干扰素同种型的转化方法及其产物的制作方法

专利名称：干扰素同种型的转化方法及其产物的制作方法
本文参考了多种出版物、专利及专利中请。这些出版物、专利及专利申请的内容在此引入供参。
背景天然蛋白质广泛用于研究和临床工作。尽管此类蛋白质可取自天然资源，但通过重组技术可从非天然资源中生产这些蛋白质。例如，对通过重组技术构建的微生物比如转化的细菌进行发酵，产生大量人类干扰素，其成本大大上低于利用天然资源可能花费的成本。该DNA重组技术也已用来生产其他的重要蛋白质比如胰岛素和组织纤溶酶原激活剂。
然而通过重组技术改变的细菌也产生污染物和意欲生产的蛋白质的结构同种型。这些污染物和结构同种型包括蛋白质寡聚体和还原型蛋白质同种型(见D’Andrea等人，美国专利号4,765,903)、细胞碎片和病毒(见Georgiadis等人，美国专利号4,732,683)和连有丙酮酸的同种型(见Rose等人，生物化学杂志(J.Bio.Chem)28719101(1992)；Prome等人，生物化学杂志26613050(1991)；Stevens等人，生物化学杂志2522998(1977)；和Shapiro等人，生物化学杂志2553120(1980))。需要在蛋白质纯化(过程)中去除这些污染物。
很明显，这些蛋白质同种型使所需蛋白质的纯度降低而此类同种型的去除工艺使总产量下降。但如果该蛋白质同种型能够转化成所需的蛋白质的话，就勿需去除之，且蛋白质的总产量会显著增加。需要一种鉴别非所需的蛋白质同种型并将其转化为所需蛋白质的方法。本发明即指此类需要。
在另一实施方案中，本发明提供将重组产生的附属同种型转化成所需蛋白质的方法，包括通过化学方法去除附属同种型的可断裂基团。
本发明并不限于所去除的该可断裂基团。在一实施方案中该可断裂基团包括丙酮酸。
本发明并不限于通过化学方法去除可断裂基团的方法。在一实施方案中，该方法包括将附属同种型置于酸性溶液内。当附属同种型是干扰素-α的丙酮酸附属同种型时，优选该酸性溶液的pH约为5.5。在此实施方案中，更优选该酸性溶液在34-40℃。而在另一实施方案中，将附属同种型置于锌离子溶液中。在一优选实施方案中，该锌离子溶液的pH为7.8-8.6。在更优选的实施方案中，该锌离子溶液是30-38℃。
本发明也并不限于所用酸性或锌离子溶液的类型。在优选实施方案中，该酸性溶液或锌离子溶液包括一种抗氧化剂。在尤其优选的实施方案中，该抗氧化剂包括蛋氨酸。在此实施方案中蛋氨酸的优选浓度是5-40mM。定义此处所用的术语“所需蛋白质”是指意欲纯化的感兴趣的蛋白质。对所需蛋白质的鉴别当然要受制于纯化过程的最终目的。例如，纯化过程期间可能需要在纯化工艺的中间步骤中获得一组或多组蛋白质，包括污染物。不管对获得中间蛋白质组的兴趣如何，作为纯化过程最终目的的蛋白质组被认为是所需蛋白质。
此处所用的术语“附属同种型”指结构和/或功能特性与所需蛋白质类似的蛋白质同种型，其中可将可断裂基团从该蛋白质中去除以产生所需蛋白质。“可断裂基团”理解为指可通过化学方法去除的、连在所需蛋白质上的化学基团。在此所用的“化学去除”或“通过化学方法去除”理解为指通过化学手段，包括但不限于酸性溶液、碱性溶液、金属离子催化等将化学基团自蛋白质上分离开来。
尽管不是实施本发明所必需的，如果能够对可断裂基团进行化学鉴别的话，附属同种型可以称作一种特定类型的附属同种型。例如，“丙酮酸附属同种型”是连有鉴定为丙酮酸的可断裂基团的所需蛋白质。
此处所用的术语“氧化反应”是指使两个半胱氨酸的巯基基团形成二硫键的反应。
