疏水性多组分肝素结合物,其制备方法及其应用的制作方法

专利名称：疏水性多组分肝素结合物,其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及不溶于水但溶于特定有机溶剂的疏水性多组分肝素结合物，其制备方法及其应用。具体地，本发明涉及通过将聚合物和疏水物质与肝素共价结合而制备的疏水性多组分肝素结合物，其制备方法和应用，所述结合物作为抗血栓形成剂来用于治疗病人。
背景血管壁的血栓抗性需要能够兼容血小板和血浆凝固系统的内皮内层(endothelial lining)。不同于人造血管材料，在凝固过程中内皮内层不诱导丝氨酸蛋白酶活性。然而，当血液的凝固性增加时，内皮使凝血酶和其它可能的凝固因子失活。通常，已知凝血酶的嵌入点(inflow site)是在内皮细胞的表面(B.Awbrey等.J.Biol.Chem.，254，4092-4095，1979)，并且已知内皮细胞上的葡糖胺多糖层也存在凝血酶结合位点。有报道称如果这些凝血酶结合位点结合了酶例如丝氨酸蛋白酶，则这些酶在血清中被抗凝血酶III灭活(C.Busch等.，J. Clin.Invest.，69，726-729，1982；M.Dryjski等.，Thromb.Res.，32，355-363，1983)。
报道了在肝素分子中存在抗凝血酶结合的类似结构(J.A.Marcum等.，J.Clin.Invest.，74，341-350，1984；J.A.Marcum等.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，126，365-372，1985)后，将肝素引入进或引入到固体物质表面以产生内皮样血栓抗性性能的方法已被开发并商业化。通过使用肝素等已获得内皮样血栓抗性性能的人造表面可广泛用于医疗技术的开发。
这些研究中，开发了各种使用肝素来提高大分子表面的血液兼容性的方法。Grode等通过氰尿酰氯和辐射接枝合成了肝素-硅橡胶(Grode等.，J.Biomed.Mater.Res.Symp.，3，77-84，1972)。Merrill等也合成了聚乙烯醇，其通过戊二醛交联共价结合到肝素上(Merrill等.，J.Appl.Physiol.，29，723-728，1970)。Eriksson和Gillerg开发了交联的肝素单体，其中通过肝素交联和阳离子表面活性剂，带负电荷的肝素被吸收在聚丙烯表面(Eriksson和Gillerg，J.Biomed.Mater.Res.，1，301-312，1967)。
Goosen和Sefton合成了肝素化的苯乙烯-丁二烯-苯乙烯高弹体(Goosen和Sefton，Thromb.Res.，20，543-554，1980)。以及，Miyura等设计了通过将肝素固定在琼脂糖或多羟基甲基丙烯酸酯来延长血浆再钙化的方法(Miyura等.，J.Biomed.Mater.Res.，14，619-630，1980)。
Jacobs等合成了肝素和前列腺素E1的共价结合络合物(Jacobs等.，J.Biomed.Mater.Res.，23，611-630，1989)。上述肝素络合物通过二氨基末端的聚乙烯氧化物固定在尿烷上，这一固定的络合物对抑制凝血酶形成非常有效。Hennink等开发了肝素和人血清白蛋白的共价结合络合物(Hennink等.，Thromb.Res.，29，1-13，1983)。该络合物增加了与血液接触的大分子表面的血液兼容性。
Nagaoka等报道了固定在大分子表面的聚乙烯氧化物(PEO)亲水间隔臂(spacer)通过吸收血液蛋白和动态排斥抑制血小板粘附的动物试验结果(Nagaoka等.，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，10，76-78，1987)。固定在肝素化表面的间隔臂对血小板粘附的抑制作用被Kim和Ebert证实(Kim和Ebert，Thromb Res.，26，43-57，1982)。他们证实固定的肝素的抗凝活性依照间隔臂的长度而增加。
同样，Tay等提出1)长的间隔臂如PEO等使肝素与抗凝血酶III和凝血酶结合更容易；2)由聚乙烯醇末端基团连接的肝素比由肝素大分子非末端单元上的氨基连接的肝素更易接近；3)表面上的肝素单元阻止抗凝血酶III与凝血酶的增加(Tay等.，Biomaterials，10，11-15，1989)。
