纤维素衍生物及其水凝胶的制作方法

专利名称：纤维素衍生物及其水凝胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为纤维素衍生物的羧甲基纤维素的羧基被特定的取代基取代而得 到的纤维素衍生物及其水凝胶。本发明的纤维素衍生物在水中形成水凝胶。所述水凝胶 的粘弹性优异，并且可以形成能够用注射器等注入器注入规定的场所的无定形的可注射凝 胶，优选用作医疗用凝胶或防粘连材料。
背景技术：
由源自天然的生物质、即纤维素衍生而来的羧甲基纤维素是显示水溶性的衍生 物，由于分散性和保水性良好，因此用于食品、化妆品等各种领域。另外，由于羧甲基纤维素 的安全性高，因此在医疗领域，被用于巴布剂材料、X射线造影剂、片剂的崩解材料、药用糖 浆、防粘连材料的原料等。已知有对羧甲基纤维素的羧基进行修饰而形成不溶性衍生物的例子，例如，国际 公开第W001/046265号的说明书中记载了通过将含有羧甲基纤维素的聚阴离子性多糖、亲 核试剂和活化剂在水性混合液中混合而成的聚阴离子多糖的非水溶性衍生物及其制造方法。这里记载的衍生物是非水溶性的，而对于本发明的凝胶这样的、相对于水以低浓 度存在时，显示出水溶性，在高浓度时，具有即使倾斜也不流动的粘弹性的凝胶，则完全没 有记载。国际公开第W089/10940号说明书中记载了从羧甲基纤维素、羧甲基淀粉和羧甲 基几丁质构成的组中选出的酸性多糖的、与脂肪族、芳基脂肪族、脂环式和杂环式系列的醇 的全酯和部分酯类，以及该部分酯类的与无机碱或有机碱的盐类。但是，关于这些多糖衍生 物形成水凝胶的内容，则完全没有记载，对于提供本发明这样的可注射凝胶，也没有启示。日本专利申请公开第2000-51343号公报中公开了一种天然的创伤治疗产品，其 具有多糖类高分子和一条附着于多糖高分子上的脂肪酸链，能够从凝胶状态到溶液状态、 及其反方向地可逆地发生状态变化。但是，这些文献中公开的多糖类缺乏在水溶液中的粘弹性，难以作为能够经由注 射针这样的细管注入体内的水凝胶来使用。

发明内容
本发明要解决的课题在于，提供具有高粘弹性，且作为能够用注射器等注入器注 入规定场所的可注射凝胶有用的生物体内消化性的纤维素衍生物。在至今为止公开的技术 中，欲获得具有高粘弹性的凝胶而提高取代基的导入比例(取代度)时，会发生凝聚或沉 淀，而不能得到粘弹性高的凝胶。但是，如果能够得到高粘弹性的凝胶，则可以在一定期间， 任意地保留在体内的特定场所，因此在伤口的保护、脏器间的物理性隔离屏障形成方面是 有用的。另外，通过使药物浸渗于所述凝胶中，可以实现局部的药物释放系统。进而，如果 具有注入生物体内即被分解或被吸收的特性，则可以优选地用于外科手术时使用的注入用凝胶材料或再生医疗的支架材料等。本发明人等为了发现可以在生物体内使用、安全性优异、处理性优异的可注射凝 胶而进行了深入研究，结果发现，通过用特定官能团对羧甲基纤维素进行化学修饰，能够得 到具有高粘弹性且处理性也优异的可注射凝胶，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及以下述式(1)表示的化学结构为重复单元的纤维素衍生物。 -H(a)-CH2-COOM(b)-CH2-CO-NH-X-CO-Y-Z (c)式(b)中，M是氢原子、碱金属或碱土金属，式(c)中，X是碳原子数1 10的2价烃基，Y是两末端具有氧原子的2价聚亚烷 基氧化物，ζ是碳原子数1 24的烃基或-CO-R4 (其中，R4是碳原子数1 23的烃基)。另外，本发明是含有所述纤维素衍生物的水凝胶。另外，本发明是含有所述纤维素衍生物的医疗用材料。进而，本发明是含有纤维素衍生物的防粘连材料。需要说明的是，本发明的纤维素衍生物，虽然是以上述式(1)表示的化学结构为 重复单元，但并不限于全部相同的重复单元连结而成的聚合物，基于上述范围内允许的各 种R1、! 2、! 3的组合的多种多样的重复单元连结而成的聚合物也包括在发明中。
