专利名称:新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法
本发明涉及一种新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生产方法，尤其涉及一种新的芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)，该菌能在最适pH5.0至5.5、最适温度55℃条件下经培养产生α-1，6-葡萄糖苷酶，另外还涉及一个生产上述新的α-1，6-葡萄糖苷酶的生产过程，其中包括培养上述菌种并收集α-1，6-葡萄糖苷酶。
α-1，6-葡萄糖苷酶具有对淀粉类中的α-1，6-葡萄糖苷键发生作用以产生直链淀粉的能力，并且广泛用于制糖工业，生产麦芽糖、葡萄糖和高果糖玉米糖浆(HFCS)。
α-1，6-葡萄糖苷酶长期以来发现于高等植物和微生物酵母体中，但近期有报道许多细菌可以产生这种酶，例如产气杆菌(Aerobactor aerogenes)，中间埃希氏菌(Escherichia intermedia)，假单孢菌(Pseudomonas amyloderamosa)，缓症链球菌(Sterptococcus mites)，噬纤维菌(Cytophage)，链霉菌属(Sterptomyces)和α-叶红呋喃菌属(Flavochromogenes)等。
另外，在产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌种中，已知的种类有蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(IFO 300)，芽孢杆菌(Bacillus fermus)(IFO 300)，芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)等。
大多数已知的α-1，6-葡萄糖苷酶具有中性或弱碱性的最适pH值，不适于在糖化工业中使用，工业上的糖化作用一般在酸性条件下进行。
已知由假单孢菌(Pseudomonus amyloderamora)，芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)等产生的α-1，6-葡萄糖苷酶具有酸性最适pH值，但是由于抗温性差，前者是不能实际使用的;同时后者菌体培养时间需长达60～70小时，所以是不经济的。
因此，本发明人试图寻找具备抗温性、酸性的最适pH值和高的α-1，6-葡萄糖苷酶产量的微生物。
在发现一种新的芽孢杆菌的基础上，本发明人完成了本发明。这是一由本发明人新近在土壤微生物中发现的芽孢杆菌(Bacillus)，它经过10～15小时短时间的培养再收集其产物能够得到大量的α-1，6-葡萄糖苷酶。
根据本发明的一个方面，提供了一种生产α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，其中包括培养能产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)使其在培养条件下产生α-1，6-葡萄糖苷酶，然后收集所述的α-1，6-葡萄糖苷酶，它具有如下酶化学性质(1)反应该酶对α-1，6-葡萄糖苷酶键起作用并产生线性淀粉;
(2)底物专一性该酶对多糖具有下列相对活性多糖 相对活性(%)支链淀粉 100可溶性玉米淀粉 13可溶性淀粉 6.7牡蛎糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米淀粉 3.8马玲薯淀粉 4.0(3)米氏常数值(Km)和对支链淀粉的Vmax∶该酶的Km值为0.14mg/ml，Vmax值为70.0μmol/min/mg蛋白质;
(4)最适pH5.0～5.5(5)pH稳定性该酶在pH范围4.5～6.0、温度40℃条件下可稳定30分钟;在pH值5.0～6.0，温度50℃也可稳定30分钟;
(6)最适温度约5.5℃;
(7)热稳定性该酶在pH值为4.5条件下，分别以不同温度处置30分钟所得结果表明在40℃时，该酶仍保留其初始活性的80%;60℃时活性则为10%;
(8)抑制剂的影响作用对氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸钠至少可抑制该酶活性的70%，但不受邻-菲咯啉或氰铁酸钾的抑制;