Schmer通过使用间隔臂如二氯硫化碳或碳二亚胺将肝素共价结合到琼脂糖上(Schmer，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，18，321-324，1972)，这一间隔臂固定的肝素具有提高的与抗凝血酶III结合的能力。Danishefsky和Tzeng通过使用氨乙基间隔臂制备了肝素-琼脂糖大分子(Danishefsky和Tzeng，Thromb.Res.，4，237-246，1974)。Park等通过使用PEO间隔臂将肝素固定在biomer上，他们报道了这类间隔臂的长度至少为3,400道尔顿以优化固定的肝素的抗凝活性(Park等.，J.Biomed.Mater.Res.，22，977-992，1988)。同样，将肝素固定在间隔臂表面以优化抗凝活性和增加间隔臂的表面密度(Lin等.，J.Biomed.Mater.Res.，25，791-795，1991；Piao等.，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，38，638-643，1992)。。
同样，使用肝素的间隔臂系统也用于合成共聚物。合成了三嵌段共聚物例如PEO-PDMS-肝素和PDMS-PEO-肝素(Grainger等.，J.Biomed.Mater.Res.，22，231-249，1988)。包被在链段聚氨基甲酸酯表面上的上述三嵌段共聚物即使在低流动性下也能增加非血栓形成能力(nonthrombogenicity)。Vulic等报道了聚氨基甲酸酯-PEO-肝素的合成方法(Vulic等.，J，Polym，Sci，A，Polym.Chem.，26，381-391，1988)，其是溶剂浇铸表面方法的改良方法。根据该方法，涂布是容易的，但合成肝素与聚氨基甲酸酯或聚乙二醇的络合物却不容易。并且，在合成过程中，它存在低效和需要大量溶剂以抑制肝素交联的问题。
为克服前述和其他缺点，我们，本发明的发明人，开发了含肝素和疏水性大分子的肝素络合物的合成方法，其中，肝素先与具有多官能团的大分子结合，然后与疏水物质结合。结果得到合成的不溶于水但溶于有机溶剂的疏水性多组分肝素结合物。最终，通过验证该疏水性多组分肝素结合物能容易地涂布到所有含有大分子或金属的医疗器械表面，并具有高的抗血栓形成活性，本发明得以实现。
发明摘要本发明的目的是提供不溶于水但溶于特定有机溶剂的疏水性多组分肝素结合物，其制备方法及其应用。


图1b是用疏水性多组分肝素结合物包被的玻璃的图片，表明用本发明的疏水性多组分肝素结合物改性的玻璃的血小板粘附实验的结果。
图2是表明血管导管的血液兼容性试验结果的图片，该血管导管表面用本发明的疏水性多组分肝素结合物改性。
(a)对照导管，(b)用疏水性多组分肝素结合物包被的导管。
优选实施方案的详细描述为实现这些目标，本发明提供了疏水性多组分肝素结合物，其中肝素与大分子和疏水物质结合。
本发明也提供了一种制备疏水性多组分肝素结合物的方法。
本发明还提供了疏水性多组分肝素结合物作为涂层剂用于所有医疗器械和人造器官表面改性的应用。
在下文中，详细描述了本发明。
本发明提供了疏水性多组分肝素结合物，其中肝素与大分子和疏水物质结合。
本发明的疏水性多组分肝素结合物是结合以包含多官能团的大分子的肝素，其中肝素和大分子的结合率可以被控制，并且肝素官能团中的胺基用于结合大分子。
肝素有羧基、羟基、磺酸基和胺基作为官能团。除胺基外的所有官能团处于抗血栓形成的活性位点，所以当这些官能团用于结合大分子时，这些肝素-大分子结合物将失去它们的抗血栓形成活性。
合成的大分子、蛋白质、生物聚合物和它们的混合物可用作含有前述多官能团的大分子。对于合成的大分子，可以使用聚二烯、聚烯、多炔、聚丙烯酸和它的衍生物、聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物、聚乙烯醚类、聚乙烯醇、聚乙烯卤化物、聚苯乙烯和它的衍生物、多氧化物类、聚醚、聚酯、聚碳酸酯类、聚酰胺类、聚氨基酸类、聚脲类、聚氨基甲酸酯类、聚亚胺类、聚硫化物类、多磷酸盐、聚硅氧烷类、聚倍半硅氧烷类、聚杂环类、纤维素和它的衍生物、多糖及它们的共聚物或衍生物。对于蛋白质，可以使用鱼精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它的衍生物或共聚物。和，对于生物高聚物，可以使用多糖、明胶、骨胶原、藻酸盐、透明质酸、藻酸、角叉菜聚糖、软骨素、果胶脱乙酰壳多糖(pectin chitosan)和它的衍生物或共聚物。除上述提及的之外，所有含有多官能团的大分子均可使用。
本发明的疏水性多组分肝素结合物是通过将肝素和含有多官能团的大分子结合，然后又结合疏水物质来制备。结果，通过结合含有多官能团的许多大分子，肝素分子形成结合物，疏水物质结合于多官能团上。这样，不参与结合的许多官能团能与疏水物质反应。最终，本发明的疏水性多组分肝素结合物具有疏水性，因为肝素结合了疏水大分子。
