曲古抑菌素A在维持干细胞干性中的用途的制作方法与工艺

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地，本发明涉及曲古抑菌素A在维持干细胞干性中的用途。更具体地，本发明涉及曲古抑菌素A在维持干细胞干性中的用途、干细胞培养基、用于干细胞培养的试剂盒以及干细胞培养方法。

背景技术：
干细胞，尤其是间充质干细胞（mesenchymalstemcells,ormesenchymalstromalcells,MSCs），能够促进多种损伤组织的修复，具有广泛的临床应用前景。但是，干细胞会在体外扩增时发生自主分化和衰老，即无法维持干性，从而降低了其分化形成其它更为重要的细胞如神经细胞和心肌细胞的能力，这是目前干细胞培养的突出问题，也会严重制约干细胞的临床应用。因而，目前的干细胞培养中有效维持其干性，意义重大。

技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效维持干细胞干性的方法。需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：表观遗传是调节干细胞干性的重要机制，不恰当的培养条件能够使Oct4、CXCR4、端粒酶等干性相关基因的表达发生表观遗传的改变，尤其是组蛋白乙酰化的改变，从而造成MSCs在体外培养时发生自主分化、干性下降。因而，预防或纠正这些基因表观遗传改变可保持或恢复MSCs的原有特性。曲古抑菌素A(TrichostatinA，TSA）源自链霉菌代谢产物，是一种短链脂肪酸，具有多种生物学作用最先作为抗真菌药物使用。发明人发现，在传统MSCs培养液中添加一定剂量的TSA（例如6-50nM）能够有效地维持MSCs扩增培养过程中的组蛋白乙酰化的状态，从而能够有效地维持MSCs的性状。而在作用机制方面，TSA能够通过与Zn2+的螯合作用特异的、可逆的抑制哺乳动物组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的活性，从而证明了发明人的上述发现。由此，本发明提出了以下几个方面：根据本发明的一个方面，本发明提出了曲古抑菌素A在维持干细胞干性中的用途。具体地，发明人发现，在传统干细胞培养基中添加一定剂量例如6-50nM的TSA，能够有效地维持干细胞扩增培养过程中的组蛋白乙酰化的状态，从而能够有效地维持干细胞的干性，避 免干细胞在体外培养时发生自主分化。其中，需要说明的是，在本文中所使用的术语“干细胞”包括所有类型的干细胞，例如间充质干细胞以及其他成体干细胞等。根据本发明的又一方面，本发明提出了一种干细胞培养基。根据本发明的实施例，该干细胞培养基包含：基础培养基；以及6-50nM的曲古抑菌素A。发明人惊奇地发现，利用本发明的干细胞培养基进行干细胞培养，能够有效地维持干细胞扩增培养过程中的组蛋白乙酰化的状态，从而能够有效地维持干细胞的干性，减少干细胞体外培养过程中的自主分化，减缓衰老进程，则经过体外扩增培养获得的干细胞将更有效地用于干细胞移植等临床治疗。另外，根据本发明上述实施例的干细胞培养基还可以具有如下附加的技术特征：根据本发明的实施例，基础培养基的种类不受特别限制，可以根据所要培养的干细胞的种类，选择合适的基础培养基。根据本发明的实施例，所述基础培养基为选自DMEM、IMDM和MEM的至少一种。根据本发明的一些具体示例，对间充质干细胞进行培养所采用的本发明的干细胞培养基中所包含的基础培养基为低糖DMEM。根据本发明的实施例，本发明的干细胞培养基中曲古抑菌素A的浓度不受特别限制，只要在6-50nM范围内，该干细胞培养基均能够满足干细胞干性维持的要求。根据本发明的一些具体示例，所述干细胞培养基含有6.25-12.5nM所述曲古抑菌素A。根据本发明的另一些实施例，所述干细胞培养基含有6.25nM所述曲古抑菌素A。由此，本发明的干细胞培养基维持干细胞干性的效果更好，利用该培养基进行干细胞培养，干细胞在体外扩增时自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。根据本发明的实施例，本发明的干细胞培养基还可以进一步包括其他干细胞体外扩增培养所需要的组分。根据本发明的实施例，本发明的干细胞培养基进一步包含选自血清、细胞因子、细胞外基质分子的至少一种。其中，根据本发明的一些实施例，所述血清为胎牛血清。根据本发明的另一些实施例，所述细胞因子为bFGF。根据本发明的一些具体示例，所述细胞外基质分子为选自fibronectin、胶原蛋白和透明质酸的至少一种。即，在传统干细胞培养基尤其是目前应用最多、培养效果较好的干细胞培养基中添加6-50nM曲古抑菌素A，即可获得本发明的干细胞培养基。根据本发明的一些具体示例，本发明的干细胞培养基为添加了6-50nM曲古抑菌素A，10%胎牛血清，100IU青霉素和100μg/ml链霉素的低糖DMEM。由此，该干细胞培养基非常适于培养干细胞尤其是间充质干细胞，利用该干细胞培养基培养获得的干细胞干性好，自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。