一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法
【专利摘要】本发明公开了一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，该方法以灰树花多糖为原料，以三氧化硫-吡啶作为磺化剂，在4-二甲氨基吡啶的催化作用下制备灰树花多糖硫酸酯。进一步地，该方法还包括将灰树花多糖在N，N-二甲基甲酰胺中的超声溶胀的步骤。本发明采用超声辅助-催化的方法合成灰树花多糖硫酸酯，降低了酯化温度，缩短了酯化时间，提高了硫酸基团取代度，取代度为1.07～2.13。采用本发明的方法反应条件安全可控，反应速度较快。
【专利说明】一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，属于中药多糖结构修饰【技术领域】。
【背景技术】
[0002]人体细胞的各种活动与糖类密切相关，多糖是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要的生物大分子，具有非特异性免疫增强功能，能提高机体免疫力，具有抗感染、抗肿瘤、抗氧化和防治病毒性肝炎、艾滋病等功能。多糖的生物活性与其结构、分子量、溶解度等因素密切相关，特别是引入某些化学基团使糖链的柔韧性和空间结构发生变化，从而引起多糖溶解度及生物活性发生改变或产生新的活性。
[0003]多糖的化学修饰主要有硫酸化、磷酸化等，而天然多糖硫酸酯，如硫酸软骨素、肝素等，较易溶于水，具有抗凝血、抗病毒等生理功能。研究发现有的自身无抗病毒活性的多糖经硫酸酯化之后表现出抗病毒特性，而对于具有抗病毒活性的某些多糖硫酸酯，在脱去其硫酸基团之后，其抗病毒活性大大降低。这使得硫酸化多糖的研究受到重视。[0004]灰树花(Grifola frondosa)为担子菌亚门、多孔菌科植物，也叫栗子蘑、莲花菌、千佛菌等，日本则称之为“舞茸”，其主要活性成份是灰树花多糖，因其有β-α — 6)分支，具有显著的生理活性，具有抑制肿瘤生长、防止肿瘤细胞转移、防止正常细胞癌变等作用。但前期研究结果表明，灰树花多糖的生物活性与其分子量正相关，而分子量较大的灰树花多糖片段难溶于水，而研究发现对灰树花多糖进行硫酸化改性之后，不仅其溶解度大大提闻，同时其抗癌活性也有很大提闻提闻。
[0005]专利文献CN1563102A公开了一种灰树花多糖硫酸酯及其制备方法与应用，其中灰树花多糖硫酸酯的制备是通过将灰树花水不溶性多糖加入到磺化剂中，在50-75°C下酯化反应2-8小时，经乙醇沉淀，中和，洗涤，干燥得到。该方法中所使用的磺化剂为氯磺酸与甲酰胺或吡啶反应生成的。采用该方法得到的产品的分子量为10-20万道尔顿，有机硫含量为8-18%。在该专利文献中多糖硫酸酯的合成采用氯磺酸作为磺化试剂，但是氯磺酸是一种强氧化剂，遇水会发生剧烈分解，放出大量的热，有浓烟，有爆炸性危险，属于限制性化学品。氯磺酸与吡啶或甲酰胺反应制备磺化剂需要在冰浴中进行，氯磺酸需缓慢滴加，而且要严格控制反应体系不能含水，操作要求较高，控制失当容易发生爆炸危险。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新的安全可控的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，降低酯化温度，缩短酯化时间，提高硫酸基团取代度。
[0007]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，以灰树花多糖为原料，以三氧化硫-吡啶作为磺化剂，在4- 二甲氨基吡啶的催化作用下制备灰树花多糖硫酸酯。
[0009]优选地，该方法还包括将灰树花多糖在N，N- 二甲基甲酰胺中超声溶胀的步骤。[0010]具体来讲，本发明的方法包括以下步骤:
[0011](I)将三氧化硫-吡啶复合物溶解在有机溶剂吡啶中，得到酯化剂均相液A ;
[0012](2)将灰树花多糖置于N，N-二甲基甲酰胺中，在频率为40~IOOHz条件下超声溶胀5~120min，得到灰树花多糖的分散液B ;然后将催化剂4- 二甲氨基吡啶溶解在分散液B中，得到含4- 二甲氨基吡啶的灰树花多糖的分散液C ；
[0013](3)将分散液C缓慢加入酯化剂均相液A中，在30~75°C油浴中反应I~6h，反应结束后冷却至室温,将酯化反应后的溶液中和至pH值为6~8,静置,抽滤；
[0014](4)滤液浓缩后用乙醇进行沉淀，沉淀经乙醇洗涤后溶解在水中，溶液进行透析纯化，纯化后的溶液经浓缩后用乙醇进行沉淀，沉淀经洗涤、冷冻干燥得到灰树花多糖硫酸酯。
[0015]优选地，所述步骤(1)中有机溶剂吡啶的用量相对于三氧化硫-吡啶复合物的用量为3~10mL/g。
[0016]优选地，所述步骤⑵中N，N-二甲基甲酰胺的用量相对于灰树花多糖的用量为10~50mL/g;4-二甲氨基吡啶与灰树花多糖的质量比为1: 2~1: 20。
[0017]优选地，所述步骤(3)中灰树花多糖与三氧化硫-吡啶复合物的质量比为1: 2~I: 10。
[0018]优选地 ，所述步骤(3)中酯化反应后的溶液用质量百分比浓度为2%~10%的NaOH溶液进行中和。
[0019]优选地，所述步骤(4)中滤液或溶液浓缩时均浓缩至原体积的1/8~1/30，浓缩液用乙醇沉淀时，加入相对于浓缩液2~6倍体积的乙醇。