(9)金属盐类的影响作用该酶几乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+或Mn2+的影响，受Fe3+的抑制，并且Hg2+和Ag2+可使其失活;还有(10)分子量约95，500(用SDS电泳法测得)。
图1至5显示本发明的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化学性质，图1中的曲线图显示最适pH值，图2中的曲线图显示在40℃(○)和50℃(·)时的稳定pH范围，图3中的曲线图显示最适温度值，图4中的曲线图显示热稳定值，图5中的曲线图在55℃(○)、60℃(□)和65℃(·)及在不同pH条件下酶的稳定性。
用于本发明的α-1，6-葡萄糖苷酶生产菌是一个新的菌种，被本发明人命名为(Bacillus sectorramus)芽孢杆菌。该菌种于1987年9月4日保存号FERM BP-1471(原始保存号码FERM P-8973，贮存于1986年9月22日)贮存于日本工业学技术暑发酵研究所(of 1-3，Higashi 1-chome，Yatabemachi，Tsukuba-gun，Ibaraki 305，Japan)，贮存条件符合“以专利程序为目的的微生物贮存国际认可布达佩斯公约”，该菌种在下文中将命以“主题菌种”(Subject strain)。
主题菌种具有下列细菌学特性A.形态(1)细胞形状 杆状(2)细胞大小 1.0～1.3×1.5～5.2μ(3)迁移率 无(4)孢子 呈现(5)革兰氏染色 阳性(6)耐酸反应 阴性B.在不同培养基上生长(1)标准琼脂板培养基菌落为环形并具整齐外缘。表面平滑为半透明灰白色。
(2)标准琼脂斜面培养基沿培养基直着生长并具平滑的表面、奶黄色具光泽，生长适中。
(3)标准液体培养基轻微混浊并具粉状沉淀物。无色素形成。
(4)标准明胶穿刺培养基直的并无液化作用。
(5)石蕊牛乳无变化。
C.生理学特性(1)硝酸盐还原作用 阳性(2)脱氮作用 阳性(3)甲基红试验 阳性(4)乙酰甲基甲醇的形成 阴性
(5)吲哚的形成 阴性(6)硫化氢的形成 阴性(7)淀粉的水解 阳性(8)柠檬酸的同化 阳性(9)无机氮源的同化(硝酸盐和铵盐) 阳性(10)色素的形成 阴性(11)脲酶活性 阴性(12)氧化酶活性 阴性(13)过氧化氢酶活性 阳性(14)生长范围pH值 4.0～7.1温度 45.5～15.0℃(15)对氧的行为 厌气性(16)二氧化丙酮的形成 阴性(17)马尿酸的分解 阴性(18)精氨酸的分解 阴性(19)苯丙酸的脱氨基作用 阴性(20)温度抗性(85℃，10分钟) 阳性(21)氯化钠抗性 7% 阴性3.5% 阳性(22)在Sabouraud氏琼脂培养基中生长 阳性(23)在0.001%溶菌酶培养基中生长 阳性(24)酪氨酸的分解 阳性(25)在柠檬酸胺琼脂培养基中的碱性生成作用 阳性(26)酪蛋白的分解 阴性(27)明胶的分解 阴性
(28)在厌气性培养基中生长 阳性(29)在Mc Conkey氏培养基中生长 阴性(30)卵磷脂酶反应 阴性(31)在VP培养基中产碱能力 阴性(32)糖的同化作用和产酸能力(a)L-阿拉伯糖 阳性(b)D-木糖 阳性(c)D-葡萄糖 阳性(d)D-甘露糖 阳性(e)D-果糖 阳性(f)D-半乳糖 阳性(g)麦芽糖 阳性(h)蔗糖 阳性(i)乳糖 阴性(j)海藻糖 阳性(k)D-山梨[糖]醇 阴性(l)D-甘露[糖]醇 阴性(m)肌醇 阴性(n)甘油 阳性(o)淀粉 阳性(p)密二糖 阳性(q)水扬苷 阴性(r)乙醇 阳性参考Bergey氏细菌学鉴定手册，Wiuiams & Wilkins公司，第8版(1974)和国际系统细菌学杂志，1974-1986年，以及该菌所具有的革兰氏阳性，存在有孢子和厌气性生长等特性，由上述特性检索表可揭示该细菌是芽孢杆菌属中的一种。
主题菌种不同于芽孢杆菌属中的任何一种，但与蜡状芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌相似，由于其细菌相对较厚，为1.0～1.3μ。
然而这些菌种与本发明之菌种可依如下几点区分开来。
蜡状芽孢杆菌生长于7%的普通盐中，并在卵黄反应、酪蛋白分解和明胶分解作用中呈阳性但主题菌种不在7%的普通盐中生长并且在卵黄反应、酪蛋白分解和明胶分解中呈阴性。
另外巨大芽孢杆菌也生长于7%的普通盐中，并且酪蛋白分解和明胶分解呈阳性结果，但主题菌种不能在7%普通盐中生长而且酪蛋白分解和明胶分解呈阴性结果。