此处所用的术语“干扰素-α”是指一类使靶细胞获得对病毒的抵抗力、抑制细胞增殖和调节MHC I型抗原表达的可诱导分泌的蛋白质家族。该家族包括，但不限于干扰素α-2a(Roferon，HoffmanLa-Roche，Nutley，NJ)、干扰素α-2b(Intron，Schering-P1ough，Madison，NJ)、干扰素α-2c(Berofor Alpha，BoehringerIngelheim，Ingelheim，Germany)或通过确定天然存在的干扰素α共有序列而定义的共有区干扰素。发明详述本发明涉及蛋白质的分离与纯化。在一实施方案中，本发明提供附属同种型的鉴别与纯化。在另一实施方案中，本发明提供自附属同种型产生所需蛋白质的方法。在还有一实施方案中，本发明通过共纯化该所需蛋白质和附属同种型并随即将该附属同种型转化为该所需蛋白质，提供高纯度的所需蛋白质。这样，附属同种型的数量下降而所需蛋白质的总产量提高，且/或纯度高于以前所得(产物)。该所需蛋白质的产量可以比附属同种型未经转化所得产量提高十倍。
尽管本发明并不限于该所需蛋白质或附属同种型的来源，但在一实施方案中，此来源是通过重组技术构建的微生物。有许多此类为本领域技术人员熟知的技术。此转化的微生物可以是真核或原核细胞、细菌、哺乳类细胞等。例如，通过遵循美国专利第4,530,901号Weissman的教导或通过欧洲专利申请公开EP032,134号所述技术，可以在细菌中生产干扰素。
同样，本发明并不限于从生产细胞中提取附属同种型的任何特定的方法。例如，当所需蛋白质是干扰素α时，Leibowitz等人在美国专利第4,315,852号和4,364,863号中所述的方法是合适的。
同样，本发明并不限于用以分离该附属同种型或所需蛋白质的特定纯化技术。许多层析技术和其他的分离方法对本领域技术人员而言是已知的，并可以在此应用。
虽然本发明并不限于鉴别附属同种型的方法，但可以通过研究所需蛋白质及分子量高于所需蛋白质的任何污染物的分子量来完成附属同种型的鉴别。Rose等人在生物化学杂志，26719101(1992)中叙述了一种此类方法。可将分子量高于所需蛋白质的污染物置于降解条件下(如pH极酸或极碱)并分析降解产物。若其中一种降解产物的质量和/或结构特性与所需蛋白质相同，则可认为该污染物是具有可断裂基团的附属同种型。
虽然本发明并不限于使附属同种型转化为所需蛋白质的特定方法，在一实施方案中，筛选工艺可以确定恰当的转化条件。例如，一种工艺需要逐步调整反应溶液的pH，直至可断裂基团脱离附属同种型而产生功能性或非-不可逆性变性的所需蛋白质。
还有，本发明并不限于化学去除可断裂基团的方法。在一实施方案中，通过将附属同种型置于酸性条件下(如应用醋酸)来去除该基团。在又一实施方案中，将附属同种型置于锌离子中。
本发明也并不限于进行断裂反应的温度。但一般而言，温度越高，附属同种型转化为所需蛋白质(的速度)越快。
虽然化学去除可断裂基团能够产生结构特性与所需蛋白质相同的蛋白质，但有时需要将还原型的巯基氧化成二硫键。这可使该蛋白质完成恰当的折叠，成为功能蛋白质。巯基的氧化方法在本领域已知，本发明并不限于特定的氧化方法。
在一实施方案中，本发明考虑在氧化过程中对蛋氨酸基进行保护以防止形成蛋氨酸亚砜。保护蛋氨酸基的方法在本领域是已知的，本发明并不限于保护蛋氨酸基的特定方法。但这些方法包括应用抗氧化物，如Lam等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)861250(1997)和Takruri的美国专利第5,272,135号中所述。
本发明并不限于完成氧化反应的方法。例如，在一实施方案中，本发明考虑在去除可断裂基团后氧化巯基。在另一实施方案中，本发明考虑在同样的反应条件下去除可断裂基团并氧化巯基。