本发明的疏水性多组分肝素结合物不溶于水中，但溶于特定有机溶剂中，例如四氢呋喃和DMAC(二甲基乙酰胺)。这样，本发明的疏水性多组分肝素结合物可以用溶剂蒸发的方法很容易地合成，并且通过浸涂或喷雾方法它们也能很容易地涂布到大分子或金属表面。并且，对于临床应用，由于它们的水不溶性，可稳定使用本发明的疏水性多组分肝素结合物。
本发明的疏水性多组分肝素结合物中的肝素即使被基质包被后仍保留它的抗血栓形成活性，因此它可以抑制可能出现在包被基质表面的血液凝固。因此，本发明的疏水性多组分肝素结合物提高了包被表面的抗血栓形成作用。另一方面，肝素含有很多阴离子，这样当增加表面的水吸收能力时，显著降低了包被表面的摩擦系数。因此，通过用本发明的疏水性多组分肝素结合物涂布来改性它们的表面，可提高与血液接触的人造器官和医疗器械例如导管或插管的质量，从而使血栓引起的副作用最小化。
本发明还提供了一种疏水性多组分肝素结合物的制备方法，包括如下步骤1)大分子的活化步骤2)肝素与活化的大分子结合的步骤3)疏水物质与结合肝素的大分子官能团的结合步骤。
然而已有的方法是合成三嵌段共聚物，其中肝素与聚氨基甲酸酯和聚乙二醇结合，本发明的方法包括多步骤过程，包括接枝共聚物的合成，其中肝素与大分子和疏水物质结合。根据本发明，大分子本身不需要具有疏水性。疏水性多组分肝素结合物的结构不同于三嵌段共聚物的结构。三嵌段共聚物具有肝素结合于PEG-聚氨基甲酸酯链末端的形式，但是本发明的疏水性多组分肝素结合物具有含有多官能团的大分子与肝素本身结合，然后疏水物质与大分子官能团结合的形式。
作为第一步中的大分子，可使用合成的大分子、蛋白质、生物高聚物和它们的混合物。特别是，优选含有多官能团的大分子。可以使用聚二烯、聚烯、多炔、聚丙烯酸和它的衍生物、聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物、聚乙烯醚类、聚乙烯醇、聚乙烯卤化物、聚苯乙烯和它的衍生物、多氧化物类、聚醚、聚酯、聚碳酸酯类、聚酰胺类、聚氨基酸类、聚脲类、聚氨基甲酸酯类、聚亚胺类、聚硫化物类、多磷酸盐、聚硅氧烷类、聚倍半硅氧烷类、聚杂环类、纤维素和它的衍生物、多糖及它们的共聚物或衍生物作为合成的大分子，和鱼精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它的衍生物或共聚物可用作蛋白质。另外，作为生物高聚物，可以使用多糖、明胶、骨胶原、藻酸盐、透明质酸、藻酸、角叉菜聚糖、软骨素、果胶脱乙酰壳多糖和它的衍生物或共聚物。此外，所有含有多官能团的大分子均可使用。
为活化上述大分子，在本发明的优选实施方案中，通过使用N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)活化大分子的羧基(COOH)，同样，也可使用1-乙基-3-二甲基氨丙基-碳二亚胺氢氯化物(EDC)或4-对-叠氮水杨基酰氨基-丁胺(ASBA)。
在步骤2中，优选肝素的分子量为1,000-1,000,000道尔顿，可用相同的方法使用重组肝素、肝素衍生物和肝素类似物。通过使用羟基、胺基、硫醇基和叠氮基形成的共价键用于肝素与活化大分子的结合。优选共价键为非降解键例如酰胺键和氨基甲酸乙酯键，或可降解键例如酯键和酐键。
在步骤3中，优选与大分子结合的疏水物质的水溶性少于100mg/ml，并具有至少一个官能团。十八胺(ODA)，链烷胺(alkanoic amine)，胆汁酸，甾醇或链烷酸可用作疏水物质，可使用所有具有官能团和疏水性的其他物质。通过使用羟基、羧基、胺基、硫醇基和叠氮基形成的共价键用于使疏水物质与结合了肝素的大分子的官能团相结合。优选上述共价键是非降解键例如酰胺键和氨基甲酸乙酯键(urethane bond)，或可以是可降解键例如酯键和酐键本发明还提供了疏水性多组分肝素结合物的应用。如上述所提及，本发明的疏水性多组分肝素结合物能通过溶剂蒸发方法很容易地合成，并且它们也能通过浸涂或喷雾方法很容易地涂布到大分子或金属表面。对于临床应用，本发明的疏水性多组分肝素结合物由于它们的水不溶性而能被稳定地使用。
本发明的疏水性多组分肝素结合物包被的基质具有高的抗血栓形成活性，因为它能抑制血液凝固，并具有显著降低包被表面的摩擦系数并增加表面的水吸收能力的性能。
因此，通过用本发明的疏水性多组分肝素结合物包被来改性它们的表面可改进人造器官和医疗器械例如与血液接触的导管或插管，并通过使用本发明的疏水性多组分肝素结合物可最小化由血栓引起的副作用。