具体实施例方式本发明是以上述式(1)表示的化学结构为重复单元的纤维素衍生物。这里，M是氢原子、碱金属或碱土金属，作为碱金属，可以举出钠、钾、锂等，作为碱 土金属，可以举出镁、钙等。优选钠。式(c)中的X是碳原子数1 10的2价烃基。具体的，可以举出亚甲基、亚乙基、 亚正丙基、亚异丙基、亚正丁基、亚异丁基等。优选亚甲基。Y是两末端具有氧原子的、由聚亚烷基氧化物衍生的2价基团。所谓聚亚烷基 氧化物，是指可具体例示出聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇等的聚亚烷基二醇类。所谓
4两末端具有氧原子，是指从聚亚烷基氧化物两末端的羟基除去氢原子后得到的参与和 相邻基团结合的结构。具体可以举出由-(O-CH2-CH(CH3)-)n-0-表示的1，2_聚丙二醇 类、-(O-CH2-CH2-CH2-)n-0-表示的 1，3-聚丙二醇类、-(O-CH2-CH2-)n_0_ 表示的聚乙二醇类 等衍生的基团。另外，也可以是由上述聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物例如PEO-PPO等所表 示的共聚物衍生的基团。这里，η表示重复单元数。所述重复单元数η优选为2 100，更优选为3 70。Z是碳原子数1至24的烃基或-C0-R4，R4是碳原子数1 23的烃基。作为Z的碳原子数1至24的烃基，具体可以例示出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、 己基、辛基、壬基、月桂基、硬脂基等直链烷基，环己基、环戊基、环己基壬基、胆留基等具有 环状结构的烷基，油烯基等不饱和烷基，苯基、萘基、苄基等芳香族烃基。其中，优选硬脂基、 油烯基等。R4是碳原子数1 23的烃基。作为R4的具体例，可以例示出甲基、乙基、丙基、丁 基、戊基、己基、辛基、壬基、十七烷基(h印tadecanyl)、十七碳烯基、月桂基、硬脂基等直链 烷基，环己基、环戊基、环己基壬基、胆留基等具有环状结构的烷基，油烯基等不饱和烷基， 苯基、萘基、苄基等芳香族烃基。其中，优选十七烷基、十七碳烯基等。R4为脂肪族烷基时，Z的-CO-R4就成为来源于脂肪酸的酰基。作为所述酰基的优 选具体例，可以举出月桂酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基。另一方面，R4为芳香族基团时， Z的-CO-R4就成为来源于芳香族脂肪酸的酰基。作为其优选的具体例，可以例示出苯甲酰 基、萘甲酰基。其中，优选使用硬脂酰基、油酰基。所谓取代度，是指以取代基(a)、取代基(b)和取代基(C)的当量的合计为3时的 各取代基的当量。取代基(b)的取代度和取代基(c)的取代度的合计优选为0. 3 2. 0，更 优选为0. 5 1. 8，进一步优选为0. 6 1. 2。取代基(b)的取代度和取代基(C)的取代度的比例没有特别限定，但优选取代基 (b)比取代基(c)更多存在。特别是取代基(c)的取代度相对于取代基(b)的取代度的比 即Rc/b为0. 01 0. 4的，作为凝胶是优选的。取代基(c)的取代度为0. 001 0. 50，优选为0. 005 0. 40。通过将取代基(C)