根据本发明的再一方面，本发明提出了一种用于干细胞培养的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒中含有6-50nM的曲古抑菌素A。发明人发现，在干细胞培养过程中使用该试剂盒，即添加6-50nM的曲古抑菌素A，能够有效地维持干细胞的干性，减少干细胞体外培养过程中的自主分化，减缓衰老进程，则经过体外扩增培养获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。根据本发明的实施例，本发明的用于干细胞培养的试剂盒中曲古抑菌素A的浓度不受 特别限制，只要在6-50nM范围内，该试剂盒均能够满足干细胞干性维持的要求。根据本发明的一些具体示例，该用于干细胞培养的试剂盒中含有6.25-12.5nM所述曲古抑菌素A。根据本发明的另一些实施例，该用于干细胞培养的试剂盒中含有6.25nM所述曲古抑菌素A。由此，将本发明的试剂盒用于干细胞培养过程中时，培养获得的干细胞干性好，自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。根据本发明的实施例，本发明的用于干细胞培养的试剂盒中还可以进一步包括其他干细胞体外扩增培养所需要的组分。根据本发明的实施例，本发明的用于干细胞培养的试剂盒中进一步包括基础培养基。其中，根据本发明的一些具体示例，所述基础培养基为选自DMEM、IMDM和MEM的至少一种。根据本发明的实施例，本发明的用于干细胞培养的试剂盒中进一步包含选自血清、细胞因子、细胞外基质分子的至少一种。其中，根据本发明的一些实施例，所述血清为胎牛血清。根据本发明的另一些实施例，所述细胞因子为bFGF。根据本发明的一些具体示例，所述细胞外基质分子为选自fibronectin、胶原蛋白和透明质酸的至少一种。根据本发明的一些具体示例，本发明的用于干细胞培养的试剂盒中包含6-50nM曲古抑菌素A，10%胎牛血清，100IU青霉素和100μg/ml链霉素以及低糖DMEM，并且上述各组分分别设置于不同的容器中。由此，本发明的用于干细胞培养的试剂盒非常适于培养干细胞尤其是间充质干细胞，利用该试剂盒培养获得的干细胞干性好，自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种用于干细胞培养的试剂盒根据本发明的实施例，该试剂盒中包含前面所述的干细胞培养基。根据本发明的实施例，利用该试剂盒培养获得的干细胞干性好，自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中，本发明的用于干细胞培养的试剂盒非常适于培养干细胞尤其是间充质干细胞。根据本发明的又一方面，本发明提出了一种干细胞培养方法。根据本发明的实施例，该方法是利用前面所述的干细胞培养基，或者用于干细胞培养的试剂盒进行干细胞培养。根据本发明的实施例，利用该方法培养获得的干细胞干性好，自主分化现象少，衰老速度慢，进而获得的干细胞能够有效地用于干细胞移植等临床治疗中。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本发明一个实施例，添加不同浓度的TSA对MSCs培养的影响实验的结果；图2显示了根据本发明一个实施例，含6.25nMTSA的干细胞培养基对MSCs生长影响的实验结果。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例1按照以下步骤，进行实验，以研究添加不同浓度的TSA对MSCs培养的影响，并确定最适的TSA添加浓度：在常规MSCs培养液（低糖DMEM加10%胎牛血清、100IU青霉素和100μg./ml链霉素）中添加不同浓度的TSA（(0、6.25、12.5、25、50、100、200和300nM)），配制成干细胞培养基，然后于5%CO2和37摄氏度的条件下，利用该培养基培养MSCs，培养3天后收获细胞并进行细胞计数。TSA处理后的细胞计数结果见图1。如图1所示，其中*表示P<0.01。图1的结果显示经过低浓度（6-50nM）TSA处理后的MSCs数目增加。由此，表明添加6-50nM的曲古抑菌素A能够有效促进MSC的增殖，不产生明显细胞毒性。实施例2根据实施例1的实验结果，选取MSC增殖最好的TSA浓度，进行进一步的长期作用试验：用含6.25nMTSA的培养液（其他具体成分同实施例1）连续传代培养MSCs（从第1代培养至第6代），并利用细胞计数器进行细胞计数并计算累积细胞数量。其中，以含DMSO但无TSA的培养液为空白对照。各代的细胞累计数量统计结果见图2。如图2所示，其中*表示P<0.01。图2的结果显示，在第6代时含TSA培养液培养的MSCs较空白对照培养的MSCs数量增加了10倍（*P<0.01）。由此，证明了添加6.25nM的曲古抑菌素A对抑制MSC衰老、维持其干性的效果显著。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。