然而，可以理解，考虑在本公开的基础上，那些本领域的技术人员可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。实施例1肝素、聚丙烯酸和十八胺结合物的合成<1-1>聚丙烯酸的活化5g聚丙烯酸(在下文中表示为“PAA”)加入到250ml N，N-二甲基甲酰胺(在下文中表示为“DMF”)中并溶解，随后在冰浴中冷却。向上述混合溶液中，迅速加入溶解了15.5g N，N-二环己基碳二亚胺(在下文中表示为“DCC”)的25ml DMF溶液。在向上述混合物中迅速加入含8.7gN-羟基琥珀酰亚胺(在下文中表示为“HOSU”)的25ml DMF溶液后，经5分钟搅拌后，DCC被活化。随着反应的进行，N，N-二环己基脲(在下文中表示为“DCUrea”)逐渐生成并沉淀。反应24小时后，通过用0.2μm孔径膜过滤除去DCUrea，并将混合溶液于5℃放置12小时，之后，用与上述相同的方式过滤并完全去除少量的残留DCUrea。通过室温蒸发溶剂，去除DMF。向上述溶液中，加入500ml甲醇并搅拌5小时，此后用0.2μm膜过滤除去未反应的DCC和HOSU残余物。室温下真空干燥6小时除去甲醇，最终得到8.7g白色粉末。<1-2>肝素-聚丙烯酸-十八胺结合物(肝素/PAA/ODA＝1∶1∶20，摩尔比)的合成将0.11g在上述实施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100mlDMF中，5分钟内向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，产生了沉淀—肝素和活化的PAA结合的中间产物，并且溶液变浑浊。5小时后，将含0.13g十八胺(在下文中表示为“ODA”)的350ml THF溶液5分钟内逐渐加入到该溶液中，室温放置反应5小时。通过上述步骤，开始产生白色沉淀并且在反应后30分钟内完成该生成过程。反应完成后，400ml THF和蒸馏水通过室温蒸发溶剂被从该溶液中除去，并通过用纤维素酯膜和丙酮作为溶剂经透析除去未反应的残留ODA。随后，用水替代丙酮并用0.45μm过滤膜过滤，以除去未反应的残留肝素。将以上得到的白色沉淀真空干燥12小时。结果得到0.45g白色粉末。<1-3>肝素-聚丙烯酸-十八胺结合物(肝素/PAA/ODA＝1∶5∶100，摩尔比)的合成将0.55g在上述实施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100ml DMF中，5分钟内向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，产生了沉淀—肝素和活化的PAA结合的中间产物，并且溶液变浑浊。5小时后，将含0.67g ODA的350ml THF溶液5分钟内缓慢加入到该溶液中，室温放置反应5小时。通过上述步骤，产生白色沉淀并且在30分钟内完成该生成过程。反应完成后，400ml THF和蒸馏水通过室温蒸发溶剂被从上述溶液中除去，并通过用纤维素酯膜和丙酮作为溶剂经透析除去未反应的残留ODA。随后，用水替代丙酮溶剂并用0.45μm膜过滤，以除去未反应的肝素。将从此步骤得到的白色沉淀真空干燥12小时，得到1.1g白色粉末。<1-4>肝素-聚丙烯酸-十八胺结合物(肝素/PAA/ODA＝1∶10∶200，摩尔比)的合成将1.11g在上述实施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100ml DMF中，5分钟内向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，产生了沉淀—肝素和活化的PAA结合的中间产物，并且溶液变浑浊。5小时后，将溶解了1.35g ODA的350ml THF溶液5分钟内逐渐加入到该溶液中，室温放置反应5小时。最后，产生白色沉淀并且在30分钟内完成该生成过程。反应完成后，400ml THF和蒸馏水通过室温蒸发溶剂被从该混合溶液中除去，并同样通过用纤维素酯膜和丙酮作为溶剂经透析除去未反应的ODA。随后，用水替代丙酮溶剂并经0.45μm膜过滤除去未反应的肝素。将从此步骤得到的白色沉淀真空干燥12小时，得到2.0g白色粉末。实施例2肝素、鱼精蛋白和脱氧胆酸结合物的合成<2-1>脱氧胆酸的活化11.8g脱氧胆酸(在下文中表示为“DOCA”)溶解在100ml DMF中，然后在冰浴中冷却。向该混合溶液中迅速加入溶解了7.4g DOC的25mlDMF溶液。搅拌5分钟，DCC被活化并向其中迅速加入溶解了4.14gHOSU的25ml DMF溶液。随着反应的进行，DCUrea逐渐沉淀。反应24小时后，用0.2μm膜过滤除去DCUrea，并于5℃下放置该溶液12小时，之后通过与上述相同的方式过滤来完全除去少量的残留DCUrea。100ml乙腈加入到DMF经室温蒸发溶剂除去的反应液中，产生白色固体沉淀。