专利名称：：用于siRNA传送的化学改性的聚阳离子聚合物的制作方法用于siRNA传送的化学改性的聚阳离子聚合物本申请要求2006年1月23日提交的美国临时专利申请号60/761,182以及2006年3月29日提交的美国临时专利申请号60/787,057目的。、口、"5、、乡
背景技术：
：基因的非病毒的传送系统已经受到增加的注意，因为人类基因治疗的日益实现。阳离子的类脂配制成脂质体，可溶的阳离子聚合物已经证明是易于络合基于核酸的药物并在体外有效地传送其进入细胞。细胞水平上的主要障碍是内体膜，其可以是由通过触发(flip-flop)机制的阳离子的类脂克服(Xu等人，BiochemistryVol.3508),第5616页(1996》或者通过所谓质子海绵机制的阳离子的聚合物克服(Boussif,PNASVol.92(16),第7297页(1995))。质子海绵假设说明，在内体中pH下降期间，聚合物可能用作緩冲剂，因此需要更多质子以达到大约5的最终pH。这导致增加氯化物计数离子以及水的输入，其最后导致小疱的爆裂和其内含物释放进入细胞质。体外和体内显著的毒性常常是与阳离子聚合物和类脂有关。在细胞水平，阳离子的电荷致使膜损伤，运载体可能造成坏死和细胞凋亡。在体内水平，阳离子电荷导致结合细胞血液组分如红血球和/或与血清蛋白和血管内皮非特异性有关。RES的非常快速清除率防止试剂到达介入所预期的解剖学位点。已经发展策略来解决这些不期望的特性如用蛋白质和隐形分子如PEG屏蔽电荷以及连接预期用于治疗的细力包的活性草巴向配体。最可接受的及广泛使用的基因传送的聚合物之一是聚乙烯亚胺(PEI)。已经描述了具有;f艮多期望性质的用于基因传送的可降解的PEI衍生物(D.W.Pack,BioconiugateChemistry,第14巻，第934页(2003年))，同非降解的25,000分子量PEI相比，具有16倍更强的基因传送活性，并具有低毒性。其是这样合成的，通过使用分枝的PEI800,使其与1,6-己二醇二丙烯酸酯在1:1摩尔比例下以Michael形式反应。得到的分子量是约30,000，基于质子NMR计，结构具有很多生物可降解的酯键。在pH5时，降解的半衰期是30小时。在相关的研究中，使用乙酸酐部分乙酰化的聚乙烯亚胺产生最高至21倍增强的基因传送活性，没有改变聚合物的细胞毒性(D.W.PackPharmaceuticalResearch,第21巻，第365页(2004年))。用于基于多核香酸药物如DNA的治疗性传送的其他形式的可降解的聚合物，已经使用不同胺的迈克尔加成至不同的二丙烯酸酯获得(Langer等人，JACS,第123巻,第8155-8156页，(2001年)；JACS,第122巻,第10761-10768页，(2000年))。在此情况下，最终载体产品具有酯键，没有可参与N-酰化反应的伯胺或仲胺；聚合物骨架中酯键的存在提高了生物可降解性。Klibanov等人(PharmaceuticalRes.第22巻,第373-380页，(2005年))的研究使用两种不同的交联剂，即，辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)和乙二醇二[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯](EGS),把423-Da和2kDaPEI连接到DNA的更高分子量载体上。交联剂DSS在与PEI的胺反应之后，产生酰胺键并保持脂族骨架，其原本连接两个胺反应基团(活性酯)作为载体结构的部分。这就产生了酰胺键，并保持脂族骨架作为部分结构。使用EGS和PEI也产生酰胺键，但是因为其结构，该载体也具有酯键。Klibanov等人要求，用EGS制得的物质在基因传送中是由DSS制得的物质的有效性的30倍。Klibanov等人提出"基于EGS的结合物的更高生物降解性促进DNA的释放(运载体未填充)，因此增强了DNA的转录可用性"。理想地，最佳的非病毒载体应该是具有低毒性和高基因传送效率的强聚合物。本发明聚合物的主要优点是传送宽范围的核酸的能力。当标准聚合物如PEI25kDa在质粒DNA传送中是有效时，其在siRNAs传送中是无效的，甚至在更高聚合物剂量时观察不到实际上的基因表达敲除OCim等人BioconiugateChemistry第17巻,第241-244页，2006年)。对于线性PEI而言，文献是有点是矛盾的(Hassani等人JGeneMedicine,第7巻，第198-207页，2005年；Urban-Klein等人GeneTherapy,第12巻，2005年)，然而，来自文献和申请人进行的实验的数据指出线性PEI22kDa适于敲除短暂地转染的基因；然而，不适于在稳定转染的细胞系中产生强的敲除。与这些标准试剂相反，本发明的聚合物能够在短暂及稳定转染细胞系中实现敲除，并在质粒传送中显示高效。总之，需要一种非病毒的核酸载体系统，其具有作为市售产品稳定性增加、低毒性、转染有效，如果分子量保持低下被肾潜在清除的能力、通过酰胺键的生物可降解性的优点，和借助其使耙向和隐形配体可以进行化学连接的众多伯胺和仲胺
发明内容发明概述根据本发明的一个方面，提供了具有通式I的化合物[聚阳离子~[L]b-[聚阳离子L]d其中聚阳离子是聚乙烯亚胺；L是非酯的连接体部分；a是约l-约20的整数；b是约1-约IO的整数；c是约l-约20的整数；和d是约1-约1000的整数。优选地，PEI是低聚乙烯亚胺(OEI)。式I的聚阳离子可以任选具有相同的聚阳离子重复或者也可以具有不同的聚阳离子重复的组合。"L"或式I的连接体是含非酯的连接体部分。适合的含非酯的连接体包括，但不限于酰氨基连接体部分、氨基连接体部分、羰基连接体部分、氨基甲酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、琥珀酰胺基(succinamidyl)连接体部分及其组合。连接体部分结合到聚阳离子中所含的胺基。在优选的实施方案中，含非酯的连接体部分是丙酰基单元，被定义为由以下代表的化学基团-CH2-CHR'-CO-N-，其中R'是H或烷基。在一个更优选的实施方案中，非酯连接体是P-氨基丙酰基酰胺连接体部分。在另一个实施方案中，式I的化合物进一步包含络合至化合物的生物分子。生物分子可以具有一个或多个阴离子基团并可以与式I或Ia化合物形成离子键。具有一个或多个阴离子基团的生物分子的实例包括核酸(例如，DNA、单链RNA、双《逄RNA、核酶、DNA-RNAbybridizer、siRNA、anitosenceDNA及反义寡4亥苷f复(antisenceligo))、蛋白质、肽类、类脂类和碳水化合物。而进一步的实施方案提供了一种转染真核细胞的方法，该方法包含用这样的式I的化合物和生物分子接触细胞，借此传送生物分子至细胞。此方法可以涉及治疗哺乳动物，包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，向该哺乳动物给药这样的化合物。在优选的实施方案中，生物分子是siRNA，其中siRNA是有效降4氐有义(interest)基因的表达。另一个实施方案提供了药用组合物，其包含式I的化合物及生物分子。