的取代度控制在该范围内，可以获得具有适度的粘弹性、能够用注射器等具有细管的器具 注入的凝胶。取代基(c)的取代度可以由元素分析中得到的碳含量和氮含量的比求出。另外，纤维素衍生物的重均分子量为1 X IO3 5 X IO6,优选为5 X IO4 5 X IO6,更 优选为5X104 1X106。就纤维素衍生物的重均分子量而言，被导入纤维素的取代基(c) 的导入引起分子量发生变化，分子量比导入取代基(c)前的纤维素衍生物有所增加。通过 适当选择作为原料的羧甲基纤维素的分子量，可以得到具有目标分子量的纤维素衍生物。作为原料的羧甲基纤维素衍生自纤维素。作为纤维素，可以是来源于植物的纤维 素，也可以是通过发酵法制造的细菌纤维素，没有特别限定。通过用氢氧化钠等强碱水溶液 将纤维素制成碱性纤维素，使其与单氯醋酸或其钠盐反应，从而能够得到羧甲基纤维素。纤 维素骨架中的羧甲基基团的取代位置没有特别限定，优选主要位于C-6位。本发明的纤维素衍生物可以通过(i)羧甲基纤维素和(ii)下述式(2)表示的成 分P的缩合反应来得到。这里，成分P是下述式(2)表示的、单末端具有氨基的化合物。
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H2N-X-CO-Y-Z (2)这里，X、Y和Z的定义与前记式(1)中的定义相同。所述氨基，可以与适当的酸类形成盐，也可以是游离的氨基，没有特别限定。式(2) 的化合物可以优选通过以下的反应来制造。反应1)A-NH-X-C00H+H-Y-Z — A-NH-X-CO-Y-Z反应2)A-NH-X-CO-Y-Z — H2N-X-CO-Y-Z这里，A表示氨基的保护基团。反应1)是A-NH-X-COO-表示的氨基被保护起来的氨基酸衍生物与具有Η_Υ_Ζ结 构的单末端为羟基的化合物的偶合反应。反应中优选使用使酯键形成的缩合剂，优选使用 碳化二亚胺类等缩合剂。作为优选的具体例，可以举出二环己基碳化二亚胺。作为氨基的保护基团Α，具体可以使用苄基、叔丁基氧羰基(Boc基)等公知的保护 基团。其中，优选Boc基。由反应1)得到的A-NH-X-CO-Y-Z并不限于上述偶合反应(反应1))，可以采用公 知的所有合成方法。例如，也可以通过氨基被保护而羧基形成活性酯的氨基酸衍生物与具 有H-Y-Z结构的单末端为羟基的化合物的酯交换反应来合成。反应2)是氨基的脱保护反应，可以使用通常的肽合成中采用的所有公知反应。A 为Boc基时，可以是使用酸的脱保护反应，优选使用三氟乙酸等酸。反应物的精制方法也没 有特别限定，可以根据期望通过色谱来进行分离精制。上述反应1)和2)可以是液相合成也可以是固相合成，反应方法和精制方法没有 特别的限制。通过由上述反应得到化合物H2N-X-CO-Y-Z的单末端氨基与羧甲基纤维素的羧基 的偶合反应，能够得到本发明的纤维素衍生物。就H2N-X-CO-Y-Z而言，优选以相对于起始物质羧甲基纤维素的羧基的摩尔当量为 0. 01 0. 4当量的量投入反应体系。此时，考虑到反应效率，H2N-X-CO-Y-Z的投料量也可 以过量。就偶合反应而言，从羧甲基纤维素的特性考虑，优选在含水的溶液中反应。此时， 反应溶剂可以仅是水，也可以混合有与水相溶的有机溶剂，还可以在使用了与水不相溶的 有机溶剂的2层体系的反应中进行。作为与水相溶的有机溶剂，可以举出甲醇、乙醇等醇 类，四氢呋喃、二噁烷等环状醚类，聚环氧乙烷化合物等醚类，二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺 等酰胺类，吡啶、哌啶等有机碱类，二甲基亚砜等二烷基砜类，丙酮等酮类。优选的是在混 合有水和与水相溶的有机溶剂的均一反应体系中，进行羧甲基纤维素和H2N-X-CO-Y-Z的反 应，作为与水相溶的有机溶剂，优选四氢呋喃。偶合所使用的催化剂可以使用公知的所有化合物，优选使用羧基活化剂、缩合剂。 作为羧基活化剂，可以举出N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酚、N-羟基苯并三唑、N-羟基哌 啶、2，4，5_三氯苯酚、Ν，Ν-二甲氨基吡啶等。作为缩合剂，可以举出1-乙基_3-( 二甲氨基 丙基)_碳化二亚胺及其盐酸盐、二异丙基碳化二亚胺、二环己基碳化二亚胺、N-羟基-5-降 冰片烯-2，3-二甲酰亚胺等。