[0020]优选地，所述步骤(4)中的透析纯化过程为:将溶液装入截留量为5kD~IOkD的透析袋中，流水透析12~36h ;然后用超纯水透析48~96h,超纯水透析过程中每3~6h
换一次水。
[0021 ] 优选地，所述冷冻干燥的条件为:在-50~_20°C、I~5Pa条件下冷冻干燥24~36h。
[0022]本发明的优点在于:
[0023]本发明采用超声辅助-催化的方法合成灰树花多糖硫酸酯，降低了酯化温度，缩短了酯化时间，提高了硫酸基团取代度，取代度为1.07~2.13。
[0024]本发明采用三氧化硫-吡啶复合物作为磺化剂合成灰树花多糖硫酸酯，只需将三氧化硫-吡啶复合物室温溶解于吡啶试剂中即可得到磺化剂，水的存在对安全性不会有影响，因而反应条件相对温和可控，反应速度较快。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为灰树花多糖和灰树花多糖硫酸酯的红外谱图，其中曲线I为灰树花多糖原糖的红外谱图，曲线2为灰树花多糖硫酸酯的红外谱图，横坐标为波数，cm~，纵坐标为透
光度％。
【具体实施方式】
[0026]以下通过实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。[0027]如无特殊说明，以下实施例中所用原料和试剂均可从商业途径获得，所涉及的仪器和设备均为本领域常规设备。以下实施例中所使用的灰树花多糖的相对分子量为20kD~30kD，纯度在90%以上，可以从市场购买，也可以采用以下方法进行制备:
[0028](I)将灰树花子实体粉碎，过5~20目筛，称取颗粒度为5~20目的灰树花子实体粉，加10倍超纯水浸泡30min，置于微波萃取釜中，1400W微波辐射30min，收集微波萃取液和萃余物；
[0029](2)称取适量木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶，按质量比为2: 2: I的比例混合，超纯水溶解，得酶解液，备用；
[0030](3)将微波萃取液和萃余物在一容器中混合，置于50°C水浴，按复合酶与灰树花粉质量比为0.4%的比例加入酶解液，调pH为6.0,酶解90分钟；酶提取液100°C灭酶IOmin ;灭酶结束，冷却至室温，过滤，取滤液，得酶提多糖溶液；
[0031](4)每升酶解液加40g湿S-8树脂，在40°C条件下吸附脱色；脱色多糖溶液，经截留分子量分别为30kD和20kD的微滤组件和超滤组件，得纯化灰树花多糖；纯化灰树花多糖用95%乙醇沉淀，静置24h，4000r/min离心15min，倾去上清，得沉淀，沉淀乙醇洗涤，离心，倾去上清，得沉淀，反复3次，真空干燥，得灰树花多糖。
[0032]实施例1
[0033](I)称取6.0g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。
`[0034](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3.0g,向其中加入45mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，于超声反应器中，在频率为40Hz条件下超声溶胀60min，得到灰树花多糖分散液B。
[0035](3)室温下将1.0g4_ 二甲氨基吡啶(DMAP)溶解于灰树花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰树花多糖分散液C。
[0036](4)酯化反应:将步骤(3)得到的灰树花多糖分散液C缓慢加入A中，在50°C油浴中反应3h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入6倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0037](5)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/10，浓缩液中加入5倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_40°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，得到灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为1.07。
[0038]如图1所示为灰树花多糖和灰树花多糖硫酸酯的红外谱图，其中曲线I为灰树花多糖原糖的红外谱图，曲线2为灰树花多糖硫酸酯的红外谱图。横坐标为波数，cnT1，纵坐标为透光度％。可以看出灰树花多糖硫酸酯在1231CHT1和1050CHT1处的吸收分别为S = O的弯曲振动和伸缩振动，在813CHT1处的吸收峰为C-O-S的拉伸振动，在2930CHT1处的羟基吸收峰明显降低，表明部分羟基己被硫酸基团取代。
[0039]实施例2
[0040](I)称取9.0g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。[0041](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3.0g,向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，于超声反应器中，在频率为80Hz条件下超声溶胀40min，得到灰树花多糖分散液B。