另一个实施方案进一步提供了具有通式Ia的化合物b——[聚阳离子〗c]其中聚阳离子是聚乙烯亚胺；L是非酯连接体部分；S是间隔基或不存在；A是试剂或不存在；a是约l-约20的整数b是约1-约10的整数c是约1-约20的整数；和d是约1-约1000的整数。L或式I的连接体是含非酯的连接体部分。适合的含非酯的连接体包括，但不限于酰氨基连接体部分、氨基连接体部分、羰基连接体部分、氨基曱酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、琥珀酰胺基连接体部分及其组合。该连接体部分被结合到聚阳离子中所含的胺基团上。在优选的实施方案中，含非酯的连接体部分是丙酰基单元，被定义为由以下^表的化学基团-CH2-CHR'-CO-N-，其中R'是H或烷基。在一个更优选的实施方案中，非酯连接体是(3-氨基丙酰基酰胺连接体部分。S是间隔基或不存在。间隔基可以是例如取代的或未取代的、饱和或不饱和的烃链及取代或未取代的、饱和或不饱和的#皮至少一个杂原子9如氧、氮和^e危中断的烃链。优选地，烃链包含2-20个-灰原子，更优选是2-10个碳原子，最优选是2-6个碳原子。适合的间隔基也可以包括，但不限于聚乙二醇(PEG)。A是可以促进真核细胞中的一种或多种功能例如受体识别、内在作用、生物分子从细胞内体逃脱、细胞核固定(nucleuslocalization).生物分子释放、和系统稳定的试剂。治疗剂可以包括，但不限于细胞毒素剂如紫杉醇、内含体溶解剂(endosomolyticagent)、疏水聚合物包括但不限于苯甲酰基和月桂酰基(lauryl)、靼向部分及屏蔽剂。屏蔽剂可以包括但不限于亲水实体，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乳糖、糖和聚丙烯基酰胺(polyacrylaminde)。革巴向配体包4舌，〃f旦不限于运4失蛋白、表皮生长因子、叶酸盐、肽类、抗体或其片段、糖类及整联蛋白-结合实体如RGD肽类。在另一个实施方案中，式Ia的化合物进一步包括络合至该化合物的生物分子。生物分子可以具有一个或多个阴离子基团并可以与式Ia化合物形成离子键。具有一个或多个阴离子基团的生物分子的实例包括核酸(例如，DNA、单链RNA、双链RNA、核酶、DNA-RNAbybridizer、siRNA、anitosenceDNA及反义寡核苷酸)、蛋白质、肽类、类脂类和碳水化合物。在另一个实施方案中，式Ia的化合物进一步包括生物分子和络合至该化合物的试剂(即，屏蔽剂、靶向剂和/或传送增强剂)，任选包括间隔基。而另一个实施方案提供了一种转染真核细胞的方法，该方法包含用这样的式Ia化合物和生物分子接触细胞，任选进一步包括一种试剂，借此传送生物分子至细胞。此方法可以涉及治疗哺乳动物，包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，向该哺乳动物给药这样的化合物。在优选的实施方案中，生物分子是siRNA,其中siRNA能有效降低有义基因的表达。另一个实施方案提供了一种含有式Ia的化合物和生物分子的药物组合物，其可以进一步含有络合至聚合物的试剂。而进一步的实施方案提供了一种治疗哺乳动物的方法，该方法包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，向该哺乳动物给药络合生物分子的式I的化合物，其中生物分子是有效降低有义基因的表达的siRNA。而进一步的实施方案提供了一种治疗哺乳动物的方法，该方法包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，向该哺乳动物给药络合生物分子的式Ia的化合物，其中所述生物分子是有效降低有义基因的表达的siRNA。附图的简要说明图la-lb.提出聚阳离子修饰的机制。图2.OEI-HD产物的红外光i普。图3a-3b.用辛二酰氯改性的PEI-800的结构元素和IR。图4.使用OEI-HD-lsiRNA传送HUH7/EGPLuc细胞。图5.在不同介质中4吏用OEI-HD-l的siRNA敲除(knockdown)。图6a-6b.在含有血清的介质中4吏用OEI-HD-l的siRNA敲除。图7.使用OEI-SUB-l未能siRNA敲除。图8.体内使用化学改性的聚阳离子用于RAN-siRNA的结果。图9a-9b.(3-氨基丙酰基酰胺连接体实例。发明详述本发明涉及一种用于生物分子传送的独特的非病毒载体，其中载体是具有用丙酰基酰胺单元化学连接的聚阳离子的聚合物。本发明进一步涉及下述的式I和Ia的化合物、制备所述化合物的方法，以及使用式I和Ia的4匕合物的方法。I.式I的化合物一种实施方案提供了用如式I中所述的丙酰基酰胺单元化学连接的聚阳离子a-[L]b-[聚阳离子]。]d在式I中，聚阳离子被定义为当放置在水溶液中时能够获得两个以上阳离子电荷的分子。例如，在某些实施方案中，式I的聚阳离子可以包括，但不限于聚乙烯亚胺400Da-750kDa,树状聚体(dendrimer)结构(例如，具有不同结构和分子量的聚丙烯亚胺树状聚体或PAMAM树状聚体)、精胺、亚精胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。优选地，式I的聚阳离子是聚乙烯亚胺(PEI)且更优选式I的聚阳离子是低聚乙烯亚胺(OEI)。式I的聚阳离子可以任选具有相同的聚阳离子重复，或者也可以具有不同聚阳离子重复的组合。"L"或式I的连接体是含非酯的连接体部分。适合的含非酯的连接体包括，但不限于酰氨基连接体部分、氨基连接体部分、羰基连接体部分、氨基曱酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、琥珀酰胺基连接体部分及其组合。连接体部分被结合到聚阳离子中所含的胺基团。在优选的实施方案中，含非酯的连接体部分是丙酰基单元，被定义为由以下代表的化学基团-CH2-CHR'-CO-N-，其中R'是H或烷基。在一个更优选的实施方案中，非酯连接体是P-氨基丙酰基酰胺连接体部分。聚阳离子可以含有相同聚阳离子的重复单元或不同聚阳离子的组合，其中a和c是约1-约IO的整数。此外，L可以是重复的，也具有相同的连接体部分或者不同连接体部分的组合，因此b是约1-约10的整数。全部式I的化合物也可以是重复的，d是约1-约100的整数，优选在约30范围内的整数。II.式Ia的化合物进一步的实施方案提供了用如式Ia中所述的丙酰基酰胺单元化学连接的聚阳离子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中"s，，是间隔基或不存在。间隔基可以是例如取代的或未取代的、饱和或不饱和的烃链及取代或未取代的、饱和或不饱和的纟皮至少一个杂原子如氧、氮和硫中断的烃链。优选地，烃链包含2-20个碳原子，更优选2-10个碳原子，最优选2-6个石灰原子。适合的间隔基也可以包括，但不限于聚乙二醇(PEG)。在进一步的实施方案中，式Ia的化合物也可以包括一种试剂("A，，)。"A"是试剂或不存在。优选地，"A"是可以促进真核细胞中一种或多种功能例如受体识别、内化作用、生物分子从细胞内体逃脱、细胞核固定、生物分子释放和系统稳定的试剂。治疗剂可以包括，但不限于细胞毒素剂如紫杉醇、内含体溶解剂、疏水聚合物包括但不限于苯曱酰基和月桂酰基、粑向部分及屏蔽剂。