经0.2μm膜过滤，随后室温下真空干燥5小时获得该白色固体沉淀，得到12.5g活化的DOCA。<2-2>疏水鱼精蛋白(鱼精蛋白-DOCA)的合成将0.5g鱼精蛋白溶解在50ml蒸馏水中，并向其中逐渐加入含有0.27g在上述实施例<2-1>中获得的活化的DOCA的50ml DMF溶液。室温放置该溶液5小时，同时进行了结合反应。通过在室温下蒸发溶剂从上述混合溶液中除去DMF和蒸馏水，之后用100ml蒸馏水洗涤溶液三次以除去未反应的鱼精蛋白，并得到白色固体沉淀。用100ml甲醇洗涤固体沉淀。通过用0.45μm膜过滤除去未反应的活化的DOCA后，通过真空干燥得到白色粉末。利用在100ml，1.0重量％乙醛溶液和在100ml，50％甲醇溶液中进行1小时封闭反应除去未反应的残留鱼精蛋白氨基酸残基。反应完成后，用蒸馏水洗涤三次除去未反应的乙醛并真空干燥，得到0.55g DOCA部分偶合鱼精蛋白的疏水鱼精蛋白(鱼精蛋白-DOCA)。<2-3>鱼精蛋白-DOCA的酯化将0.5g上述实施例<2-2>中得到的活化的鱼精蛋白-DOCA溶解在80ml DMF中，并立即加入含有1.5g DCC的10ml DMF溶液。搅拌5分钟，DCC被活化并向其中加入含有0.84g HOSU的10ml DMF。随着反应进行，少量DCUrea沉淀。室温反应24小时后，DCUrea通过用0.2μm膜过滤除去，DMF也通过室温下蒸发溶剂从上述溶液中除去。用100ml甲醇洗涤从那里获得的白色粉末两次，并用0.2μm膜过滤，以得到白色固体。室温下真空干燥该固体5小时。结果，得到0.45g通过酯化活化的疏水鱼精蛋白(鱼精蛋白-DOCA)。<2-4>肝素-鱼精蛋白-DOCA结合物的合成将0.5g在上述实施例<2-3>中得到的活化的鱼精蛋白-DOCA溶解在100ml DMF溶液中，并加入含有0.92g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，通过缩合反应化合的沉积物被沉淀，沉积物在30分钟内产生完全。反应继续进行5小时，通过室温下蒸发溶剂从上述反应溶液中除去蒸馏水和DMF，从而得到白色粉末。通过用纤维素酯膜和甲醇作为溶剂经透析除去未反应的活性鱼精蛋白-DOCA。用水替代甲醇，用0.45μm膜过滤，除去未反应的肝素。将从那里得到的白色沉淀在室温下真空干燥12小时，最后得到1.05g白色粉末。实施例3肝素、鱼精蛋白和甘氨胆酸结合物的合成<3-1>甘氨胆酸的活化将9.3g甘氨胆酸(在下文中表示为“GOCA”)溶解在100ml DMF中，加入含6.6g DCC的25ml DMF溶液，搅拌5分钟，DCC被活化并向其中加入溶解了3.7gHOSU的25ml DMF溶液。随着酯化反应的进行，DCUrea逐渐出现并缓慢沉淀。室温反应24小时后，用0.2μm膜过滤除去DCUrea，并进一步将溶液在5℃放置12小时以使其余的DCUrea沉淀。用上述同样的方式除去剩余量的沉淀的DCUrea。室温下将溶液浓缩至15ml，并向其中加入100ml乙腈以沉淀白色固体。通过用0.2μm膜过滤该固体获得白色粉末，随后真空干燥5小时。最后，得到7.0g活化的GOCA。<3-2>疏水鱼精蛋白(鱼精蛋白-GOCA)的合成将0.5g鱼精蛋白溶解在50ml蒸馏水中，并向其中缓慢加入含有0.31g在上述实施例<3-1>中获得的GOCA的50ml DMF溶液。室温下进行结合反应5小时后，将该混合溶液进行溶剂蒸发以除去蒸馏水和DMF。然后，用100ml蒸馏水洗涤溶液三次。结果，除去未反应的鱼精蛋白并得到白色固体沉淀。用100ml甲醇洗涤获得的沉淀并用0.45μm膜过滤，以除去未反应的活性GOCA。通过将其真空干燥得到白色粉末。将上述白色粉末加入含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中1小时，在期间进行封闭反应。从中彻底去除残留的未反应的鱼精蛋白氨基酸残基。反应完成后，用蒸馏水洗涤溶液三次，并真空干燥。最后，得到0.6g其中GOCA部分结合鱼精蛋白的疏水鱼精蛋白-GOCA。<3-3>鱼精蛋白-GOCA的酯化将0.5g在上述实施例<3-2>中得到的鱼精蛋白-GOCA溶解在80mlDMF中，并立即加入含有1.5g DCC的10ml DMF溶液。在搅拌5分钟期间，DCC被活化，并另外加入溶解了0.84g HOSU的10ml DMF溶液。随着反应进行，少量DCUrea沉淀。室温反应24小时后，用0.2μm膜过滤该溶液以去除DCUrea，并通过室温下蒸发溶剂以除去DMF。用100ml甲醇洗涤从那里获得的白色粉末两次，并用0.2μm膜过滤，得到白色固体沉淀。通过将其室温下真空干燥5小时，得到0.4g通过酯化活化的疏水鱼精蛋白-GOCA。