[0042](3)室温下将1.0g DMAP溶解于灰树花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰树花多糖分散液C。
[0043](4)酯化反应:将步骤(3)得到的灰树花多糖分散液C缓慢加入A中，在60°C油浴中反应3h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入5倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0044](5)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/10，浓缩液中加入5倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_40°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，得到灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为1.43。
[0045]实施例3
[0046](I)称取12g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。
[0047](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3g，向其中加入45mLN，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，于超声反应器中，在频率为60Hz条件下超声溶胀60min，得到灰树花多糖分散液B。
[0048](3)室温下将1.0g DMAP溶解于灰树花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰树花多糖分散液C。
[0049](4)酯化反应:将步骤(3)得到的灰树花多糖分散液C缓慢加入A中，在70°C油浴中反应4h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入5倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0050](5)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/15，浓缩液中加入6倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_30°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，得到灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为1.98。
[0051]实施例4
[0052](I)称取12g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。
[0053](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，于超声反应器中，在频率为60Hz条件下超声溶胀60min，得到灰树花多糖分散液B。
[0054](3)室温下将1.5g DMAP溶解于灰树花多糖分散液B中，得到含DMAP的灰树花多糖分散液C。
[0055](4)酯化反应:将步骤(3)得到的灰树花多糖分散液C缓慢加入A中，在70°C油浴中反应4h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入5倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0056](5)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/15，浓缩液中加入6倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_30°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，得到灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为2.13。
[0057]比较例I
[0058](I)称取12g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。
[0059](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，于超声反应器中，在频率为60Hz条件下超声溶胀60min，得到灰树花多糖分散液B。