屏蔽剂可以包括但不限于亲水实体，包含但不限于聚乙二醇(PEG)、乳糖、糖和聚丙烯基酰胺(polyacrylaminde)。輩巴向配体包4舌，^旦不限于运4夹蛋白、表皮生长因子、叶酸盐、抗体或其片段、肽类、糖类及整联蛋白-结合实体如RGD肽类。应当理解，S和A至少之一必须存在于式Ia中。聚阳离子可以含有相同聚阳离子的重复单元或不同聚阳离子的组合，其中a和c是约l-约20的整数。此外，L可以是重复的，也具有相同的连接体部分或者具有不同连接体部分的组合，因此b是约1-约10的整数。全部式Ia的化合物也可以是重复的，d是约1-约100的整数，优选是约30范围内的整数。式I化合物的分子量范围可以是约800道尔顿-约1,000,000道尔顿，优选是约20,000道尔顿-约200,000道尔顿，最优选是约20,000道尔顿-约30,000道尔顿。式Ia的化合物的分子量范围可以是约800道尔顿-约1,000,000道尔顿，优选是约20,000道尔顿-约200,000道尔顿，最优选是约20,000道尔顿-约30,000道尔顿。聚阳离子与L的摩尔比是20-50。同时聚阳离子上的游离胺与试剂的摩尔比可以才艮据试剂而变4^,并可以/人约1000-2。III.络合生物分子的式I或Ia的化合物式I的化合物可以与活质分子形成络合物，并因此^皮用作传送生物分子至细胞的载体。与式I化合物形成络合物的生物分子的实例包括核酸、蛋白质、肽类、类脂类和碳水化合物。核酸的实例包括DNA、单链RNA、双链RNA、核酶、DNA-RNAhybridizer和反义(antisense)DNA例如反义寡核苷酸(antisenseoligo)。优选的核酸是siRNA。含有络合至聚合物的生物分子的阳离子的脂聚合物可以是通过在互溶剂中相互混合阳离子的脂聚合物和生物分子形成，更优选是通过以下实施例中所述的方法形成。IV.与生物分子络合并任选具有试剂的式I或Ia的化合物本发明的聚合物也可以形成离子络合物或与特定治疗剂的共价键，包括但不限于细胞毒素剂如紫杉醇、内含体溶解剂、疏水聚合物及其他輩巴向部分。OEI-HD载体可以采用屏蔽配体修饰，其将降低体内给药之后不希望的非特异性相互反应的出现，并因此提高给药后的循环寿命(lifetime)。屏蔽配体包含亲水实体，包含但不限于聚乙二醇(PEG)、乳糖、糖和聚丙烯基酰胺。此外，为了提高摄取进入目标组织，载体，可以是OEI-HD或屏蔽的OEI-HD,可以具有与其结合的靶向配体。靶向配体的实例包含但不限于运铁蛋白、表皮生长因子、叶酸盐、抗体或其片段、糖及整联蛋白-结合实体如RGD肽。V.式I和Ia的化合物的制备聚阳离子优选是聚乙烯亚胺(PEI)的交联，通过聚合物的胺的部分迈克尔加成至交联基团的乙烯基基团出现，并形成侧(pendant)酯基团的N-酰化。交联基团，可以是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体。应当理解，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯单体包含数个基团，包括但不限于二丙烯酸酯、二烷基丙烯酸酯、二曱基丙烯酸酯、二丙烯酸酯单体。酰化是定义为把酰基引入具有羟基(O-酰化)或氨基(N-酰化)的有机化合物的分子。此外，聚合物的N-酰化可以通过酯如乙酸乙酯与含有聚合物的酸酐的反应实现。化学修饰可以在聚合物结构的伯胺和仲胺处发生，因此减少了可电离基团的净数目。如果多功能试剂是用于修饰，则出现聚合物的平均分子量增加。这些机制和引入的化学单元是在图1中说明。所得到的聚合物具有作为多种实体的非病毒合成载体的应用，所述实体具有相反的电荷，包括但不限于核酸及治疗的肽类。本发明聚合物的主要优点是是传送宽范围核酸的能力。尽管标准聚合物如PEI25kDa是在质粒DNA传送中是有效的，但是其不能有效传送siRNAs，甚至在较高聚合物剂量时观察不到实质性基因表达敲除(Kim等人，BioconiugateChemistry第17巻，第241-244页，2006年)。对于线性PEI而言，文献在某种程度上是矛盾的(Hassani等人，JGeneMedicine,第7巻，198-207页，2005年；Urban-Klein等人，GeneTherapy第12巻,2005年),然而，来自文献和申请人实验的数据指出，线性PEI22kDa适于暂时转染基因的敲除，然而其不适于在稳定转染的细胞系中产生强的敲除。与这些标14准试剂相反，本发明的聚合物是能够在短暂及稳定转染的细胞系中取得敲除，并在质粒传送中显示高效。因此，双链RNA分子如小干护LRNAs(siRNA)是独特地适于用本发明的聚合物载体传送。siRNA传送可以是用于治疗目的或靶点确认，即，鉴定新治疗目的的潜在靶子。本发明的聚合物载体可以从各种低聚胺制得，包括但不限于树状聚体结构(例如，具有不同结构和分子量的聚丙烯亚胺树状聚体或PAMAM树状聚体)、精胺、亚精胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺或从400-25,000MW范围的支链聚乙烯亚胺构成的碱性物质。支链聚乙烯亚胺是化学改性的或者与单-、双-或多功能剂交联的。聚乙烯亚胺含有过剩的伯胺、仲胺和叔胺，那些胺占聚合物质量的约30%。伯胺和仲胺两者对于与交联剂的反应是可获得的。交联剂被定义为这样的分子，其具有至少2个活性基团并用于化学连接至少2个聚合物分子。可用作交联剂的试剂，包括但不限于乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇600二丙烯酸酯及其他二-或多丙烯酸酯或二-或多-曱基丙烯酸酯分子。用于本发明的优选试剂是二丙烯酸酯，即l,6-己二醇二丙烯酸酯，缩写为HD。HD具有四个可能的反应位点，即，2个乙烯基基团和2个酯基团。因为聚乙烯亚胺具有低分子量，通常称其为低聚乙烯亚胺，缩写为OEI。当OEI与HD组合并加热数天时，反应胺以Michael方式加入，交叉加在不饱和的两个位点。所用的HD与OEI的比例通常是l比l,基于摩尔计。当比例大于l比l时，那么数字标示反映出摩尔比，例如OEI-HD-l指的是HD与OEI的比例是l比l，OEI-HD-5指的是HD与OEI的比例是5比l。当反应完成时，质子NMR显示了所有的乙烯基基团已经消耗，所得到的产物通常溶解于水。那么OEI链的交联没有产生至形成可膨胀水凝胶的程度。典型样品的分子4非阻色i普(sizeexclusionchromatography)4寻到色i普图，其允i午计算数均和重均分子量及因此的多分散性(重均分子量除以数均分子量或Mw/Mn)。这些数值分别是3000、16,000和5.3。多分散性值为l表示单分散分子量。数值2-3某种程度上是狭窄的分布，而4及以上表示较宽的分布。该聚合物是设计成与较高分子量的聚乙烯亚胺(PEI)25，000相比是更少毒性的，其水平是基因转染或siRNA传送的体内使用不可接受的。低分子量PEI，s如OEI800,用作本发明的起始原料，是相对无毒的，但是在传送核酸通过细胞膜时不是非常有效的。上述反应的产物对于细胞是相对无毒的，在传送siRNA和DNA通过细胞膜时是非常有效的。也释放它们进入细胞质，那么它们可以在细胞中产生生物学效应。