同样，当在同一反应条件中去除可断裂基团并氧化蛋白质时，本发明并不限于任何特定的自附属同种型去除可断裂基团及氧化的方法。但在一实施方案中，通过筛选来确定化学去除可断裂基团的最佳条件。例如，可用一定范围的pH条件进行实验，并可测量结构足够完整(即非不可逆变性)的所需蛋白质的生成量和/或可断裂基团的量。对结构足够完整的所需蛋白质的量与反应pH(的关系)进行作图将得到一钟型曲线，其最高点表示化学去除可断裂基团的理想pH。在一此类实施方案中，可进行类似的氧化反应筛选。若化学去除反应与氧化反应的钟型曲线交叉的话，交叉点表示在同一反应中去除可断裂基团并氧化巯基的最佳pH条件。就干扰素-α之丙酮酸附属同种型的化学去除和氧化而言，两曲线在pH5周围交叉，表明进行联合反应的最佳pH。其他可以评估的反应条件包括但不限于盐浓度、温度等。
将附属同种型转化成所需蛋白质后，可能还需要进行层析步骤以便从污染物中纯化所需蛋白质。
所需蛋白质得以适当纯化后，可以制成适于药用的形式，如果需要的话。例如，当所需蛋白质为干扰素α时，Kwan的美国专利第4,847,079号及Yuen等人的美国专利第4,496,537号中所述的配方是合适的。或者，其他无效的药用载体可以为固体或液体。固体状制品包括粉剂、片剂、可分散颗粒、胶囊、面囊剂和栓剂。粉剂和片剂可包括约5％到95％的所需蛋白质。适当的固体载体为本领域所知，如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或乳糖。片剂、粉剂、面囊剂和胶囊可作为适于口服的固体剂量形式使用。
为制备栓剂，首先融化低融点蜡，比如脂肪酸甘油酯混合物(如可可黄油)，并通过搅拌使活性组分匀浆分散到其中。然后将融化的匀浆混合物倒入适当体积的模型中，使之冷却并固化。
液状制品包括溶液、悬浮液和乳浊液。例如，用于非肠道注射的水溶液或丙二醇水溶液或口服溶液、悬浮液和乳浊液所添加的增甜剂和透明剂。液状制品也可包括鼻内给药的溶液。
适于吸入的气溶胶制品可包括可与药用载体比如惰性的压缩气体联合在一起的溶液和粉状固体。
本发明的化合物也可以经皮传输。经皮组合物可以为乳脂、洗液、气溶胶和/或乳浊液形式，并可纳入本领域作此用途的传统基质或储存型的经皮膏药中。
单位剂量制品中活性化合物的数量可以是0.01mg左右到1000mg左右，优选0.01mg左右到750mg左右。或者，活性化合物可按照国际单位来制备，优选剂量在三百万到五千万国际单位之间。在一此类实施方案中，考虑(使用)三百万、五百万、一千八百万、两千五百万和五千万单位剂量形式。
意欲在临使用前转化成液状制品以便口服、局部给药或非肠道给药的固体形式也包括在内。
下列实施例用来说明本发明的某优选实施方案和方面，本发明的范围并不限于此实施例1丙酮酸附属同种型转化的筛选过程丙酮酸附属同种型可在细胞内形成，其中蛋白质N端氨基酸残基的α氨基与丙酮酸的羰基缩合在一起。如果丙酮酸干扰蛋白质的构象的话，则只有在该丙酮酸-蛋白质附属同种型水解(丙酮酸从蛋白质上脱离)的时候，蛋白质才能通过有利于热力学的构象改变自由再折叠成其所需的形式。若所需蛋白质含有二硫键的话，作为再折叠成所需形式的一部分，应使丙酮酸断裂所产生的还原型同种型发生氧化。
下列步骤说明如何确定使丙酮酸-蛋白质附属同种型转化成其所需形式的最佳条件。如前所论，若所需蛋白质没有二硫键，只需为了最大程度地断裂(水解)丙酮酸来进行筛选。若所需蛋白质有二硫键，需要不仅为了最大程度地断裂(水解)丙酮酸，也为了最大程度地形成二硫键(氧化)来进行筛选。