进一步讲，主题菌种还可与芽孢杆菌属中一个新的菌种芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(于日本专利公开号No.43994/1986中有描述)区分开来，列于表1
表1主题菌种 Bacillusacidopullulyticus)芽孢杆菌氧气要求 厌气性 厌气性对普通盐抗性 可在3.5%普通盐 不能在3.5%普通盐中生长 中生长酪氨酸的分解 阳性 阴性柠檬酸盐的同化 阳性 阴性通过甘露[糖]醇的产酸作用 阴性 阳性VP反应 阴性 可变的酪蛋白的分解 阴性 可变的通过阿拉伯糖和木糖的产酸作用 阴性 可变的营养细胞的厚度 1.0-1.3μ 0.6-1.0μ因此，如上所述，主题菌种作为一种新菌种而区别于芽孢杆菌属中任何已知的和从前经过命名的菌种。
以下将对通过培养主题菌种来生产和收集α-1，6-葡萄糖苷酶的条件作出说明。
首先，是一个含有各种适量无机盐并能为支链淀粉酶提供高活性的合适的培养基;其中还具碳源如淀粉-可溶性淀粉，蜡质淀粉、土豆淀粉和水解过的淀粉，像甘露糖和糊精;氮源如水解后的蛋白质，像多胨、肉汤、酵母浸出液、玉米浆、二氨基磷酸盐、酪蛋白、大豆蛋白质等。
将主题菌种接种在如上所述的培养基中，调pH至4.0～7.0，在20～45℃条件下以静止或有气条件下摇动、或通气搅拌的方法对菌种进行培养1～2天(若10～20小时效果最佳)。
经过培养，将细胞移出液体培养基，得到的上清部分经浓缩得到支链淀粉酶粗品。该制备物用硫酸铵分馏，然后经过γ-环状糊精-cephalose6B亲和层析，再利用SDS-聚炳烯酰胺凝胶电泳纯化为单带。其中γ-环状糊精同Sepharose 6B(商品名，Pharmacia精密化学公司)反应生成亲合层析的基物。如下所述为经纯化后的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化学特性。
1.反应该酶作用于α-1，6-葡萄糖苷键产生直链淀粉。
2.米氏常数Km和对底物的Vmax本发明之酶对底物支链淀粉、马玲薯支链淀粉和玉米支链淀粉的Km值(mg/ml)和Vmax值(μmol/min/mg蛋白质)列于表2之中表2底物 Km Vmax支链淀粉 0.14 70.0马玲薯支链淀粉 3.3 10.65玉米支链淀粉 3.4 10.97
3.对多糖类的相对活性表3显示该酶对可溶性玉米支链淀粉，可溶性淀粉、牡蛎糖元、野兔糖元、玉米支链淀粉和马玲薯支链淀粉所具有的相对活性，相对于支链淀粉的活性。
表3多糖类 相对活性(%)支链淀粉 100可溶性玉米支链淀粉 13.5可溶性淀粉 6.7牡蛎糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米支链淀粉 3.8马玲薯支链淀粉 4.04.最适pH在25毫摩尔柠檬酸和50毫摩尔的磷酸氢二钠缓冲溶液中，其最适pH为5.0～5.5(见图1)。
5.pH稳定性在25毫摩尔柠檬酸-50毫摩尔磷酸氢二钠缓冲溶液中，当pH范围在4.5～6.5时，该酶可在40℃条件下稳定存在30分钟;当pH范围在5.0～6.0时，温度50℃可稳定存在30分钟(参见图2)。
6.最适温度在50毫摩尔乙酸缓冲液中(pH4.5)，该酶的最适温度约55℃(参见图3)。
7.热稳定性在不同温度下于50毫摩尔乙酸缓冲液(pH4.5)中分别处置30分钟，结果该酶在40℃时保持其原始活性的80%;但在60℃时则为10%(参见图4)。
8.活性试验4毫升0.5%支链淀粉溶液(pH4.5)加入1毫升酶溶液，反应在40℃下进行30分钟。然后加2毫升Somogyi溶液，将混合物加热20分钟后冷却。冷却后，加入1毫升钼砷酸氨，加水至总体积为25毫升。以厚度为1厘米测该溶液在500纳米时的吸光率。在上述条件下，以每分钟还原相当于1微摩尔葡萄糖的活性确定为一个活性单位。
9.抑制剂的影响作用对氯汞苯甲酸(PCMB)或SDS可抑制该酶活性的70%甚至更多，但其活性不受邻菲咯啉或氰铁酸钾的抑制。各种不同抑制剂的影响作用见表4，其中显示了当温度40℃，在50毫摩尔乙酸缓冲液(pH4.5)中均用1毫升抑制剂处理30分钟后，该酶所保留的相对活性。
表4抑制剂 保留的活性(%)无 100EDTA 93.1邻菲咯啉 109.0PCMB(对氯汞苯甲酸) 27.1N-乙基顺丁烯二酰亚胺 65.5氰铁酸钾 102.0SDS 1.5-碘乙酸 66.5
