在一个Tekto织制网袋中。对每个吸附设备重复二次并将在没有吸附设备的PL 1813袋中的单元作为对照。将它们在室温下在血小板震动器上贮藏24小时，然后转移到静止条件下在4℃下贮藏。在与S-300衍生物和谷胱甘肽配料之前、在处理之后但在转移到吸附设备之前、以及在2、4、6、8、20和24小时和转移到吸附设备之后的1、2和5周对这些单元抽样。制备这些样品用于S-300和谷胱甘肽的HPLC分析，结果示于表15中。也对这些样品进行溶血百分率、ATP浓度、K+浓度和pH分析(参见表16)。
该试验的结果暗示纤维化树脂优于自由珠。与自由珠相比，该纤维化树脂显示出等价除去S-300和谷胱甘肽具有改善红血球功能的好处。表15显示了两种化合物的吸附设备的S-300除去是相似的。在24小时之后纤维化珠的谷胱甘肽的除去动力学显示出稍好但两个设备都在可接受的水平。表16显示了就红细胞功能试验而言纤维化树脂处理过的样品可与对照单元相比。两个设备比较起来，ATP和pH基本上相同。24小时之后溶血百分率和K+水平自由珠高得多，这说明红血球功能基本上损失了。
表15.使用在纤维化介质中的Ambersorb 572珠和自由珠从PRBC中除去S-300和谷胱甘肽。处理之后PRBC(S-300)或上层清液(谷胱甘肽)中化合物的残余浓度。 表16.用在纤维化介质中的Ambersorb 572珠和Ambersorb 572自由珠处理的PRBC的溶血百分率、K+、ATP和pH比较。

实施例18搅拌方式对使用纤维化Ambersorb 572的S-300和谷胱甘肽的除去的影响以及对红血球功能的影响。该研究着眼于在IAD处理过程中所用的搅拌方法对除去S-300(N-(9-吖啶基)-β-丙氨酸)的影响以及对血细胞比容百分率、溶血百分率、ATP浓度、K+浓度和pH的影响。
制备PRBC作为一个库并如实施例17中处理。在室温下处理4小时之后，将6个单元转移到由封闭于一个Tekto织制网袋中的4.8g的Ambersorb 572(AQF生产，400g/m2)组成的IAD中。将这些IAD包含在1L PL1813袋中。将对照单元转移到没有IAD的PL1813袋中。然后将它们经过如下处理

与实施例17中相似地对单元抽样。结果显示优选某一搅拌方法用于除去S-300和谷胱甘肽。尽管轨道震动器显示出比其它方法更低水平的溶血，但是所有方式获得相同的除去。表17显示了S-300和谷胱甘肽水平。表18显示了红细胞功能。
表17用不同搅拌方式处理且具有AQF纤维化Ambersorb 572的单元中的S-300和谷胱甘肽水平。 PS=血小板震动器，OS=轨道震动器，PR=血小板旋转装置，N=Nutator。表18使用纤维化AQF Ambersorb 572并使用不同搅拌方式获得的溶血百分率、K+、ATP和pH结果。

实施例19由纤维化Ambersorb 572处理过的PRBC活化的补体的除去。本研究着眼于用S-300衍生物和谷胱甘肽处理接着用AQF纤维化介质除去之后在PRBC中形成补体片段C3a和SC5b-9。
制备PRBC作为一个库并按实施例17中每一个进行处理。在室温下处理4小时之后，将这些单元转移到含以下的1L PL 1813袋中。