1)丙酮酸分析为理解丙酮酸断裂的动力学，需要分析丙酮酸以便检测水解程度。例如，可通过化学修饰方法或酶学方法对“自由”丙酮酸进行定量分析。2,4-二硝基苯肼(DNPH)可用来衍生丙酮酸。应使用合适的MWC0膜例如10K的膜对分析样品进行超滤以去掉丙酮酸-蛋白质附属同种型。在酸性pH下使滤过物与DNPH温育，后者可与“自由”丙酮酸反应。应用C8柱如Nucleosil C8柱(5μm)可轻松地在RP-HPLC上分析DNPH-衍化的丙酮酸，2,4-二硝基苯腙。
由于衍生反应是化学计量的，定量测量丙酮酸也成为可能，也可用酶学试剂盒(如乳酸脱氢酶/NADH)来测量丙酮酸。此方法勿需样品超滤，因为温育过程中其温和的条件不会使丙酮酸从丙酮酸-蛋白质附属同种型上断裂。
为测量自由丙酮酸和结合到蛋白质上的丙酮酸的总量，在衍生前应使所有结合的丙酮酸断裂。由于DNPH衍生方法需要极酸的pH和相对较长的温育时间，可以在温育过程中使丙酮酸断裂并随即用DNPH衍生。这样在DNPH衍化方法中为测量样品中自由和结合丙酮酸的总量应使用未经超滤的样品。
2)同种型分析有二硫键的蛋白质至少有三种同种型，无二硫键的蛋白质至少有两种同种型。大体而言，所需蛋白质及其还原型可轻松通过RP-HPLC分辨。
当蛋白质具有二硫键时，若三种同种型(附属同种型、还原型和所需蛋白质)能够通过RP-HPLC进行定量分析的话筛选会非常有效。并不一定需要分析丙酮酸，可能要鉴别何为限速步骤，若有的话。然而，从还原型分辨出丙酮酸-蛋白质附属同种型常常是困难的。在这种情况下，为优化每一转化步骤必须进行丙酮酸分析。
3)同种型组分的测量当所需形式没有二硫键时，不难确定同种型的组分，因为通过RP-HPLC可轻松地从所需形式中分辨出丙酮酸-蛋白质附属同种型。
当所需形式具有二硫键而蛋白质的附属同种型不能从其还原型中分离出来时，应测量结合到蛋白质上的丙酮酸以确定同种型组分。结合到蛋白质上的丙酮酸的摩尔数，即蛋白质附属同种型的数量，是自由和结合丙酮酸的总量减去自由丙酮酸的数量。这可在DNPH方法中应用经过或未经超滤的样品进行测量。然后，还原型的数量为通过RP-HPLC测量的蛋白质附属同种型和还原型的总量与通过丙酮酸分析测得的蛋白质结合性丙酮酸的数量之差。然后可以计算同种型组分。
4)筛选最适条件不论所需形式是否具有二硫键，筛选标准应是同样的，都是为了使附属同种型到所需形式的特定转化率达最大。
4.1)所需蛋白质无二硫键时这种条件下，当丙酮酸从丙酮酸-白质附属同种型上脱离后便形成所需蛋白质。在该情况下不须通过丙酮酸分析来检测丙酮酸的断裂，因为只有一步，水解，参与了附属同种型到所需形式的转化。例如，通过RP-HPLC检测附属同种型的消失和所需形式的形成便已足够。需要找出使附属同种型最大程度地转化成所需蛋白质的温育条件。
第一步是就筛选过程中使用的蛋白质附属同种型浓度的工作范围来研究反应动力学。若就附属同种型的浓度而言该动力学是一级的，则样品浓度对动力学没有影响，可以在筛选或参数评估时用任何浓度。否则，筛选过程中该浓度应为常数。
可以有许多影响水解步骤的参数。主要参数可以为pH、温度、金属离子(如锌、铁、亚铁，Cu、Mg等)、传导性、缓冲液、光和搅拌。通过测量一种温育参数对附属同种型到所需形式的转化率的影响，可以优化每一参数。例如，在足够范围内不同的pH条件下，温育几份含丙酮酸-蛋白质附属同种型的样品，其他所有的参数都是其相应的最佳假想值。经过一定的温育时间后(如过夜)测量每份的转化反应。转化率最高的pH视为最佳pH。重复进行此类实验来优化其他参数，使用已优化参数的最佳值来替代原来的最佳假想值。这是一般的优化技术。
温育的pH影响水解率。一般地，pH越低水解程度越高。温度升高水解率也提高。然而，当附属同种型或所需蛋白质发生不可逆性沉淀时或如果该蛋白质发生不可逆性变性的话，极酸pH如pH2条件下的水解便失去了意义。一些金属阳离子可催化水解(反应)。即便金属阳离子催化丙酮酸断裂，此类催化反应在很大程度上依赖于金属阳离子的浓度。这样，筛选金属阳离子时应使用极大范围的金属阳离子浓度。