10.金属盐的影响作用该酸几乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+和Mn2+等的影响，受Fe3+的抑制，Hg2+和Ag+可使其失活。各种不同金属盐的影响作用见于表5，其中显示当40℃时，在50毫摩尔乙酸缓冲液中分别用与5毫摩尔的金属盐作用30分钟的结果。
表5金属盐 保留的活性(%)无 100MgCl2·6H2O 91.3MgCl2·4H2O 85.9CoCl287.7CaCl279.1SrCl274.5NiCl2·6H2O 102.7BaCl298.9FeCl2·nH2O 82.1CuCl2·2H2O 73.4ZnCl297.3HgCl20AgCl 2.7SnCl2·2H2O 82.1CdCl2·2 1/2H2O 92.4
FeCl357.811.分子量大约95.500(用SDS电泳法)。
如下所示，本发明所得酶明显区别于日本专利公开号No.174，089/1982(下文称之为酶A)所公开的那种酶。
1.本发明的生产菌种是芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)它是芽孢杆菌属中一种新的菌种而酶A的生产菌是芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)。
2.根据本发明，该酶的最适温度为55℃而酶A的则是60℃。
3.考查在不同pH值和温度时的酶活性，如图5所示该主题酶在不同温度时活性表现出很大的差异。另外在酶活性对pH值依赖性方面，其活性在pH值为5.0时出现蜂值，并随pH值的增加或减少活性迅速下降。酶A在这方面与该酶的行为则完全不同。
4.在最适pH值方面，同pH范围为3.5～5.5的酶A相比较，本发明的酶具有很窄的pH最适范围5.0～5.5并具有很高的专一性。
因此可以断定由本发明所得α-1，6-葡萄糖苷酶是不同于酶A的一种新酶。
可在以葡糖淀粉酶作用淀粉制备葡萄糖的过程中，加入本发明所得α-1，6-葡萄糖苷酶，达到改善产率的目的;或与β-淀粉酶一起用于从淀粉生产甘露糖的过程中以增加产率。
现以如下实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1将芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接种在含下列成分的培养基上可溶性淀粉 1.5%肉汤 0.5%(NH4)2HPO40.3%K2HPO40.1%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 5.5然后在37℃，于Sakaguchi氏瓶中摇荡培养20小时，从培养液中得到一种活性为8.1u/ml的支链淀粉酶。经离心去除固体物质和细胞，所得上清液用超滤性膜浓缩。接着加入冷乙醇达到浓度为80%使该酶沉淀，离心分离沉淀并且冷冻干燥得到淀粉的支链淀粉酶。
实施例2将芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接种在含下列成分的培养基上甘露糖 2%酵母浸出液 0.5%K2HPO40.2%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 4.5
填充在一个30升的发酵罐中，在37℃下，充气搅拌培养16小时，从培养液中获取一种活性为13.6u/ml的支链淀粉酶。经离心去除液体中的固体物质和细胞，用超滤性膜将所得上清液浓缩约20倍得到200u/ml(pH4.5)的支链淀粉酶液体粗品。将该粗品用硫酸铵分馏再经过γ-环状糊精-Sephalose 6B亲合层析制得76.7u/mg蛋白质的纯化酶制品。
实施例3将芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接种在含下列成分的培养基上蜡状淀粉 2%多胨 1%K2HPO40.2%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 5.0填充在一个1000升的罐中，在37℃下，充气搅拌培养15小时，从培养液中得到一种活性为18.2u/ml的支链淀粉酶。将该液体按与实施例2相似的方法处理制得大约26升约300u/ml支链淀粉酶的液体粗品。
试验实施例1用于糖化作用的底物玉米淀粉(33克/分升，消光度8.0)。用于糖化作用的酶Gluczyme(Amano Pharmaceution co.，Ltd)(2.5u/g D.S.)。
主题酶由实施例3所得支链淀粉酶液体(0.1u/克D.S.)