醋酸纤维素酯膜已知是使补体活化并被用作正对照。除单元2之外所有单元在4℃下静止贮藏之前都在室温下处理24小时。单元2在4℃下连续贮藏。
在IAD处理之前、处理过程中4、8、和24小时、和5天之后，从每个试验物品中取出三个1.5mL样品，将每个样品在2000xg下离心分离15分钟并将450μL的每一上层清液与50μL冷200mM EDTA混合并经涡旋。将它们在干冰上快速冷冻并在-70℃下贮藏。
将酶免疫试验(Quidel)用于检测补体片段C3a和SC5b-9的形成。这些片段的存在是补体相同活化的象征。该试验涉及由与辣根过氧化物酶(HRP)结合的老鼠抗体粘结该靶子片段并使用该HRP的显色物检测。测定样品吸光度并根据标准曲线计算样品中的片段浓度。与实施例17中相似地也对这些样品评价S-300、谷胱甘肽和溶血。
结果显示与对照比较，在用AQF介质中的Ambersorb 572珠处理过的样品中补体活性降低。表19显示出就对照而言，补体活性比在4℃下连续贮藏的样品中的低。用IAD处理过的样品显示出比在5天的对照的C3a和SC5b-9的水平低，在24小时后C3a接近检测极限。表20显示出S-300和谷胱甘肽的除去按用AQF介质所希望的进行。
表19经过不同处理的补体片段C3a和SC5b-9水平。 表20经过不同处理的S-300浓度(PRBC)、谷胱甘肽浓度(上层清液)和溶血百分率。 实施例20通过惰性颗粒基质改善吸附剂的血相容性。本实施例证明将吸附剂颗粒固定在惰性颗粒基质中提高了吸附剂的血相容性并且对低分子量化合物的除去基本上没有影响。此外，本实施例支持将吸附剂颗粒固定在惰性基质(纤维或颗粒)中是提高吸附剂血相容性的常规方法的论点。由固定在纤维基质和颗粒基质中的吸附剂颗粒组成的IAD的结果示于下。
在本实施例中所研究的介质包括固定在超高分子量聚乙烯(UHMWPE)微粒基质中的Purolite MN-200吸附剂颗粒(200-1200μm)。代表性的介质是由Porex(Fairburn，GA)生产的。通过将约50％(w/w)PuroliteMN-200(200-1200μm)与50％(w/w)具有相同粒径的UHMWPE混合形成固定吸附剂介质的盘。将该混合物放入圆柱形腔中在压力下受热，其条件足以使UHMWPE颗粒熔融并包围吸附剂颗粒。所得盘的直径为3.50英寸并且厚约为0.250英寸。这些盘重约24g，相应于每个盘中约有12g MN-200。将介质盘放入塑料贮藏容器(PL2410，Baxter HealthcareCorp.)并通过具有25-40kGy的γ射线(Sterigenics，Hayward，CA)辐射将整个装置灭菌，从而制得IAD。
该纤维基质IAD包括以300g吸附剂/m2的载荷固定在无纺聚酯基质中的Purolite MN-200。将约2.5g(吸附剂量)的固定Purolite MN-200放入由30μm编织聚酯材料(Tetko，DePew，NY)构成的袋中。将该袋装置放入塑料贮藏容器(PL2410，Baxter Healthcare Corp.)并通过具有25-40kGy的γ射线(Sterigenics，Hayward，CA)辐射将整个装置灭菌。
包括悬浮在约300mL的35％自体血浆、65％血小板添加溶液中的血小板(3-5×1011细胞)的经ABO匹配的血小板浓缩物单元是从SacramentoBlood Band(Sacramento，CA)获得的。在向每个单元给以3mL的15mM氨化补骨脂素(4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素)之前将这些血小板单元汇集并分开。通过在UVA照射设备(BaxterHealthcare Corp.)中用3.0J/cm2的UVA照射将每个单元经受光化学处理。将两个经过光化学处理的血小板单元转移到具有两个试验SRD的PL2410塑料贮藏容器中。一个经过处理的单元作为对照并且不与IAD接触。在试验过程中将所有单元放在室温(22℃)下的血小板震动器(Helmer，Noblesville，IN)中。
测定每个IAD实施方式的补骨脂素的吸附动力学。在首先的8小时贮藏中间隔2小时移出每个血小板单元样品(约1mL)。然后通过高压液相色谱法分析这些样品中的残余补骨脂素水平。接着在室温下贮藏5天，测定每个单元中的血小板数、pH和溶解气体。也通过进行体外试验评价血小板功能，包括形状变化、集聚、低渗休克反应、GMP-140(p-分离蛋白表达)和形态得分。
图23显示了补骨脂素吸附动力学。在8小时培养过程中两个IAD将补骨脂素除去至HPLC试验定量的极限。相对于纤维IAD(2.5g)，由于颗粒IAD的更高量的吸附剂(约12g)因此具有更快的吸附动力学。
将血小板数、pH测定和体外血小板功能试验结果汇集在表21中。纤维和颗粒基质IAD都具有90％以上的血小板回收率。考虑到颗粒IAD含约12g MN-200，这一观察对该颗粒IAD有特别的影响。注意到含2.5g未经固定的吸附剂颗粒的除去设备典型地使得血小板5天损失25-35％。含12g未经固定的颗粒的设备因此如期除去＞50％的血小板。显而易见，将吸附剂固定在颗粒基质中大大降低了血小板损失同时补骨脂素除去动力学仍然非常快。
将体外血小板功能研究的结果汇集在表21下半个中。同样，两种IAD均显示出满意的结果。由于单个高测量值显示出大的标准偏差，因此低渗休克反应稍高于对照。与所有其它试验显示的性能基本相同，这些IAD在集聚试验中的确表现的很好。
表21.纤维基质和颗粒基质IAD的5天的血小板收率和体外血小板功能的比较