参数之间也可能有相互作用。例如，当某种金属阳离子对转化有影响时，根据该离子存在与否可能会出现不同的最佳pH。就丙酮酸附属同种型而言，Zn阳离子的存在致使丙酮酸断裂的最佳pH不同(pH7.8-8.6)。这样，需要不仅使待优化的新参数而且使其他的重要参数同时作出改变，以便真正优化该参数。
4.2)所需蛋白质有二硫键时在两步转化方法中，经水解(反应)还原型自附属同种型上断裂并随即经氧化(反应)转化成所需形式。
理想而言，使蛋白质附属同种型和还原型分离开，再把上面就无二硫键的蛋白质所述的方法应用于每一附属同种型和还原型以便优化每一步骤。主要的不同在于除以上列举的参数外氧化步骤的氧转移和像氧化型谷胱甘肽(GSSG)的一些抗氧化剂可以得到优化。如果GS-SG仅使还原型氧化的话，会大大提高氧化率或二硫键的形成率。然而，若GS-SG也使附属同种型氧化且氧化型附属同种型不易水解，很可能会出现低产率或转化率。
从每一最佳条件可以估计出附属同种型转化为所需形式的最佳条件。如果它们适当相近，中间的条件设为最佳条件。理论上讲，根据样品中丙酮酸-蛋白质附属同种型与还原型的起使比例可以有不同的最佳条件。例如，附属同种型占决大多数时的最佳条件应不同于还原型占决大多数时的最佳条件。这样，应认识到从个别的最佳条件来估计水解和氧化的最佳条件时应把样品的组分考虑在内。
最后，用实验证实最佳转化条件。若有的话，鉴别限速步骤常常有助于调整最佳转化条件。还原型随温育时间的稳定积累表明氧化步骤是限速的。发生积累时，应使用更有利于氧化的条件比如更多的氧、更高的pH和更高的温度使所需形式的形成达到最大。如果虽然所需形式的形成率很明显但常常存在低水平的还原蛋白质，则断裂步骤是限速的。这时，可以改变温育条件以便提高断裂步骤(的速度)，从而使所需形式的形成达到最大。如果化学去除可断裂基团的最佳条件与蛋白质氧化的最佳条件相去甚远，则可逐步实施之。例如，首先使用水解步骤的最佳条件，水解几乎完成时再使用氧化步骤的最佳条件。
无法分离每一同种型时，必须分析丙酮酸，当两种同种型不能在RP-HPLC上分辨时尤其如此。通过监测丙酮酸的释放，可以首先优化水解步骤。第一步几乎完成或非常慢的时候再优化第二步。从这些最佳条件中估计出总体转化的最佳条件并用实验证实。另一种方法是在水解步骤优化之后优化总体转化。尤其是由于附属同种型显著并连续地水解而干扰第二步优化时，这种方法更实用。如前提及，pH、温度、氧转移、金属阳离子和氧化剂都是待优化的重要参数。
比起一步转化方法来，两步转化方法中参数之间的相互作用更加重要。
为证实此类最佳条件的参数对所需形式没有影响，应纯化所需形式并应对其性质，包括生物特性和纯度进行全面检查。实施例2丙酮酸附属同种型到干扰素-α2b的转化在升高的温度(30-37℃)和5.2-5.6的反应pH条件下丙酮酸断裂，二硫键形成。该反应条件是独一无二的，因为在同样的反应条件下两种反应顺序进行且生物活性蛋白质得到回收。
把从蛋白质分离层析洗脱的含有蛋白质UV吸收峰的组分收集在一起，0.45μM过滤除菌。
按照每升蛋白质3克蛋氨酸将其加到蛋白质收集样中，搅拌至溶解。用氢氧化钠稀释液调整其pH至5.2-5.6。氯化钠的浓度不作调整在150-200mM NaCl之间。
将由10mM醋酸(pH5.5)、200mM蛋氨酸和200mM NaCl组成的储存液加到蛋白质收集样中，使蛋氨酸的终浓度达20mM。
将蛋白质收集样转移到反应管中，提高温度至37℃并稳定搅拌。在36-38℃温育蛋白质收集样24-30个小时。
在第24-30小时时间点，用深度过滤器过滤反应混合物，然后用0.45 μ M的滤器除去沉淀。再浓缩蛋白质库并用10mM的醋酸(pH5.5)在2-10℃透析滤过。实施例3应用锌离子丙酮酸附属同种型到干扰素-α2b的转化在34℃、pH8.2并含有锌离子(1M)的条件下使附属同种型转化成干扰素-α2b。在反应过程中对反应溶液进行搅拌。转化率约为80％时，可将反应溶液的温度降至4℃以终止反应。
溶液配备1M Tris缓冲液4℃保存，1M Tris碱＋HCl，pH8.3，1mM Zn溶液4℃保存，1mM ZnS4H2O＋10mM醋酸钠＋175mM NaCl，pH5.5。
把从蛋白质分离层析洗脱的含有蛋白质UV吸收峰的组分收集在一起，0.2μM过滤除菌。缓慢将约0.083(V/V)1M的Tris缓冲液加到蛋白质库(一般蛋白质收集样(pool)的pH在5.2-5.5之间)中，搅拌至pH约8.2。
在搅拌的同时向碱性蛋白质收集样缓慢加入1mM锌离子溶液，使Zn阳离子与总体丙酮酸附属同种型的摩尔比达0.6到1，例如若丙酮酸附属同种型的浓度是1mg/ml，需30μM Zn或0.03(V/V)1mM Zn溶液。应用新鲜的Zn阳离子溶液。
搅拌时在反应器中将反应溶液加热至34℃。在反应过程中把反应温度控制在34℃。也需要连续搅拌以便使反应溶液充分混匀，但是不要过于猛烈而产生气泡。应使反应器通气以便将氧气转移至反应溶液中。另一方面，如果反应液约达反应器的一半满，该通风是没有必要的。在反应中，应用RP-HPLC可使反应样品接着转化。当反应结束时，使温度降至4℃进行下一步层析。
据前所论，很明显本发明提供鉴别非所需蛋白质同种型并将其转化为所需蛋白质的方法，其能够提高总的产量和所需蛋白质的纯度。
权利要求
1.一种提高干扰素-α组分之产量的方法，包括将附属同种型转化成干扰素-α。
2.权利要求1的方法，其中所说的附属同种型是丙酮酸附属同种型。
3.权利要求2的方法，其中所述的干扰素-α是干扰素-α2b。
4.权利要求3的方法，其中所述的附属同种型被置于酸性溶液中。
5.权利要求4的方法，其中所述的酸性溶液pH大约是5.5。
6.权利要求5的方法，其中所述的酸性溶液为34-40℃。
7.权利要求6的方法，其中所述的酸性溶液包括一种抗氧化剂。
8.权利要求7的方法，其中所述的抗氧化剂包括蛋氨酸。
9.权利要求8的方法，其中所述的蛋氨酸浓度为5-40mM。
10.权利要求3的方法，其中所述的附属同种型被置于锌离子溶液中。
11.权利要求10的方法，其中所述的锌离子溶液为pH7.8-pH8.6。
12.权利要求11的方法，其中所述的锌离子溶液为30-38℃。
13.权利要求12的方法，其中所述的锌离子溶液包括一种抗氧化剂。
14.权利要求13的方法，其中所述的抗氧化剂包括蛋氨酸。
15.权利要求14的方法，其中所述的蛋氨酸浓度为5-40mM。
16.权利要求9的方法，还包括应用层析技术纯化所述的干扰素-α2b。
17.权利要求16的方法，其中所述的层析技术包括以琼脂糖为基础的染料亲和层析，然后是琼脂糖为基础的阴离子交换层析，然后是结晶步骤。
全文摘要
本发明提供分离蛋白质的附属同种型并将其转化成所需蛋白质的方法。在优选实施方案中,本发明涉及应用酸性溶液或锌离子溶液来断裂所需蛋白质的化学基团。在更优选的实施方案中,本发明考虑(通过)使还原型巯基氧化的方法来断裂化学基团,形成所需的功能蛋白质。
文档编号C07K1/02GK1326465SQ99813213
公开日2001年12月12日 申请日期1999年10月5日 优先权日1998年11月12日
发明者S·坎农-卡尔松, A·弗雷, S·李, R·门吉森, M·沃洛克, D·C·怀利 申请人:先灵公司