其中，使用N-羟基苯并三唑作为羧基活化剂，使用1-乙基_3-( 二甲氨基丙 基)_碳化二亚胺的盐酸盐作为缩合剂是优选的。反应温度优选为0 60°C。为了抑制副产物，更优选在0 10°C进行反应。反应 环境优选是在弱酸性环境下，进一步优选PH6 7。本发明的水凝胶是通过本发明的纤维素衍生物含水而形成的水凝胶，其含有相对 于水100重量份为0. 05 3. 0重量份、优选0. 1 2. 0重量份、进一步优选0. 3 1. 0重 量份的以式(1)表示的化学结构为重复单元的纤维素衍生物。本发明的水凝胶中，优选具有即使装有凝胶的容器倾斜也不会流出的程度的粘弹 性的水凝胶，优选用药勺等金属刮勺一接触就能够容易地变形、是容易涂布于患处的状态 并且能够用注射器等具有细管的器具进行注入的水凝胶。本发明的水凝胶的粘弹性可以通 过改变本发明的纤维素衍生物相对于水的含量来进行调整，因此可以根据使用目的进行优 化。另外，本发明的水凝胶是无色透明的，在制造过程中混入了垃圾等杂质时，能够检 测出，具有工业生产上的优点。另外，本发明的水凝胶即使用水稀释也吸收水，凝胶的体积增大水所增加的量。进 一步用水稀释时，则均具有在水中溶液化、失去凝胶的性状而成为水溶液的特征。作为本发明的水凝胶中所含的水以外的其他成分，包括用作为催化剂的缩合剂 类、缩合剂经由规定的化学反应而生成的尿素等副产物类、羧基活化剂、未反应的的胺类、 在反应的各段阶有可能混入的杂质、用于调节PH的离子类等，这些成分均优选抑制在任意 化合物进入生物体内时都不会作为排异反应(foreign body reactions)而被识别的程度 的含量以下的低水平。作为本发明的纤维素衍生物的优选复弹性模量，在水中的聚合物浓度为0. 5重 量％、温度37°C的条件下，用动态粘弹性测定装置(流变计)以角速度lOrad/sec进行测定 时，优选为50 900N/m2，更优选为100 700N/m2。这里，复弹性模量是指表示弹性体的应 力与应变之比的常数。另外，作为本发明的纤维素衍生物及其水凝胶的用途，能够用于包括医用材料的 医疗用途、护发产品或皮肤保湿剂等日用品用途、化妆品用途等。其中，由于本发明的水凝 胶能够通过注射器进行注入，因而能够用于微创(Minimally Invasive)治疗用途，特别是 优选用作为用于再生医疗的细胞载体、负载和缓慢释放生长因子等液性因子的载体、负载 和缓慢释放可以用作药物的低分子化合物的载体、防粘连材料或密封剂等医用材料。进而， 适宜用于细胞培养载体、微生物的培养载体、牙科用植入材料等。培养细胞得到的成型品与 细胞的复合体可以优选用于细胞芯片等的读出、诊断等用途。本发明的纤维素衍生物及其水凝胶可以用公知的所有灭菌方法进行灭菌处理。优 选采用的灭菌方法是电子射线照射或利用环氧乙烷等的气体灭菌、高压蒸汽灭菌等。
实施例以下，通过实施例来说明本发明的实施方式，但本发明的范围不限于此。[实施例1]H2N-CH9-CO- (Q-CHXH,) ,-Q-C^ 的合成
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相对于油醇聚乙二醇醚(H-(O-CH2CH2)7-O-C18H35、和光纯药株式会社制造)1毫摩 尔，将正丁基氧羰基甘氨酸(Boc-Gly-OH、和光纯药株式会社制造)1毫摩尔溶解于二氯甲 烷中，在室温下滴加含有1毫摩尔二环己基碳化二亚胺(和光纯药株式会社制造)的二氯 甲烷溶液作为缩合剂。过滤反应液，除去副产物二环己基尿素，进行浓缩、干燥，得到氨基被 保护起来的中间体(Boc-NH-CH2-CO- (O-CH2CH2) 7-0_C18H35)。向该中间体加入1 2ml左右的三氟乙酸(和光纯药株式会社制造)，在室温下进 行2小时利用酸处理的脱Boc反应。通过TLC确认反应的进展。减压浓缩反应液，除去过 剩的三氟乙酸，得到目标物即胺化合物的三氟乙酸盐。生成物用1H-NMR确认。[实施例2]羧甲基纤维素(CMC-Na)与H2N-CH2-CO-(O-CH2CHJz-O-C1J^ 的偶合将CMC-Na (日本制纸化学株式会社制造、F600MC、取代度0. 69) 200mg溶解在40ml 水中，进而加入四氢呋喃40ml进行混合，得到均勻溶液。在该溶液中，加入相对于CMC-Na 的羧基1当量为0. 2当量的实施例1中合成的H2N-CH2-CO-(O-CH2CH2)7-O-C18H35的三氟盐酸 盐，进行混合。将相对于H2N-CH2-CO-(O-CH2CH2)7-O-C18H35 分别为 1. 1 当量的 EDC (1-乙 基-3_[3-( 二甲氨基)丙基]碳化二亚胺·Ηα、和光纯药工业株式会社制造)和 HOBt · H2Od-羟基苯并三唑· 1水合物、和光纯药工业株式会社制造)溶解在IOml的四氢 呋喃/水=1/1的溶液中，添加到反应体系中，然后整夜搅拌。搅拌后，用旋转蒸发器浓缩 反应液，从而除去四氢呋喃，使水蒸发，浓缩至整体量的约1/3，将反应液加入乙醇中，使其 形成沉淀。滤出沉淀，使该沉淀物悬浮于乙醇中，搅拌24小时，回收沉淀物并真空干燥，从 而得到纤维素衍生物。对得到的纤维素衍生物进行元素分析，由碳和氮的比例算出取代度。 其结果是，取代度为0. 16。[实施例3]水凝胶的制备将实施例2中得到的纤维素衍生物IOmg溶解在离子交换水1990mg中，制成浓度 0. 5重量％的水凝胶。得到的水凝胶为无色透明，即使倾斜容器也不发生流动，可以简便地 插入药勺等金属刮勺，可以通过25G的注射针容易地挤出。另外，测定所得水凝胶的复弹性模量，结果是177N/m2。水凝胶的复弹性模量是使 用动态粘弹性测定装置Rheometer RFIII (TAInstrument)，在37°C、角速度10rad/sec的条 件下测定的。[实施例4]腹腔内粘连实验使用日本查士睿华(CharlesRiver)(株)的 Sprague-Dawley(SD)系大鼠(10 只)，按照Buckenmaier CC 3rd等的方法制作出腹腔内粘连模型[Buckenmaier CC 3rd, Pusateri AE,Harris RA,Hetz SP :Am Surg. 65 (3) :274_82，1999]。即，将大鼠在戊巴比妥 钠的腹腔内给药麻醉下，背卧位固定，腹部剃毛后，用消毒用乙醇消毒。进一步，用聚烯吡酮 碘(Isojin)消毒液对手术区域进行消毒后，沿腹部正中线切开3 4cm，使盲肠露出。对 于露出的盲肠的一定面积(1 2cm2)，用灭菌纱布擦过，直至发生点状出血。将盲肠复位， 进而在相对的腹壁上制作缺损(8mmX16mm)。之后，在腹壁的缺损部位涂布如下制得的水