上述理想化结构的另外特征是，其应当是通过酯键是生物可降解的，其可以是部分结构。理论上，己二醇可以在酯水解时作为副产物以及含有l-烷基氨基-丙酸末端基团的OEI800获得。红外光谱是在合成和分离之后在这样的载体上进行的，但是我们令人惊奇地发现存在非常少的酯，强的酰胺峰是显性的。羧酸也未在红外光谱中指出，其似乎排除过早的酯水解(图2)。用蒸馏水透析之后的产物的质子NMR指出不存在应当是HD键的一部分的脂族的亚甲基。可以解释这些结果的反应是酯键通过OEI上残留的胺酰化，基于起始原料的摩尔比计其应当是丰富的。这样的酰化还将提供副产物l,6-己二醇，其是水溶性并用透析除去。通过OEI上胺的酯酰化的进一步的证据是通过用对于聚合物是非溶剂的乙酸乙酯洗涤产品提供的。在此情况下，分析指出存在乙酸乙酯的有限量的N-酰化。相似的聚阳离子载体可以通过两步方法获得。在此可供选择的两步方法中，第一步包括核芯聚阳离子是用交联剂修饰，第二步包括进一步的修饰，通过加入相似或不同类型的聚阳离子，例如精胺和五亚乙基六胺。具体实施方式实施例本发明进一步通过以下实施例说明，其仅仅意名夂说明本发明而不是要限制本发明的范围。实施例1.载体的合成，OEI-HD-l5.0g(0.0063摩尔)的聚乙烯亚胺(重均分子量800)溶解于7.5ml的DMSO。在分开的容器中，加入3.3ml的DMSO和1.4ml=1.4g(0.0063摩尔)的1,6-己二醇二丙烯酸酯。混合两种溶液。50ml圆底烧瓶浸入60。C恒温的油浴中并装配磁力搅拌棒。烧瓶松散地塞住，使其反应4天。然后反应溶液滴加至200ml的快速搅拌的乙酸乙酯溶液中，借此在烧瓶底部和侧壁上形成粘稠物质。蓬出溶剂并加入新鲜的200ml的等分部分的乙酸乙酯，混合物质。再滗出，再加入另夕卜100ml等分部分，混合，滗出，留下粘稠的物质。该物质转移至铝箔制成的蒸发皿中，在室温在真空箱中放置过夜。此抽真空过程未能除去所有的乙酸乙酯，因为该物质的低表面面积和高粘度并需要进一步的纯化。实施例2.通过透析纯化OEI-HD-l称出0.80g的OEI-HD-l并将其加入闪烁瓶，接着加入10ml的DulbucceosPBS緩冲剂。其在短时间振摇后溶解。通过在一大烧杯的蒸馏水中煮沸约IO分钟，预老化(preconditioned)约1线性英尺(linearfoot)的光谱3500切去透析膜(0.4ml/cm的长度容量)。然后，透析管的一端打结，加入OEI-HD-1溶液，在另一端绑个结密封。管放置于约3加仑蒸馏水中，轻轻地搅拌水4天。此后，物质从管中除去，冻干获得加入管中的聚合物质量的约30%。对于此产物进行质子和石友13NMR。实施例3.OEI-HD-l在二嚅烷中沉淀重复实施例1，但是使用二-恶烷代替乙酸乙酯用于洗涤。使用二嘌烷避免由于乙酸乙酯对游离胺的乙酰化的可能性。实施例4.OEI-HD-5的合成在125ml玻璃瓶中在7.5ml的DMSO中溶解5.0g(0.0063摩尔)的聚乙烯亚胺(重均分子量800)。向分开的容器中，加入17ml的DMSO及7.0ml二7.0g(0.(B15摩尔)的1,6-己二醇二丙烯酸酯并混合。在lMml的瓶中合并两种溶液，松散地盖住，放置在60。C恒温的烘箱中。在反应约30分钟后，看见形成凝胶。使反应持续总计3天。然后，从凝胶中滗去DMSO,凝胶用刮刀破碎成块。小的块放入含有约10ml的水的20ml闪烁瓶中，于是大部分的凝胶似乎是溶解的。实施例5.OEI-HD-10的合成5.0g(0.0063摩尔)的聚乙烯亚胺(重均分子量800)溶解于125ml玻璃瓶中的7.5ml的DMSO中。向分开的容器中，加入34ml的DMSO和14ml=14g(0.0630摩尔)的1,6-己二醇二丙烯酸酯并混合。在125ml的瓶中合并两种溶液，松散地盖住，并将其放置在60。C恒温的烘箱中。在反应约30分钟后，看见形成凝胶。使反应持续总计3天。然后，从凝胶中滗去DMSO,凝胶用刮刀破-淬成块。小的块放入含有约10ml的水的20ml闪烁瓶中并振摇2天。没有物质溶解。实施例6.OEI-Sub-l的合成称出1.0g的PEI-800(0.0013摩尔)并加入通过氯化镁静置干燥的5ml的DMSO。PEI不是完全溶解，而是形成混浊的混悬液。滴加0.22ml(0.26g,密度1.172、0.0013摩尔)的辛二酰氯进入5ml的无水DMSO中。所有玻璃器皿用火烧除去湿气。向室温下用手振摇的PEI溶液/混悬液中滴加入辛二酰溶液。立即形成不溶的凝月交样物质。凝月交用过量的新鲜无水DMSO洗涤1次，借着用过量二p恶烷洗涤2次。滗去残留的溶剂，凝胶室温下在室内(house)真空下放置19小时。甚至在真空干燥之后物质具有显著的臭气。样品进行IR(显微镜)和D20中的质子NMR。质子NMR表明除了所预期的水之外，存在残留的DMSO和二喵烷。从案巻(file)样品中取出50mg，4巴剩余样品完全溶于约10ml的蒸馏水中。样品放置入透析管(3500分子量切断)并用约12升的蒸馏水在磁力搅拌棒的轻微搅拌下透析5天。样品分在两个瓶中并冻干。在冻干之后回收到大约100mg的样品。作为不纯的案巻样品而保留的50mg的校正，约90%的物质丧失，大多数可能通过穿过透析膜。PEI-800-Sub-l的提议的结构如图3a中所示，产品的IR如在图3b图解i兌明。实施例7.采用OEI-HD-l的SiRNA敲除对于HUH7/EGFPLuc细胞使用OEI-HD-l传送siRNA的结果是在图4中概述。转染是在96-孔板中进行，在不含血清的培养基(OptiMEM)中使用5,000个细胞/孔。OEI-HD-l/siRNA配制品是在20plHBS(20mMHEPES,150mMNaCl)中制得，并加入到80pl的不含血清的培养基(lOO)iil总体积)中。传送后四小时，转染培养基用生长培养基代替，两天后测量安光素酶活性。使用O.lOpgsiRNA(40nM)和C/P比例为8/1(OEI-HD-l/siRNA:w/w),萤光素酶活性最高至50%的敲除是与使用非特异性MutsiRNA的传染相比较而获得的。为澄清的目的，C/P比例指的是载体与质粒的重量比，对于本发明的目的其可以是DNA或siRNA。MutsiRNA是用作对照，而且是载体的毒性的良好量度。所以如果采用MutsiRNA看到降低的信号，其应当不具有生物学活性，则在相同浓度下采用特异性siRNA所见的敲除应当是对载体对于细胞的毒性效果的校正。使用0.25pgsiRNA(100nM)及C/P比例4/1,营光素酶活性最高至60%敲除是与使用非特异性MutsiRNA的转染相比较实现的。对于0.50ngsiRNA(200nM),最高至80%敲除被观察到。使用4支高浓度的siRNA(最高至l.OOpgsiRNA(400nM))不导致安光素酶活性的任何进一步的降低。因此，对于使用OEI-HD-l(HBS中络合，不含血清培养基中传染)的HUH7/EGFPLuc中传送而言，萤光素酶表达的最大敲除可以通200nM(0.50pgsiRNA/5,000个细胞)及C/P比例2/1获得。实施例8.在不同緩冲剂介质中用OEI-HD-1进行SiRNA敲除敲除萤光素酶表达的OEI-HD-1的能力是在不同的不含血清络合介质(HBS:20mMHEPES,150mMNaCl;HBG:20mMHEPES,5%葡萄糖;OptiMEM:盐减少的不含血清的培养基，Gibco)中试-睑。