可以由本构型通过使液体更充分地渗透到介质中以改变盘的几何学，从而进一步将该颗粒基质IAD优化。较薄的盘将可以使用更少量的吸附剂获得相当的除去动力学。
除优化盘的几何学之外，润湿设备并且因此通过增加介质的润湿可以进一步提高该吸附动力学。在除去的最初阶段，UHMWPE基质的内在疏水性能使该设备润湿比较慢。能够用于提高润湿的策略包括使用润湿剂(例如，甘油、聚环氧乙烯、聚乙二醇、亲水聚合物)或经气体等离子体辉光放电处理。与润湿剂不同，经辉光放电处理可以直接用于改变UHMWPE粘合剂基质的表面化学。
权利要求
1．一种降低含细胞的生物组合物中生物反应调节物的浓度的方法，其中该方法基本上保留了生物组合物的所需生物活性，包括用一种设备处理该生物组合物，其中该设备包括含高吸附剂颗粒的惰性基质，并且其中吸附剂颗粒的直径范围在约100μm-约1500μm，并且其中将该设备用于批量过程。
2．根据权利要求1的方法，其中该生物反应调节物为活化补体。
3．根据权利要求1的方法，其中该设备的吸附剂颗粒为具有优良可湿性的聚芳香族吸附剂颗粒。
4．根据权利要求1的方法，其中该设备的吸附剂颗粒为由合成源得到的活性炭。
5．根据权利要求1的方法，其中该设备的惰性基质为合成聚合物纤维，并且其中该合成聚合物纤维包括被具有较低熔解温度的鞘包围的具有高熔解温度的聚合物核心。
6．根据权利要求1的方法，其中该设备的惰性基质为颗粒网络，并且其中该颗粒网络包括聚乙烯颗粒。
7．根据权利要求1的方法，其中该生物组合物包括血小板。
8．根据权利要求1的方法，其中该生物组合物包括红血球。
9．根据权利要求1的方法，其中该方法还降低生物组合物中补骨脂素衍生物或吖啶衍生物的浓度。
10．根据权利要求1的方法，其中该方法还降低生物组合物中染料或猝灭剂的浓度。
全文摘要
本发明提供了降低含细胞的生物组合物中低分子量化合物的浓度同时基本上保留了该生物组合物中所需的生物活性的方法和设备。该设备包括大量多孔吸附剂颗粒,并且这些吸附剂颗粒被惰性基质固定。
文档编号C07D219/10GK1284897SQ98813840
公开日2001年2月21日 申请日期1998年7月8日 优先权日1998年1月6日
发明者D·J·赫, T·A·番 申请人:塞鲁斯公司