8凝胶(Iml)将实施例2中得到的纤维素衍生物IOmg溶解于注射用蒸馏水990mg中，制成 浓度1.0重量％的水凝胶。将切开部位的肌肉层连续缝合后，用4 5针缝合皮肤。创伤 部用聚烯吡酮碘消毒液消毒后，放回笼子。制成模型4周后，将动物在戊巴比妥钠麻醉下开 腹，用肉眼观察腹腔内粘连的程度，按照以下所示的标准打分。(分数分类)分数0 没有发现粘连的状态分数1 轻度牵拉下断开程度的弱粘连状态分数2 能够承受轻度牵拉的中等程度的粘连状态分数3 非常结实的粘连状态进而，发现了粘连的情况下，用缝合线在盲肠上缝上曲别针，用Metric Gauges (Eff-93953-05,Cole-Parmer公司制造)对其进行牵拉、测定盲肠从腹壁脱离的最大 强度(单位是gf、lgf 0.00981N)，将该值作为粘连的强度，进行评价。无粘连的情况下， 作为Ogf来处理。结果是，粘连分数、强度分别为0. 8士 1. 3,122. 6士203. 5gf (平均值士标准偏差)。[比较例1]作为对照，不涂布水凝胶而进而与实施例4相同的操作，评价粘连程度、强度。结 果是，粘连分数、强度分别为1.4士1.5、331.2士364. 9gf(平均值士标准偏差)。以上，在4周后，比较例1中发生牢固的粘连，与此相对，实施例4中，粘连程度、强 度显著被抑制。由此可知，由实施例2中所得纤维素衍生物得到的水凝胶，确认在生物体内 具有显著抑制粘连的效果，可以有效防止手术后的粘连。产业实用性本发明的纤维素衍生物，通过形成具有高粘弹性的水凝胶，从而能够留在体内的 特定场所，因此可以用于伤口保护、形成脏器间的物理性隔离屏障。另外，通过使药物浸渗于本发明的水凝胶中，可以实现局部的药物释放系统。另外，本发明的水凝胶具有注入生物体内即均被分解或被吸收的特性，可以优选 地用于外科手术时使用的注入用凝胶材料或再生医疗的支架材料等。作为其他的用途，能够用于护发产品或皮肤保湿剂等日用品用途、化妆品用途等。 进而，也可以用于细胞培养载体、微生物的培养载体、牙科用植入材料等。培养细胞得到的 成型品与细胞的复合体可以也可以用于细胞芯片等的读出、诊断等用途。
权利要求
以下述式(1)表示的化学结构为重复单元的纤维素衍生物，式(1)中、R1、R2和R3各自独立地选自由下述式(a)、(b)和(c)构成的组， H (a) CH2 COOM (b) CH2 CO NH X CO Y Z (c)式(b)中，M为氢原子、碱金属或碱土金属，式(c)中，X为碳原子数1～10的2价烃基，Y为两末端具有氧原子的、由聚亚烷基氧化物衍生的2价基团，Z为碳原子数1～24的烃基或 CO R4(其中的R4为碳原子数1～23的烃基)。FPA00001159649500011.tif
2.如权利要求1所述的纤维素衍生物，其中，取代基(c)的取代度和取代基(b)的取代 度之比Rc/b为0. 01 0. 4。
3.如权利要求1或2所述的纤维素衍生物，其中，Y的聚亚烷基氧化物的重复单元为 2 100个。
4.水凝胶，其含有相对于水100重量份为0.1 2. 0重量份的权利要求1至3的任一 项所述的纤维素衍生物。
5.含有权利要求1至3的任一项所述的纤维素衍生物的医疗用材料。
6.含有权利要求1至3的任一项所述的纤维素衍生物的防粘连材料。
全文摘要
本发明涉及作为纤维素衍生物的羧甲基纤维素所具有的多个羧基中，一部分被-CO-NH-X-CO-Y-Z取代而形成的纤维素衍生物、以及其水凝胶。其中，X是碳原子数1～10的2价烃基，Y是两末端具有氧原子的、由聚亚烷基氧化物衍生的2价基团，Z是碳原子数1～24的烃基或-CO-R4，R4是碳原子数1～23的烃基。所述水凝胶的粘弹性优异，并且可以用注射器等注入器注入规定的场所，因此可以用作为医疗用凝胶和防粘连材料。
文档编号C08B11/12GK101903407SQ20088012097
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月17日 优先权日2007年12月17日
发明者伊东雅弥, 兼子博章, 远藤信幸 申请人:帝人株式会社