不依赖于所用的络合介质，OEI-HD-l/siRNA配制品能够敲除萤光素酶活性最高达80%,络合介质之间没有显著差异。OptiMEM的配制品在100nM(C/P:2/1)是高效的。这可能由于OEI-HD-l/siRNA颗粒的较快聚集造成的。结果是如图5中所示。实施例9.在含血清介质中使用OEI-HD-1的SiRNA敲除HUH7/EGFPLuc中siRNA传送是在血清(10%FCS)存在下使用OEI-HD-1进行的。OEI-HD-l/siRNA配制品是在HBS(20nl)制得，络合物加至在细胞上的的含血清的培养基中。进行两种不同的处理；首先，siRNA传送之后培养基通常变换4小时，其次，培养基不变换达两天。培养基改变之后，萤光素酶表达的最大敲除是使用200nMsiRNA和C/P比例6/1取得的，其是与在不含血清的培养基中达到的最佳转移条件相反200nMsiRNA、C/P比例2/1。没有改变培养基，OEI-HD-l/siRNA传送的最佳转移条件与血清不存在时相同(200nMsiRNA,C/P比例2/1)。此外，没有改变培养基，OEI-HD-1是毒性大得多，在C/P比例6/1和200nM时，细胞死亡。有趣的是，w/o培养基改变，lOOnMsiRNA和C/P比例4/1对于萤光素酶基因的表达的敲除已经是高效的。总之，OEI-HD-l载体(vehicle)对于血清存在下的siRNA传送也是有效的。与不含血清的培养基中的结果类似，萤光素酶表达的最高至80%敲除在10%FCS存在下也是观察到。此外，没有改变培养基，已经较低的siRNA浓度是足以取得最大效应。结果在图6a和6b中总结。实施例10.采用OEI-Sub-l未能SiRNA敲除使用OEI(800Da)和辛二酰酸(suberoylacid)((^6111202€:12)合成的OEI-Sub-l，作为交联剂(如实施例6中所述)试验对于使用不同聚合物/siRNA比例的HUH7/EGFPLuc细胞的siRNA传送。在96-孔板中进行转染，5,000个细胞/孔一式三份，使用LucsiRNA(GL3)和MutsiRNA(IX)(Dharmacon)。OEI-络合物在HBS中制备，siRNA传送是在不含血清的培养基中进行4小时。转染培养基然后是用生长培养基取代，siRNA传送之后2天测量萤光素酶表达。siRNA的量是从0.1至0.50pg/5,000个细胞，OEI-Sub-l/siRNA比例是也是变化的；然而未观察到安光素酶基因表达的沉默在图7中所示。实施例11.K5模拟肽(peptidemimetic)偶联剂OEI-HD-1OEI-HD(2.8mg)是溶解于1mL的含有150mM氯化钠和20mM4-(2-羟乙基)-l-哌。秦乙磺酸(HEPES)的反应緩冲液中，pH为7.5。N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡咬基联硫基)丙酸酯(SPDP)(80pg)加入80^L的100%乙醇中的此溶液中，同时搅拌。使反应持续90分钟。SPDP-激活的OEI-HD然后通过使用SephadexG-25的凝胶过滤纯化。在第二步中，3-倍摩尔过量的在N-末端含有半胱氨酸的K5肽加入到相同的緩冲液中。使反应在室温下进4亍12小时，然而通过^f吏用SephadexG-25的凝月交过滤纯化。实施例12.RGDC(半胱氨酸末端)肽偶联剂OEI-HD-l将OEI-HD(2.8mg)溶解于1mL的含有150mM氯化钠和20mM的4-(2-羟乙基)-l-哌。秦乙磺酸(HEPES)的反应緩冲液中，pH为7.5。N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)(80pg)加入80^L的100%乙醇中的此溶液中，同时搅拌。使反应持续90分钟。SPDP-激活的OEI20然后通过使用SephadexG-25的凝胶过滤纯化。在第二步中，3-倍摩尔过量的RGDC肽加入到相同的緩冲液中。使反应在室温下进行12小时，然而通过使用SephadexG-25的凝胶过滤纯化。实施例13.抗体片段(Fab')的偶合使用衍生自Merdan等人的Bio匿iugateChemistry第14巻，第989页(2003)的方法，OEI-HD(2.8mg)溶解于1mL的含有150mM氯化钠和20mM的4-(2-羟乙基)-l-哌溱乙磺酸(HEPES)的反应緩冲液中，pH为7.5。N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)(80pg)是加入80nL的100。/。乙醇中的此溶液中，同时搅拌。使用反应持续90分钟。SPDP-激活的OEI然后通过使用SephadexG-25的凝胶过滤纯化。在第二步中，1.4-倍摩尔过量的新鲜还原的Fab'加入到相同的緩冲液中。使反应在室温下进4亍12小时，纯化是通过4吏用0.9%NaCl、10mMHEPESpH7.4作为緩冲液A且3MNaCl、10mMHEPESpH7.4作为緩冲液B以及MacroPrepHighS(来自AmershamPharmacia)的梯度离子交换色谱法完成的。实施例14.通过HMDI活化将聚乙二醇偶联到OEI-HDPEG—甲基醚(0.5-20kDa)溶解于无水氯仿(200g/L),使用60。C的10-倍过量的六亚甲基二异氰酸酯，HMDI活化24小时。未反应的HMDI通过轻气油(lightpetrol)反复萃取小心除去。随后，异氰酸酯-末端的PEG与OEI-HD的氨基的反应在6CTC的无水氯仿中进行24小时。PEG化的程度可以通过改变活化的PEG与OEI-HD的比例调节。反应溶液在二乙醚或其他适合的非溶剂中沉淀，产物真空干燥。实施例15.通过PEG-NHS将聚乙二醇偶联剂OEI-HD具有期望分子量的PEG-N-羟基琥珀酰亚胺基酯溶解于DMSO并加入至OEI-HD-l的水溶液中。反应搅拌24小时，PEG化聚合物是通过例如分子排阻色谱分离。实施例16.环状RGD肽通过PEG-间隔基偶联以形成PEG屏蔽的靶向载体根据NucleicAcidsResearch,32巻，149页2004年公开的方法，将RGD偶联剂聚乙二醇。聚乙二醇与RGD(H-ACRGDMFGCA-OH)的化学结合物(conjugate)是首先合成的。这是通过氧化两个半胱氨酸残基形成具有二硫桥键的环状10-merRGD肽实现的。然后，60mg的环状肽溶解于600^1的二甲亚石风(DMSO)。预先溶解于20pi四氢呋喃中的8.54pi的三乙胺(TEA)在氮保护气下加入肽中。搅拌l分钟之后，活化的PEG即NHS画PEG-VS(212mg在THF:DMSO中；300pi:100pl)的溶液一次性加入以使PEG上的n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团与肽的氨基末端反应。反应混合物在室温下搅拌4小时，使用与TEA等当量的三氟乙酸(TFA)猝灭。RGD-PEG-VS是通过用蒸馏水透析纯化，接着冻干。在笫二步中，100mg(21.7pmol)的纯化的RGD-PEG-VS中间体溶解于lml的无水DMSO。向此溶液中，加入溶解于0.5mlTHF中的六当量的TEA并混合。