糖化作用温度 62℃糖化作用在上述条件下进行，并于不同时间以高效液相色谱法(HPLC)检测其中单糖(G1)、双糖(G2)、三糖(G3)和多糖(Gn)的含量。对照反应不使用主题酶，在相同的糖化条件下进行检测，所得结果汇总于表6。
表6反应时间 糖类 加入酶 对照24小时 G1(单糖) 92.6% 90.9%G2(双糖) 2.4% 2.3%G3(三糖) 0.6% 0.4%Gn(多糖) 4.4% 6.4%48小时 G1(单糖) 95.3% 94.2%G2(双糖) 2.7% 0.3%G3(三糖) 0.6% 0.3%Gn(多糖) 1.4% 2.9%72小时 G1(单糖) 95.3% 94.7%G2(双糖) 3.2% 3.1%G3(三糖) 0.6% 0.4%Gn(多糖) 0.9% 1.8%
通过对新菌种芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)短时间的培养，本发明可以生产出一种新的α-1，6-葡萄糖苷酶，并因此使得大量经济的生产热稳定的α-1，6-葡萄糖苷酶成为现实，同时为淀粉糖化工业作出贡献。
权利要求
1.一种产生α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，其中包括对能够产生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌(Bacillus sectorramus)的培养使其在营养培养基本产生α-1，6-葡萄糖苷酶，集聚具备下列酶化学特性的该α-1，6-葡萄糖酶(1)反应该酶作用于α-1，6-葡萄糖苷键产生线性淀粉；(2)底物专一性该酶对多糖类具如下相对活性多糖 相对活性(%)支链淀粉 100可溶性玉米淀粉 13.5可溶性淀粉 6.7牡蛎糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米淀粉 3.8马玲薯淀粉 4.0(3)米氏常数值(Km)和对支链淀粉的Vmax值该酶Km值为0.14毫克/毫升，Vmax值为70.0μmol/min/mg蛋白质；(4)最适pH∶5.0～5.5(5)pH稳定性该酶在40℃pH范围4.5～6.5时可稳定30分钟，50℃pH范围5.0～6.0时可稳定30分钟；(6)最适温度约5.5℃；(7)热稳定性该酶在pH值为4.5条件下，分别以不同温度处置30分钟所得结果40℃时该酶仍保留其初始活性的80%，而在60℃时则为10%(8)抑制剂影响作用对氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸钠至少可抑制该酶活性的70%但该酶不受邻菲咯啉或氰铁酸钾的抑制；(9)金属盐的影响作用该酶几乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+或Mn2+的抑制，受Fe3+的抑制并且Hg2+和Ag+可令其失活；还有(10)分子量约95，500(SDS电泳法测得)；并回收所述的α-1，6-葡萄糖苷酶。
专利摘要
新的α-1，6-葡萄糖苷酶具下列酶学性质
文档编号C12N9/44GK87106597SQ87106597
公开日1988年4月6日 申请日期1987年9月26日
发明者中井国治, 塩崎正义, 辻广二, 森茂治, 广濑进, 横井信正, 大矢隆一 申请人:天野制药株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan