专利名称：一种低分子肝素的基团修饰方法
技术领域：
本发明涉及一种抗凝血药物天然低分子肝素的基团修饰方法。
背景技术：
低分子肝素作为一种重要的抗凝血药物，是由肝素经化学法、酶
法或物理法降解或分离得到的分子量在3000 8000Da的糖氨聚糖片 段。与传统的肝素相比，低分子肝素具有抗血栓作用强、出血副作用 小、生物利用度高、血浆半衰期长等优点，在国际市场上已开始逐渐 取代肝素。
肝素主要来源于畜禽副产物中的猪小肠黏膜、牛肺等，并且我国 是国际上最主要的肝素供应国，肝素钠是我国最重要的创汇产品之 一，80%的粗品或精品肝素出口到美国和德国。但我国应用的低分子 肝素主要依靠进口，是由国外将肝素钠再行降解形成低分子肝素后再 输入到我国。目前临床上用于抗血栓的药剂主要是低分子肝素制剂， 据IMS统计，2004年肝素市场的全球销售额己突破40亿美元，其中
低分子肝素制剂在肝素制剂销售额的比例也逐年上升，目前递增率已 达到85%以上。2004年我国低分子肝素制剂的销售额达到了 3. 5亿人 民币。因此，不断完善从粗品原料到精品再到成品制剂完备的产业链， 研究低分子肝素制备技术的提升、创新将具有重要的经济意义和社会 效益。
尽管我国畜禽副产物极为丰富，但目前其综合利用、精深加工水 平和技术装备落后；另外，目前天然低分子肝素的制备方法都存在着 生产成本高、效率低、环境污染大、不符合药典标准、产品毒副作用 大、活性低等缺陷。
发明内容
为解决背景技术中的不足，本发明提供一种低分子肝素的基团修 饰方法，应用该方法使低分子肝素的活性得到了提高。
本发明所采用的技术方案内容是该低分子肝素的基团修饰方法 以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，按如下步骤进行基团修饰将所述的低分子肝素添加到氯磺酸-吡啶酯化试剂中，通过不同 温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。
上述的温度为15°C 25°C，时间为lh 2. 5h，酯化试剂与低分 子肝素量比例为10:1(体积质量比)，酯化试剂氯磺酸与吡啶的体积 比为l:l;温度为20。C，时间为2. 5h。
本发明的有益效果是经过基团修饰后的抗凝血药物天然低分子
肝素使低分子肝素的活性得到了提高。并具有以下特点(l)抗FXa 强，抗F II a弱，抗血栓作用强，出血副作用小；(2)分子量小， 生物利用度高，血浆半衰期长；(3)不与肝素结合蛋白结合，因此量 效关系稳定，按体重给药，控制剂量，不需要进行实验室监测；(4)较 少与血小板结合，不易引起血小板减少。
图1是反应温度对取代度的影响的关系曲线图； 图2是反应时间对取代度的影响的关系曲线图； 图3是酯化试剂比对取代度的影响的关系曲线图； 图4是硫酸基测定标准曲线图； 图5是低分子肝素标准品红外光谱图； 图6是修饰后低分子肝素红外光谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明
实施例1、反应温度是Wolfrom法中影响取代度的的重要因素， 首先对反应温度的影响范围进行了单因素试验，其它两个因素反应时 间和酯化试剂比例分别为2h和1: 1，试验结果见图1。由图1可知， 随着反应温度的升高，取代度呈不断升高的趋势，主要是因为温度升 高使各官能团更易于被取代，从而使低分子肝素的取代度提高，但取 代度并不随着温度的升高不断增加，当温度超25"C时取代度反而下 降，主要与低分子肝素可被硫酸基取代的官能团的数量有关。在反应 温度继续升高时，反应剧烈程度增加，在添加酯化试剂过程中冒出大 量的黄色三氧化硫烟雾，同时导致LMWH结构的破坏，影响其活性， 故反应温度应控制在25°C以下为宜。
实施例2、在进行了反应温度对取代度的影响作用以后，继续对
4反应时间的影响作用进行了试验分析，反应温度为15°C，酯化试剂
比为l:l，试验水平数为五个，试验结果见图2。根据不同反应时间
对取代度的影响结果及图2可知随着反应时间的延长，取代度不断
增加。但超2.5h后，取代度反而有所下降，主要与LMWH的结构有 关，在LMWH主体结构中共有3个可以取代的基团，反应时间延长 后已添加的硫酸基团可能被其它基团所取代，导致取代度的下降。所 以时间为1 h 2. 5h为宜。
实施例3、不同的酯化试剂及其配比也是影响取代度的一个重要 因素，试验过程中研究了 Wolfrom法中酯化试剂的比例对取代度的影 响，反应时间2h，反应温度15'C，结果见图3。由图3可知随着氯 磺酸与吡啶比例的降低，取代度呈下降趋势，原因为酯化试剂中硫酸 基团的比例不断下降，能够取代低分子肝素结构上官能团的基团较少 从而使取代度也不断下降。试验分析结果表明3:1、 2:1、 1:1、 1:2、 1:3五个水平间差异均不显著，优选酯化试剂比为1:1，是考虑到反应 剧烈程度较小。
实施例4、硫酸基含量测定方法及取代度(DS)测定方法。 硫酸基含量测定方法参照玫棕酸钠法(C6Na206)测定硫酸基含量， 要求所有玻璃容器采用稀硝酸清洗后再用蒸馏水冲洗干净。具体方法 如下
a. BaCl2缓冲溶液的配制
分别取2M的乙酸10mL， 0. 005M的BaCl22mL， 0. 02M的NaHC038mL， 后添加无水乙醇定容至100mL。
b. 玫棕酸钠溶液的配制
称取5mg玫棕酸钠于20mL水中溶解，后加入lOOmgL-抗坏血酸， 摇匀，无水乙醇定容至100mL。溶液颜色为淡棕色，30min后使用， 有效期两天。
c. 硫酸基标准溶液的配制
取2 12ug硫酸物(硫酸或硫酸钠)于O. 5mL水中。试验过程 中称取0. 500mg色谱纯硫酸钠定容至1000mL,备用。
d. 具体步骤
取O. 5mL待测样，标准液与水加入到试管中后，再加2mL乙醇，若产生沉淀进行离心至澄清；加入lmL BaCl2缓冲溶液与1. 5mL玫棕 酸钠溶液后摇匀于室温条件下暗室静置10min，颜色的强度采用分光 光度法进行测定，在520nm，颜色保持30min不变。
取代度DS(degree of substitution)的测定设多糖分子量为 162n，其中n为单糖数目，-OH取代后变为-0S03Na，分子量增加102， 32为S的原子量，则有
(注M为硫总含量；X为原LMWH硫酸基含量。通过测定X为0. 12) Wolfrom法正交试验取代度测定结果见表1。 '
Wolfrom法L9(34)正交试验因素水平表 表1
水平A(温度)/'CB(时间)/hC(酯化试剂比)
1101.52:1
2151:1
3202.51:2
Wolfrom法正交试验结果表2
序号 A(温度)厂C B(时间)/h C酯化试剂比D(空列)取代度
11i110.82
21220.93
313330.95
4210.92
5211.01
63121.04
7121.09
83131.10
93311.12
K!2.72.832.962.958.98
K22.973.042.973.06
K33.313.113.052.97
Ki0.90.940.990.98
K20.991.010.991.02
K31.101.041.020.99
6Wolfrom法方差分析结果 表2
变异来源平方和自由度均方F值
A(温度)/'C0.0620.0315
B(时间)/h0.01420.0073.5
CpH0.00220週
误差E0.00420.002
总和T0.088
对修饰条件影响较大的温度、时间及酯化试剂比进行U (34)正 交试验与方差分析，以取代度作为指标；为减少试验误差，参照空列 作为对比试验，试验分析结果A因素(反应温度)F二15大于F。.。1(2,
9)二8.02之值，F。.。5(2, 9尸4.26差异极显著，B (反应时间)、C (酯化试 剂比例)影响不显著。确定了 Wolfrom法对低分子肝素进行硫酸基团 修饰的最佳条件为A3B3C2，即温度2(TC，反应时间2.5h，酯化试剂比 为l:l，进行此条件下的验证试验测得取代度结果分别为1. 15、1. 11、 1.15，试验条件可靠。
实施例5、低分子肝素抗FXa与抗FIIa活性的测定 在温度2(TC、反应时间2.5h及酯化试剂比为l:l条件下硫酸基 修饰后的低分子肝素低分子肝素抗FXa与抗Flla活性的测定结果
样品效价测定结果(『3) 表3
样品号抗FXa抗FHa抗FXa与抗FlIa活性比率可信限率FL%
标准样品8451864.543.6
测定样品168344.943.1
低分子肝素的抗凝效价随着分子量的降低而降低，其原因主要是 抗凝活性主要取决于作为主体结构的五糖序列，而在肝素降解过程 中，有可能在五糖序列上发生裂解，且分子量越小，在五糖序列发生 裂解的可能性越大，从而导致抗凝活性的降低。不同硫酸化程度的低
分子肝素生物活性不同①抗凝血和抗平滑肌增生都需要N-硫酸化 和O-硫酸化，其中N-硫酸化是抗凝血活性所必需，但不是抗平滑肌 增生所必需，因此N-硫酸化程度越高，低分子肝素抗凝活性越强， O-硫酸化程度越高，低分子肝素抗平滑肌增生活性越强；②低分子肝 素可以通过抑制类肝素酶活性发挥其抗炎和抗肿瘤转移活性，肝素的 类肝素酶抑制活性与o-硫酸化程度有关，O-脱硫酸化后不具有类肝 素酶抑制活性。由上表的测定结果表明Wolfrom法修饰后的低分子肝素生物活性较标准品高8%左右。
根据抗FXa与抗Flla活性比率测定的结果，均符合药典抗FXa 与抗FIIa活性比率大于1的规定。另外，可信限率FL。/。是精密度的 标志，《中国药典(2005版)》规定可信限率不得大于5%，试验样 品的测定结果可信限率均未高于5%，说明试验结果可信。
实施例6、低分子肝素结构分析与鉴定
低分子肝素主要是由糖醛酸和葡萄糖胺组成的糖胺聚糖，在对修 饰后的低分子肝素进行活性测定的基础上，又利用红外光谱仪对其结 构进行了测定。由于所得样品低分子肝素为固体粉末，选用溴化钾压 片法。溴化钾压片法是制备固体样品最常用的方法，主要由于溴化钾 在中红外区有较高的透光率，本身不显吸收。结果见图5、图6。
图5为低分子肝素标准品的红外图谱，图6为Wolfrom法(温度 20°C、反应时间2.5h及酯化试剂比为l:l的条件下)得到的修饰后 的低分子肝素红外图谱，在860cm—工和940cm—i处出现肝素的特征吸收 峰，说明降解得到的低分子肝素的基本结构没有发生变化，将两图进 行对比分析，磺酸类在1150 cm—'具有小峰的宽峰，制备得到的低分 子肝素样品1与标准品图谱进行比较可以看出，制备得到的低分子肝 素样品在1750cm—'处的峰消失，可能由于进一步的降解导致；另外， 在1150 cnfi处的波峰明显变大，说明硫酸基团的含量增强，与取代 度的测定结果相吻合。且保持了低分子肝素的主体糖链结构，通过活 性的测定，发现其抗FXa与抗FlIa活性有所提高。
实施例7、低分子肝素理化性质的测定
在对低分子肝素的生物活性、红外结构进行测定的基础上，根据 中国药典的要求，对Wolfrom法制备得到的低分子肝素的理化性质进 行了鉴定，低分子肝素均为白色固体粉末，易溶于水，不易溶于乙醇 和丙酮。试验过程中选取了三次平行试验的样品分别进行了测定，其 它理化分析结果见表4。
低分子肝素理化分析结果(n=3) 表4
指标测定样品1测定样品2测定样品3
比旋度[(X]D201.33361.33381.3339
pH4.95.55.8
吸收 260nm0.1850.1790.182
8度 280nm
相对分子量(粘度法)
特性粘度[n〗
硫酸根/羧酸根 蛋白含量(％) 氮含量(％) 干燥失重(％) 炽灼残渣(％)
样品l、 2、 3的制备条件均为温度2(TC，反应时间2.5h，酯化试剂 比为1:1。
a. 比旋度的测定
折光率因物质的温度与光线的波长而改变，透光物质的温度升
高，折光率变小，光线的波长越短，折光率就越大。折光率以n。t表 示，D位钠光谱的D线，t位测定时的温度。测定前，折光计读数应 用校正用棱镜或水校正，2(TC时水的折光率位1.3330， 25'C时为 1.3325， 40。C时位1.3305。
本药典内系用钠光谱的D线测定供试品相对于空气的折光率，除 另有规定外，供试品温度为室温。测定折光率可以区别不同的油类或 检查某些药品的纯杂程度。测定结果见表4。
b. 酸碱度的测定
取本品O. lg，加水10mL溶解后，采用pH计进行测定。
c. 吸收度的测定
取本品，加水制成lmL中含4mg的水溶液，在260nm的波长处， 其吸收度不得大于2，在280nm波长处，其吸收度不得大于0. 15，测 定结果见表4。
d. 粘度的测定
在25±o. rc测定其动力粘度，测定结果见表4。
e. 总氮量的测定
半微量凯氏定氮法，按干燥品计算，测定结果见表4。
f. 干燥失重的测定
取本品，在6(TC减压干燥至恒重，测定结果见表4。
g. 硫酸根/羧酸根的测定
英国药典规定低分子肝素的硫酸根离子与羧酸根离子的摩尔比不得小于1.8，目的是控制生产过程中勿使硫酸根离子过多水解。本 实验分别测定肝素(A)、分解后未脱盐(B)、分解后脱盐产品(C)的 电导率变化，从而测得硫酸根离子与羧酸根离子的比值，测定结果见
h.炽灼残渣检査法的测定
准确称量供试品lg，置己炽灼至恒重的坩埚中，精密称定，缓 缓炽灼至完全炭化，放冷；移至干燥器内，放冷，精密称定后，再在 700 80CrC炽灼至得恒重，结果见表4。
硫酸基是影响低分子肝素生物活性的重要基团，为了提高亚硝酸 降解法制备低分子肝素的生物活性，以硫酸基取代度为指标对低分子 肝素进行了基团修饰条件的研究，并得到了活性较高的低分子肝素。
权利要求
1、一种低分子肝素的基团修饰方法，以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，其特征在于按如下步骤进行基团修饰将所述的低分子肝素添加到氯磺酸-吡啶酯化试剂中，通过不同温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。
2、 根据权利要求1所述的低分子肝素的基团修饰方法，其特征在于温度为15°C 25°C，时间为1 h 2.5h，每lg低分子肝素中 需添加酯化试剂10mL，酯化试剂氯磺酸与吡啶的体积比为1:1。
3、 根据权利要求2所述的低分子肝素的基团修饰方法，其特征 在于温度为20。C，时间为2.5h。
全文摘要
本发明涉及一种低分子肝素的基团修饰方法。该方法以亚硝酸钠降解所得的低分子肝素为原料，将所述的低分子肝素添加到氯磺酸-吡啶酯化试剂中，通过不同温度、时间、酯化试剂比例反应条件控制硫酸基的取代度。应用该方法使低分子肝素的活性得到了提高。
文档编号C08B37/10GK101597343SQ20091007197
公开日2009年12月9日 申请日期2009年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者刘妍妍, 崔素萍, 张丽萍, 李良玉, 李雷刚, 健 贾, 魏文义 申请人:张丽萍