等分部分的溶解于二曱基甲酰胺(0.5ml)的9.4mg(218pmol,以胺计)的OEI-HD加入至此溶液中，并在室温下搅拌12小时以使OEI上的胺和PEG上的乙烯基砜(VS)发生Michael加成。产品作为TFA盐通过HPLC纯化。实施例17.OEI-HD前药将紫杉醇偶联剂聚乙二醇分子的一个末端，何MaterialsResearchInnovations第9巻,13-14页，2005年)所述。PEG链的其他羟基末端是与三氯-s-三。秦反应以制备活化的PEG末端基团。活化的PEG是与pH9.0的水中的OEI-HD结合，以使PEG-紫杉醇偶联剂OEI-HD载体。此OEI-HD-PEG-紫杉醇部分与其他具有靶向配体及对目标细胞特异性的siRNA的OEI-HD聚合物结合，以形成聚阳离子复合物(polyplex)。此聚阳离子复合物具有干扰细胞传录(siRNA)的传送剂以及传送小细胞毒素剂即紫杉醇的性质。实施例18.RAN-siRNA传送的化学改性的聚阳离子的体内用途RANsiRNA是直接对抗RANGTPase的小干扰RNA。这种酶对于大多数细胞是必需的和表达敲除导致毒性效应。十五只(15)小鼠在背部皮下注射1兆Neuro2A肿瘤细月包，生成局部肿瘤，当^f吏用卡尺通过皮肤测量时其允许生长至3mm直径的大小。小鼠分成3组，每组5只动22物，即，治疗组、对照组和载体组。治疗组接受聚阳离子络合到OEI-HD载体的RAN-siRNA,重量比为0.6比1,载体含有10%重量的OEI-HD-PEG-Tf。运铁蛋白(Tf)是通过PEG间隔基共价连接到OEI-HD,并用作輩巴向剂，因为目标肺瘤已知是表达运铁蛋白的受体。对照组接受聚阳离子络合到OEI-HD的siCONTROL(对照siRNA是生物学上灭活的)，重量比例为0.6比1,而载体含有10%重量的OEI-HD-PEG-Tf。最后组接受緩冲赋形剂、hepes緩冲的葡萄糖。每一小鼠三天接受三次(3)200-微升注射，通过尾静脉。每次治疗注射含有35微克的siRNA,各对照注射含有40微克的siCONTROL。载体组仅仅接受200微升的緩冲液。所有动物每天测量胂瘤大小和动物体重。小鼠首次注射之后，使其生活8天。在任何实验组没有看到归因于研究的体重减少。siControl和緩冲液组的肿瘤生长曲线基本上相同；然而，在第3天RANsiRNA治疗的生长曲线以正性方式改变来减缓图8中所示的速率。实施例19.RAF-l-siRNA传送的化学改性的聚阳离子的体内用途重复实施例20中所述的实验方案，但是取代SCID-小鼠，5兆HuH7肝肿瘤细胞以产生肿瘤，和RAF-l-siRNA在治疗组中。RAF-l-siRNA-小干扰RNA直接抗RAF-l,对于很多癌细胞的重要的生物学分子。实施例20.用于PLK-1-SiRNA传送的化学改性的聚阳离子的体内用塗重复实施例19中所述的实验方案，但是替换已知表达PLK-1并已经证实在用细胞培养物中用PLK-1siRNA转染之后显示细胞死亡的胂瘤细胞。PLK-l-siRNA-小干扰RNA直接抗马球样激酶l(细胞周期生长的一种重要调节剂)。表达敲除导致毒性效应。实施例21.实施例19的聚阳离子复合物的形成和表征聚阳离子复合物大小的表征是使用MalvernZetasizerNanoZS进行的。此仪器能够通过常规手段测量Zeta电位并通过准弹性激光散射的技术测量粒度。1.1微克的OEI-HD和0.12微克的OEI-PEG-运铁蛋白是混合进入总体积25微升的HBG(HEPES緩冲的葡萄糖，含有20mM的pH7.3的HEPES的5%葡萄糖溶液(重量/体积))。各个量的siRNA(2.0微克)在另一个瓶子中使用HBG稀释成25微升。随后，聚合物溶液加入siRNA溶液，通过颠倒容器10次进行混合。所得聚阳离子复合物的混悬液具有200-300nm的粒度和-1.3毫伏的Zeta电位。Zeta电位是与颗粒稳定离子层和移动离子扩散层之间剪切力的表面的电场中的胶体颗粒移动有关的电位。实施例22.活化的双功能PEG偶联到核酸载体0EI-HD-1,接着运铁蛋白偶联到侧链活化的PEG末端基团OEI(34K)、300mg(~9xl(T6摩尔)溶解于5ml的100mMHEPES緩冲液中，pH8.6。在分开的瓶子中，75mg(NMR计66。/o纯度，~lxl(T5摩尔)OPSS-PEG(5K)-SPA(邻-吡啶基二硫化物-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸酯)溶解于4ml乙醇。两种溶液合并，在室温下搅拌2小时。反应溶液随后进行离子交换色谱法，收集含有OPSS-PEG-OEI的级分。纯化产品的体积使用Centricon浓缩器减少至1ml。产品使用PD10柱子(预饱和的W/OEI)除去盐分。这是通过把1ml的样品溶液加入柱子接着加入1.5ml的水完成的。丟弃最初的流出物(flow-through),样品在2ml水中洗脱。此溶液冻干并用质子NMR分析，其表明每714个OEI重复单元有一个吡啶基联碌u基。这种中间体命名为OEI-HD-1-聚乙二醇-2-p比啶基联疏基-丙酰胺或简称为"OEI-PEG-OPSS"。OEI隱PEG画OPSS还原成OEI-PEG-SH25mg的冻干OEI-PEG-OPSS溶解于1.5的100mMHEPES緩冲液。随后，40mg(2.6xl0-4摩尔)的DL-二硫苏糖醇(DTT)加入样品溶液，搅拌30分钟。为了监测反应的进程，10pl的样品溶液用100mMHEPES緩冲液稀释成500使用UV/VIS光度计进行吸收扫描。在②343nm处观察局部最大值，证实该反应的进展。使用PD10柱，纯化反应溶液。这是通过。把1.5ml的反应溶液加入柱子(用W/OEI预饱和的并用HBS緩冲液平4軒)接着加入1ml的HBS緩冲液(-使用前，HBS緩冲液用W/氩气起气泡)进行的。丟弃最初的流出物，样品用2mlHBS洗脱。OEI-PEG-SH样品溶液的浓度是5mg/ml,如通过铜络合作用测定法测定。为了贮藏，密封之前，样品溶液是使用氩气起气泡5分钟。使用N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基联硫基)-丙酸酯(SPDP)修饰运铁蛋白运4失蛋白(60mg)溶解于3ml的HBS緩冲液。随后，3.5mg的SPDP溶解于7ml的乙醇(小心加热溶液用于完全溶解)。立即把0.5ml的SPDP溶液滴加入运4失蛋白溶液并轻^U觉拌1小时。反应溶液转移至YM-10Centricon浓缩器以减少体积至lml。再加lml緩冲液交换，在Centricon浓缩器上完成。纯化的运铁蛋白-SPDP溶液用氩气起气泡5分钟。用运铁蛋白-SPDP偶联OEI-PEG-SH溶解于2ml的HBS緩冲液的10mg的OEI-PEG-SH同2.7ml的纯化并活化的运铁蛋白溶液在新闪烁瓶中合并，在室温下轻微搅拌整夜。然后，未反应的巯基(sulfhydryl)是用5mg(4xl0^摩尔)N-乙基-马来酰亚胺猝灭，搅拌30分钟。OEI-PEG-运铁蛋白是通过离子交换色谱法纯化。使用Centricon浓缩器减少体积，按照先前所述除去产物的盐分。通过铜络合测定法测定的bioconjugate中多胺(OEI)的浓度是1.3mg/ml，才艮据UV光谱法的测定，运4失蛋白在2.9mg/ml下测定，。把铁掺入运铁蛋白把铁装入运铁蛋白是通过把每毫克运铁蛋白含量1.25|Lil的载铁緩冲液加入样品来进行的，根据KursaM,WalkerGF,RoesslerV,OgrisM,RoedlW,KircheisR,WagnerE.,BioconjugateChem.2003中所述。使用移位测定法来测定siRNA结合OEI-PEG5K-运铁蛋白的结合亲和力0.01mg/ml的siRNA溶液是从非特异性siRNA原液制得。把20|ul的siRNA溶液转移至若干小塑料瓶，接着增加HBG緩冲液中OEI-PEG5K-运铁蛋白的量，保持各个瓶中的总体积恒定在40ul。OEI-PEG5K-运铁蛋白与siRNA的重量比范围是0-10。在移液之后，充分混合瓶内物，静置10分钟。然后，来自各个瓶的20|ul等分部分转移至琼脂糖凝力交板的其对应当孔中。琼脂糖凝胶板放置于75伏的电泳器械装置中。在15分钟之后，移开板，光电测量。我们发现，在重量比1.5或更高的孔中没有观察到siRNA迁移带。这表明，所有siRNA在1.5和更高重量比时与OEI(34K)-PEG(5K)-运铁蛋白络合。实施例23:苯甲酰基苯甲酸偶联剂式I或Ia的化合物Oo(RLLN相对发光单位；C:P+载体与质粒或siRNA比例w/w;luc=抗萤光素酶siRNA;scr=scramblersiRNA对照；和lip=脂转染胺转染剂)使用苯曱酰基苯曱酸-琥珀酰亚胺基酯(Invitrogen#1577),在HBS(Hepes緩冲盐水、10mMHEPES、150mMNaCl、pH7.3,)中完成反应。20mg聚合物(下述)溶解于2mlHBS,调节pH至7.3。接着，不同量的苯曱酰基苯曱酸-NHS酯加入到1ml无水DMSO中。在使用去离子水稀释至大约6ml之前，全部反应进行12小时。随后，进行透析，此后结合物冻干。表1所用的透析膜:基础聚合物膜固COPEI2kDa1kDaOEI5kDa3kDaOEI30kDa10kDa26表2所合成的结合物的偶联的实际程度<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>样品再次冷冻干燥并溶解于HBS(Hepes緩冲的盐水、10mMHEPES、150mMNaCl、pH7.3)。这些溶液浓度是相对未改性的聚合物4吏用铜测定法确定的。通过动态激光散射测定大小0.5微克的siRNA与50微升总体积中的各个量的OEI络合。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表6敲除效率H1299细胞，0.5微克siRNA/孔<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表10OEI30K,C:P实施例24:月桂酸偶联到式I或Ia的化合物使用月桂酸N-羟基-琥珀酰亚胺基酯(Sigma-Aldrich#OL3卯0-5g,Lot#087H5174),在HBS(Hepes緩冲的盐水，10mMHEPES,150mMNaCl,pH7.3)中进行反应。20mg聚合物溶解于2mlHBS中，调节pH至7.3。接着在1ml无水DMSO中加入不同量的月桂酸NHS酯。表11<image>imageseeoriginaldocumentpage30</image><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>随后，结合物溶解于D20中，进行^-NMR。以下实际偶联程度通过NMR测定。基于NMR计算的偶联程度表14<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>样品再次冷冻干燥并溶解于HBS(Hepes緩冲的盐水、10mMHEPES、150mMNaCl、pH7.3)。通过动态激光散射测定大小0.5微克的siRNA是与50微升总体积中的各个量的OEI络合,验在HBS中进行。实表15<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>纯(plain)OEI9k在整个范围内得到多重峰！表18<image>imageseeoriginaldocumentpage34</image>表21<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>OEI5k及其^T生物表22<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表23<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表25<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表26<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表27实施例23:月桂酸偶合PEIs/OEIs,以及结合物的物理化学及生物学评使用月桂酸N-羟基-琥珀酰亚胺基酯(Sigma-Aldrich#OL3900-5g,Lot#087H5174)，反应是在HBS(Hepes緩冲的盐水、10mMHEPES,150mMNaCl,pH7.3)中进行的。20mg聚合物溶解于2mlHBS,调节pH至7.3。接着，不同量的月桂酸NHS酯加入1ml的无水DMSO中。PEI800Da和PEI2kDa表28<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>OEI5kDa、9kDa及30kDa表2920mgmg月桂酸NHS酸每PEI评论5kDa2.42无5kDa11.910无5kDa29.725混法9kDa2.74无9kDa1015无9kDa2740沉淀30kDa1.26无30kDa25无30kDa20100沉淀在使用去离子水稀释至大约6ml之前，全部反应进行12小时。随后，进行透析，此后结合物冻干。表30结合物基础聚合物透析膜切断PEI800500PEI2kDa1kDaOEI5kDa3kDaOEI9kDa3kDaOEI30kDa10kDa随后，结合物溶解于D20中，用于力-NMR。以下实际偶合4呈度是通过NMR测定。基于NMR计算的偶合程度表31<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>样品再次冷冻干燥并溶解于HBS(Hepes緩冲的盐水、10mMHEPES、150mMNaCl、pH7.3)。通过动态激光散射测定大小0.5微克的siRNA与50微升总体积中的各个量的OEI络合。实验在HBS中完成。表32<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage44</image><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>表45<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>实施例24:苯甲酰苯甲酸偶联到PEIs/OEIs,结合物的物理化学和生物学评估<formula>formulaseeoriginaldocumentpage46</formula>使用苯甲酰苯甲酸-琥珀酰亚胺基酯(Invitrogen#1577)，反应是在HBS(Hepes纟爰冲的盐水，10mMHEPES,150mMNaCl,pH7.3)中进4亍的。20mg聚合物溶解于2mlHBS,调节pH至7.3。接着，不同量的苯曱酰苯曱酸-NHS酯加入1ml的无水DMSO中。在使用去离子水稀释至大约6ml之前，全部反应进行12小时。随后，进行透析，此后结合物冻干。表46<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>样品再次冷冻干燥并溶解于HBS(Hepes緩冲的盐水、10mMHEPES、150mMNaCl、pH7.3)。这些溶液浓度相对未改性的聚合物使用铜测定法确定。通过动态激光散射测定大小0.5微克的siRNA与50微升总体积中的各个量的OEI络合。表49<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>敲除效率H1299细胞，0.5微克SiRNA/孑L表52<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表53<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表54<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>权利要求1、一种聚合物，其通过丙酰基酰胺单元化学连接的聚阳离子形成，其中所述聚合物被用作核酸传送的非病毒载体。2、权利要求l的聚合物，其中聚阳离子是聚乙烯亚胺(PEI)。3、权利要求l的聚合物，其用于siRNA传送。4、权利要求l的聚合物，其进一步含有屏蔽配体。5、权利要求4的聚合物，其中屏蔽配体是聚乙二醇(PEG)。6、权利要求5的聚合物，其进一步包含靶向配体。7、权利要求6的聚合物，其中靶向配体是运铁蛋白。8、权利要求4的聚合物，其进一步包含与多核苷酸偶合。9、权利要求5的聚合物，其进一步包含与多核苷酸偶合。10、权利要求6的聚合物，其进一步包含与多核苷酸偶合。11、权利要求7的聚合物，其进一步包含与多核苷酸偶合。12、一种制备权利要求1的聚合物的方法，其中聚合物是通过聚合物的胺的部分迈克尔加成到交联剂的乙烯基基团而交联的，并进一步通过侧链酯基团的N-酰化来改性。13、权利要求12的方法，其中聚合物是通过游离酯、酸酐、或酰卣的加成而进一步改性的。14、权利要求12的方法，其中交联可以发生在聚合物结构的伯胺和仲胺两处上。15、权利要求12的方法，其中交联剂包含以下试剂的酯单体丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二曱基丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯和聚乙二醇600二丙烯酸酯。16、权利要求15的方法，其中交联剂是1,6-己二醇二丙烯酸酯。17、一种在体内传送基因至耙向组织的方法，其使用权利要求l的聚合物。18、一种在培养物中将siRNA传送至细胞的方法，其使用权利要求1的聚合物。19、一种在体内把siRNA传送到组织的方法，其使用权利要求l的聚合物。20、权利要求19的方法，其中siRNA的传送是用于治疗目的或用于輩巴点确i人。21、一种使用权利要求1的聚合物的方法，其中聚合物形成可靶向的络合剂，所述络合剂可以结合相反电荷的实体并将其传送至靶向组织。22、一种使用权利要求1的聚合物传送有义治疗实体至患者的方法，其中聚合物与有义治疗实体形成离子络合物或共价键。23、权利要求22的方法，其中有义治疗实体包含细胞毒素剂、内含体溶解剂及亲水的聚合物。24、式I化合物，其包含[[聚阳离子fe"~[L]b——[聚阳离子]jd其中聚阳离子是聚乙烯亚胺单元；L是非酯连接体；a是约l-约20的整数b是约1-约10的整数c是约1-约20的整数；和d是约1-约1000的整数。25、权利要求24的化合物，其中聚阳离子是低聚乙烯亚胺。26、权利要求24的化合物，其中L选自酰氨基连接体部分、氨基连接体部分、羰基连接体部分、氨基甲酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、二硫化物连接体部分和琥珀酰胺基连接体部分。27、权利要求26的非酯连接体，其中L是P-氨基丙酰基酰胺连接体部分。28、权利要求24的化合物，其进一步包含生物分子。29、权利要求28的化合物，其中所述生物分子是siRNA。30、权利要求24的化合物，其具有的重均分子量范围是约800道尔顿至约1,000,000道尔顿。31、权利要求24的化合物，其具有的重均分子量范围是约20,000道尔顿至约200,000道尔顿。32、权利要求24的化合物，其具有的重均分子量范围是约20,000道尔顿至约30,000道尔顿。33、式I化合物，其包含:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中聚阳离子是聚乙烯亚胺；L是非酯连接体部分；S是间隔基或不存在；A是试剂或不存在；a是约l-约20的整数；b是约1-约10的整数；c是约1-约20的整数；和d是约1-约1000的整数。34、权利要求33的化合物，其中聚阳离子是低聚乙烯亚胺。35、权利要求33的化合物，其中L选自酰氨基连接体部分、氨基连接体部分、羰基连接体部分、氨基甲酸酯连接体部分、脲连接体部分、醚连接体部分、二》危化物连接体部分和琥珀酰胺基连接体部分。36、权利要求33的非酯连接体，其中L是P-氨基丙酰基酰胺连接体部分。37、权利要求33的化合物，其进一步含有生物分子。38、权利要求37的化合物，其中所述生物分子是siRNA。39、权利要求33的化合物，其进一步包含试剂及任选S。40、权利要求38或39的化合物，其中所述试剂选自促进受体识别、内化作用、生物分子从细胞内体逃逸、细胞核固定、生物分子释放及系统稳定的试剂。41、权利要求38或39的化合物，其中所述试剂选自细胞毒素剂、疏水基团、屏蔽剂和耙向配体。42、权利要求ll的化合物，其中所述试剂是运铁蛋白。43、一种非病毒传送系统，其包含(a)生物分子；(b)偶合到生物分子的化合物，其中化合物-生物分子结合物包含权利要求24或33的化合物。44、权利要求45的非病毒传送系统，其中所述生物分子是siRNA。45、一种治疗哺乳动物的方法，该方法包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，并向哺乳动物给药权利要求28的化合物，其中所述生物分子是有效降低有义基因表达的siRNA。46、一种治疗哺乳动物的方法，该方法包含鉴定需要基因治疗的哺乳动物，并向哺乳动物给药权利要求28的化合物，其中所述生物分子是有效降低有义基因表达的siRNA。全文摘要本发明提供了一种用于体外和体内的核酸传送的独特的非病毒载体，及其使用方法。文档编号C08G73/02GK101437544SQ200780003302公开日2009年5月20日申请日期2007年1月23日优先权日2006年1月23日发明者E·瓦纳,J·克勒克纳,P·塔查,T·梅尔丹申请人:艾博特公司