<3-4>肝素-鱼精蛋白-GOCA结合物的合成将0.5g在上述实施例<3-3>中获得的活化的鱼精蛋白-DOCA溶解在100ml DMF中，并与溶解了0.78g肝素的50ml蒸馏水混合5分钟。反应开始后30分钟内，通过缩合反应得到的沉淀，并在30分钟内完全产生过程。室温反应5小时后，上述溶液通过蒸发溶剂除去蒸馏水和DMF。用纤维素酯膜和甲醇作为溶剂经透析从获得的白色粉末中去除未反应的活性鱼精蛋白-GOCA。用水替代甲醇，并用0.45μm膜过滤溶液，以除去未反应的肝素，得到白色沉淀。在室温下真空干燥沉淀12小时，最后得到0.9g白色粉末。实施例4肝素、多熔素和DOCA结合物的合成<4-1>多熔素和DOCA结合物的合成将1.0g多熔素(在下文中表示为“PLL”)溶解在50ml蒸馏水中，缓慢加入溶解了0.98g活化的DOCA的50ml DMF溶液。结合反应进行5小时后，溶液在室温下进行溶剂蒸发，以除去蒸馏水和DMF。用100ml蒸馏水洗涤溶液三次以除去未反应的PLL，导致生成白色固体沉淀。用100ml甲醇洗涤固体沉淀，并用0.45μm膜过滤以除去未反应的活性DOCA。将该沉淀进一步真空干燥以得到白色粉末。将白色粉末加入到含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中1小时，在期间进行封闭反应。结果，除去了残留的未反应的PLL氨基酸残基。反应完成后，通过用蒸馏水洗涤三次除去未反应的乙醛，并进一步真空干燥，得到1.5g其中DOCA部分结合PLL的疏水PLL-DOCA。<4-2>PLL-DOCA的酯化将1.0g在上述实施例<4-1>中得到的PLL-DOCA溶解在80ml DMF中，然后缓慢加入含有2.0g DCC的10ml DMF溶液。搅拌5分钟，DCC开始被活化，再加入含有1.12gHOSU的10ml DMF溶液。随着反应进行，产生少量的DCUrea。室温反应24小时后，用0.2μm膜过滤溶液以去除DCUrea，并在室温下蒸发溶剂以除去DMF。用100ml甲醇洗涤从那里获得的白色粉末两次，并用0.2μm膜过滤，以得到白色固体沉淀。在室温下真空干燥沉淀5小时。结果，获得0.9g通过酯化活化的PLL-DOCA。<4-3>肝素-PLL-DOCA结合物的合成将0.7g在上述实施例<4-2>中得到的活化的PLL-DOCA溶解在100ml DMF中，并在5分钟内加入溶解了0.95g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，开始产生通过缩合反应化合的沉淀，并在30分钟内完全产生过程。室温反应5小时后，蒸发溶剂以除去蒸馏水和DMF，得到白色粉末。用纤维素酯膜和甲醇作为溶剂经透析除去未反应的活性PLL-DOCA。然后，用水替代甲醇，并用0.45μm膜过滤该溶液以除去未反应的肝素，得到白色沉淀。在室温下真空干燥沉淀12小时，最后得到1.1g白色粉末。实施例5肝素、PLL和GOCA结合物的合成<5-1>PLL和DOCA(PLL-GOCA)结合物的合成将1.0g PLL溶解在50ml蒸馏水中，向其中缓慢加入溶解了0.98g在上述实施例<3-1>中获得的活化的GOCA的50ml DMF溶液。室温进行结合反应5小时后，将溶液在室温下进行溶剂蒸发，以除去蒸馏水和DMF。然后，用100ml蒸馏水洗涤剩余溶液三次以除去未反应的PLL，得到白色固体沉淀。用100ml甲醇洗涤上述固体沉淀，并用0.45μm膜过滤以除去未反应的活性GOCA，并进一步真空干燥。结果，得到白色粉末。通过在含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中进行1小时封闭反应来除去未反应的残留在PLL中的氨基酸残基。反应完成后，用蒸馏水洗涤溶液三次以除去未反应的乙醛。通过将其真空干燥，得到1.5g其中GOCA部分结合PLL的疏水PLL-GOCA。<5-2>PLL-GOCA的酯化将1.5g在上述实施例<5-1>中得到的PLL-GOCA溶解在100ml DMF中，然后迅速加入溶解了1.45g DCC的10ml DMF溶液。搅拌5分钟，DCC被活化。此外，加入溶解了1.67g HOSU的10ml DMF溶液。随着反应进行，产生少量的DCUrea。室温反应24小时后，用0.2μm膜过滤除去DCUrea，并在室温下蒸发溶剂以除去DMF。用100ml甲醇洗涤获得的白色粉末两次，并用0.2μm膜过滤，得到白色固体。然后，在室温下真空干燥白色固体5小时，最后得到1.3g通过酯化活化的PLL-GOCA。<5-3>肝素-PLL-GOCA结合物的合成将1.0g在上述实施例<5-2>中得到的活化的PLL-GOCA溶解在100mlDMF中，然后在5分钟内加入含有0.95g肝素的50ml蒸馏水。反应开始后30分钟内，开始产生通过缩合反应化合的沉淀，溶液变浑浊。该产生过程在30分钟内完成。反应5小时后，将溶液在室温蒸发溶剂以除去蒸馏水和DMF，得到白色粉末。用纤维素酯膜和甲醇作为溶剂经透析从白色粉末中除去未反应的活性PLL-GOCA。然后，用水替代甲醇，并通过用0.45μm膜过滤溶液除去未反应的肝素。将从那里获得的白色沉淀在室温下真空干燥12小时，得到1.6g白色粉末。实施例6疏水性多组分肝素结合物的分析<6-1>用FT-IR谱进行结构分析为分析按照上述方式合成的疏水性多组分肝素结合物的结构，检查FT-IR谱(红外光谱，Perkin Elmer Ltd.)。结果，对于在实施例<1-3>中合成的肝素/PAA/ODA结合物，C＝O双键，酰胺键在红外光谱170cm-1范围很显著，肝素的羟基在3500cm-1范围，ODA的甲基在波长2800-2900cm-1范围也都很显著。<6-2>疏水性多组分肝素结合物的涂层将1.0ml共溶剂(THFN，N-二甲基乙酰胺，1∶1体积/体积％)加入到25mg在实施例<1-3>中合成的疏水性多组分肝素结合物中，直到总的浓度达到2.5重量％，然后在40℃用超声波处理溶液1小时，得到透明溶液。在25℃由聚氨基甲酸酯制备的血管导管(直径2.5cm，长度5cm)和玻璃(0.5cm×0.5cm)的表面每个使用浸涂法用上述溶液涂层。将用疏水性多组分肝素结合物涂层的导管和玻璃在室温下干燥30分钟，随后在室温下真空干燥5小时，完全除去残留溶剂。尽管玻璃或导管的涂层表面有点模糊，但没有观察到沉淀现象。<6-3>涂层的多组分肝素结合物在水溶液中的剥离检测将各自用与上述实施例<6-2>相同的方法，用来自上述实施例<1-3>的疏水性多组分肝素结合物涂布的玻璃和导管放到装有10ml PBS(pH＝7.5，I＝0.15)的falcon试管中，并在37℃、100rpm震荡12小时。当反应完成时，加入蓝色(azure)A溶液(10mg/ml水)，完成染色反应(H.J.Conn，“Biological Stains”，The Williams和Wilkins.，MD，96-105页，1961)。结果，在染料溶液中未检测颜色变化。因此，可以证实如果肝素/PAA/ODA，本发明的疏水性多组分肝素结合物被用作涂层材料，它们对材料如玻璃或其它高聚物具有很高的粘附度，而在水溶液中却无由于膨胀而产生的剥离现象。<6-4>蓝色A试验将在上述实施例<6-3>中检测了剥离的玻璃或导管浸入5ml蓝色A溶液(10mg蓝色A/ml水)，随后将溶液在室温放置5小时，随着时间的推移，用疏水性多组分肝素结合物涂布的材料表面显示颜色改变，5小时后，染料溶液变为深紫色。同时，其他没有被疏水性多组分肝素结合物涂布的材料未显示颜色改变。基于这些事实，可以确定疏水性多组分肝素结合物已稳固粘附到材料表面，同时保留了肝素特有的特性和抗血栓形成活性。<6-5>接触角分析将用与上述实施例<6-2>相同的方式，用疏水性多组分肝素结合物(2.5重量％)涂布的导管(5cm)和未涂布的导管浸入10ml蒸馏水中，室温放置5分钟。结果，用本发明的疏水性多组分肝素结合物涂布的导管观察到水扩散。另一方面，未涂布的导管的水扩散降低尽管它的水接触角增加。<6-6>血小板粘附试验对于血小板粘附试验，从兔子身上分离出血小板缺乏的血浆(在下文中表示为“PPP”)。更具体地，用乙醚麻醉重2.5-3.0kg的新西兰兔(Sunrise Scientific Co.)，然后，用心脏穿孔法，用50ml注射器抽出36ml血液。事先在注射器中放入4ml 3.8％的柠檬酸钠以防止血液凝固。将血液在4℃以1440rpm离心10分钟，得到新鲜兔子的PPP。血浆中的血小板浓度用Coulter记数器(Coulter electronics Ltd，UK)测定，优选血小板浓度为4.2×105细胞/μl。分离出的PPP在制备后3小时内用于试验。
用本发明的疏水性多组分肝素结合物(2.5重量％)涂布的玻璃(0.5×0.5cm)和未涂布的对照玻璃放入每个含有1ml分离的新鲜兔子PPP的试管中，放置在37℃搅拌水浴中1小时。1小时后，从每个管中去除PPP，玻璃用PBS洗三次已彻底除去PPP。为了固定血小板，每一上述玻璃用3ml 2.5％戊二醛处理4小时，然后，根据如下步骤用乙醇(EtOH)水溶液洗涤。步骤15ml 50％乙醇1小时，步骤25ml 80％乙醇1小时，和步骤35ml 100％乙醇1小时。用液氮处理每个除去乙醇的玻璃，随后冻干6小时。用SEM观察每一玻璃以检查血小板粘附。结果，确认同对照玻璃相比，用本发明的疏水性多组分肝素结合物涂布的玻璃的血液兼容性大幅度提高。<6-7>血液凝固试验对于血液凝固试验，分离小鼠的全血。具体地，用乙醚麻醉重250-300g的Sprague-Dawley鼠(Korea Biolink)，然后，用心脏穿刺法，用50ml注射器取3.6ml血。事先在注射器中放入0.4ml 3.8％的柠檬酸钠以防止血液凝固。血液取出后马上用于试验。
用25mg根据上述实施例<3-1>合成的疏水性多组分肝素结合物涂布的血液导管和其他未涂布的导管浸入上述制备的小鼠全血中1小时，然后，用1st蒸馏水轻柔地洗涤，然后马上照相。结果，在浸泡1小时后，用本发明的疏水性多组分肝素结合物涂布的导管显示根本没有血液成分的凝集，而未涂布的对照导管有很强的血液成分凝集。
工业实用性如上所示，本发明的疏水性多组分肝素结合物只溶解在特定的有机溶剂中，并且通过溶剂蒸发、浸涂或喷雾的方法，它们能被很容易地涂布到大分子或金属表面上。同时，该结合物不溶于水，所以在涂布后它们能稳定地用于临床治疗。而且，本发明的疏水性多组分肝素结合物在涂布于基质上后，保留了它们原有的抗血栓形成活性的特性。更准确地说，结合物通过抑制涂布表面的血液凝固提高了涂布表面的抗血栓形成活性。同样，本发明的疏水性多组分肝素结合物通过降低涂布表面的摩擦系数和增加涂布表面的水吸收能力而导致涂布基质变得充分湿润。因此，本发明的疏水性多组分肝素结合物作为抑制血栓的副作用并改善接触血液的人造器官和医疗器件例如导管、插管等的表面的涂层剂是非常有用的。
那些本领域的技术人员可以理解在上述说明书中公开的概念和具体实施方案易于作为修改或设计实现本发明的相同目的的其他实施方案的基础。那些本领域的技术人员也可以理解这类等同的实施方案未脱离如后附的权利要求所阐明的本发明的精神和范围。
权利要求
1.疏水性肝素结合物，其中大分子和疏水物质与肝素结合。
2.如权利要求1中所述的疏水性肝素结合物，其中疏水性肝素结合物是疏水性多组分肝素结合物，其中大分子和疏水物质被多重结合。
3.如权利要求1中所述的疏水性肝素结合物，其中大分子选自合成的大分子、蛋白质、生物高聚物和它们混合物。
4.如权利要求3中所述的疏水性肝素结合物，其中合成的大分子选自聚二烯，聚烯，聚乙炔，聚丙烯酸和它的衍生物，聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物，聚乙烯醚类，聚乙烯醇，聚乙烯卤化物，聚苯乙烯和它的衍生物，多氧化物类，聚醚，聚酯，聚碳酸酯类，聚酰胺类，聚氨基酸类，聚脲类，聚氨基甲酸酯类，聚亚胺类，聚硫化物类，多磷酸盐，聚硅氧烷类，聚倍半硅氧烷类，聚杂环类，纤维素和它的衍生物，和它们的共聚物或衍生物。
5.如权利要求3中所述的疏水性肝素结合物，其中蛋白质是选自鱼精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它们的衍生物或共聚物。
6.如权利要求3中所述的疏水性肝素结合物，其中生物高聚物选自多糖、明胶、骨胶原、藻酸盐、透明质酸、藻酸、角叉菜聚糖、软骨素、果胶脱乙酰壳多糖和它们的衍生物或共聚物。
7.如权利要求1中所述的疏水性肝素结合物，其中疏水物质具有多于一个的反应官能团并且结合大分子后水溶性低于100mg/ml。
8.如权利要求7中所述的疏水性肝素结合物，其中疏水物质选自十八胺(ODA)，链烷胺，胆汁酸，甾醇，链烷酸和它们衍生物。
9.如权利要求1中所述的疏水性肝素结合物，其中肝素选自重组肝素，肝素衍生物和肝素类似物。
10.一种制备权利要求1的疏水性肝素结合物的方法，其包含下述步骤1)将大分子与肝素结合；2)将疏水物质与结合以肝素的大分子的官能团相结合。
11.如权利要求10中所述的制备方法，其中权利要求10步骤(1)中肝素和大分子的结合是利用效应物的共价键结合，所述效应物选自羟基，羧基，胺基，硫基和叠氮基。
12.如权利要求10中所述的制备方法，其中权利要求10步骤(2)中大分子和疏水物质的结合是利用效应物的共价键结合，所述效应物选自羟基，羧基，胺基，硫基和叠氮基。
13.如权利要求10中所述的制备方法，其中步骤(1)和步骤(2)的共价键选自非降解键如酰胺键和氨基甲酸乙酯键，和可降解键例如酯键和酐键。
14.一种涂层剂，其在用权利要求1的疏水性肝素结合物来改性人造器官和医疗器械表面中是有用的。
全文摘要
本发明提供了不溶于水但溶于有机溶剂的疏水性肝素结合物，其制备方法及其应用。具体地，本发明提供了通过使肝素与聚合物和疏水物质共价结合而制备的疏水性肝素结合物。本发明的疏水性肝素结合物保留良好的抗血栓形成作用，并且由于其疏水性而不溶于水，因此它们能有效地用作改性医疗器件表面的涂层剂。
文档编号C08B37/00GK1455687SQ00819986
公开日2003年11月12日 申请日期2000年11月3日 优先权日2000年10月24日
发明者边荣鲁, 文炫兑 申请人:韩国美大富历寿株式会社