[0060](3)酯化反应:将灰树花多糖分散液B缓慢加入A中，在70°C油浴中反应4h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入5倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0061](4)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/15，浓缩液中加入6倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_30°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，得到灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为0.86。
[0062]比较例2`[0063](I)称取12g三氧化硫-吡啶复合物于配有冷凝、搅拌、加热装置的反应器中，向其中加入60mL吡啶，室温搅拌，使三氧化硫-吡啶复合物充分溶解，得酯化剂均相液A。
[0064](2)称取经脱色、分级纯化处理的灰树花多糖3g，向其中加入45mL N，N_ 二甲基甲酰胺(DMF)，搅拌12h，使灰树花多糖充分容散，得到灰树花多糖分散液B。
[0065](3)酯化反应:将灰树花多糖分散液B缓慢加入A中，在70°C油浴中反应4h，反应结束，冰水冷却至室温，5% NaOH调pH值为6，静置，抽滤，滤液旋蒸浓缩至原体积的1/15，再加入5倍体积的乙醇，充分混合，室温静置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用乙醇洗涤，抽滤，沉淀蒸馏水溶解，得溶液D。
[0066](4)将溶液D装入截留量为5kD的透析袋中，流水透析24h，超纯水透析72h，每6h换一次水。透析结束，透析袋内的液体旋蒸浓缩至原体积的1/15，浓缩液中加入6倍体积的乙醇进行沉淀，室温静置过夜，离心，抽滤，滤饼乙醇洗涤，在_30°C、5Pa条件下冷冻干燥36h，灰树花多糖硫酸酯，其中硫酸根的取代度为0.69。
[0067]如表1所示，为以上实施例1~4及比较例1、2在相应工艺条件下合成灰树花多糖硫酸酯的数据结果。
[0068]表1
[0069]
【权利要求】
1.一种超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，以灰树花多糖为原料，以三氧化硫-吡啶作为磺化剂，在4- 二甲氨基吡啶的催化作用下制备灰树花多糖硫酸酯。
2.根据权利要求1所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，还包括将灰树花多糖在N，N- 二甲基甲酰胺中的超声溶胀的步骤。
3.根据权利要求2所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将三氧化硫-吡啶复合物溶解在有机溶剂吡啶中，得到酯化剂均相液A； (2)将灰树花多糖置于1^二甲基甲酰胺中，在频率为40-100取条件下超声溶胀5~120min,得到灰树花多糖的分散液B ;然后将催化剂4- 二甲氨基吡啶溶解在分散液B中，得到含4- 二甲氨基吡啶的灰树花多糖的分散液C ； (3)将分散液C缓慢加入酯化剂均相液A中，在30~75°C油浴中反应I~6h，反应结束后冷却至室温,将酯化反应后的溶液中和至pH值为6~8,静置,抽滤； (4)滤液浓缩后用乙醇进行沉淀，沉淀经乙醇洗涤后溶解在水中，溶液进行透析纯化，纯化后的溶液经浓缩后用乙醇进行沉淀，沉淀经洗涤、冷冻干燥得到灰树花多糖硫酸酯。
4.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤⑴中有机溶剂 吡啶的用量相对于三氧化硫-吡啶复合物的用量为3~10mL/g。
5.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤⑵中N，N-二甲基甲酰胺的用量相对于灰树花多糖的用量为10~50mL/g ;4-二甲氨基吡啶与灰树花多糖的质量比为1: 2~1: 20。
6.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(3)中灰树花多糖与三氧化硫-吡啶复合物的质量比为1: 2~1: 10。
7.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(3)中酯化反应后的溶液用质量百分比浓度为2%~10%的NaOH溶液进行中和。
8.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(4)中滤液或溶液浓缩时均浓缩至原体积的1/8~1/30，浓缩液用乙醇沉淀时，加入相对于浓缩液2~6倍体积的乙醇。
9.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的透析纯化过程为:将溶液装入截留量为5kD~IOkD的透析袋中，流水透析12~36h ;然后用超纯水透析48~96h,用超纯水透析过程中每3~6h换一次水。
10.根据权利要求3所述的超声辅助-催化合成灰树花多糖硫酸酯的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为:在-50~-20°C、1~5Pa条件下冷冻干燥24~36h。
【文档编号】C08B37/00GK103819573SQ201410082155
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】刘红梅 申请人:北京联合大学