技术领域本发明涉及天然产物分离纯化领域，特别是一种玛咖生物碱的制备方法。
背景技术：
玛咖(LepidiummeyeniiWalp.)是十字花科独行菜属草本植物，原产于秘鲁海拔500m-4450m的安第斯山区，可在昼夜温差较大、无肥、长期冰封和缺氧的特殊条件下生长素有“秘鲁人参”的美誉。高营养价值、合理的营养结构以及多种活性次级代谢物使玛咖具有多种营养保健功能和药理作用，可用于增强精力、提高生育力、改善性功能、治疗更年期综合症、风湿症、抑郁症、贫血等，还有抗癌和抗白血病功效。研究表明，生物碱是玛咖的主要活性成分之一，玛咖生物碱作用于脑垂体和视丘下部，调节内分泌腺（如肾上腺、甲状腺、胰腺、卵巢等），平衡荷尔蒙；玛咖生物碱可用来补充雌二醇分泌的不足，故可作为外源雌激素替代物来缓解下丘脑和脑垂体功能亢进；含有玛咖酰胺和玛咖烯等组分可以促进性欲；此外，体外抑制癌细胞实验表明：玛咖咪唑类生物碱lepidilineA对FDIGROV细胞有抑制作用(ED50为7.39ug/ml)，而lepidilineB别对多种癌细胞有抑制作用，如UMUC3细胞，PACA2细胞，MDA231细胞和FDIGROV细胞(ED50分别为6.47、1.38、1.66和5.26ug/ml)。玛咖中的总生物碱含量很低，仅含有0.2%-0.4%，这给玛咖生物碱的提取和分离纯化带来了困难，目前，现有文献和专利中玛咖生物碱的提取纯化工艺复杂，需要多步的柱层析纯化，该方法不仅工序复杂，费时费力，且生物碱的回收率较低，消耗溶剂量过大、成本过高、不适用于工业化大生产。
技术实现要素：
为了克服现有分离玛咖生物碱技术的不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、高效分离玛咖生物碱单体的制备方法，即使用高速逆流色谱法和正相色谱法从玛咖中分离制备玛咖生物碱单体的方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种玛咖生物碱的制备方法，其制备方法的具体步骤为：(1)提取：将玛咖粉碎，加入5-20倍的甲醇溶液或乙醇溶液或上述两种醇的混合溶液中采用超声提取或微波提取或浸提或回流提取，提取1-3次，过滤，合并提取液，浓缩，得到浸膏；(2)除杂：将步骤(1)所得的浸膏用盐酸溶液、醋酸和硫酸溶液中的一种或两种溶解，过滤，滤液再用氢氧化钠溶液、氨水和碳酸钠溶液中的一种或两种调pH值至9-12，然后用氯仿或乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱粗提物；(3)高速逆流纯化：以烷烃、脂肪酸酯、脂肪醇、水为溶剂系统，按体积比4-10：1-13：2-13：1-10进行混合，于分液漏斗中静置过夜后分出上相和下相，脱气；将步骤(2)得到的玛咖生物碱粗提物用上相、下相或者二者等体积的混合溶液进行溶解，过滤，得到样品溶液；将配好的上相作为固定相，泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，同时调整主机转速，将配好的下相作为流动相泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄屡色谱方法进行收集，即得一定纯度的玛咖生物碱；(4)柱层析纯化：将步骤(3)得到的一定纯度的玛咖生物碱进行硅胶柱层析或氧化铝柱层析，以氯仿-甲醇或苯-氯仿为洗脱溶剂进行梯度洗脱，收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到玛咖生物碱化合物。本发明的有益效果：(1)本发明将玛咖生物碱粗提物先经氯仿萃取除杂，再以高速逆流色谱进行纯化，最后利用正相色谱法进一步纯化得到玛咖生物碱单体，工艺过程绿色环保，对环境无严重危害。(2)本发明操作简单，工艺周期短，节省试剂，洗脱剂可回收利用，降低了生产成本，提取效率高，适于工业化生产。(3)玛咖生物碱制备量大。根据所需的目标样品量，可选择不同型号的高速逆流色谱仪进行分离。其中，制备型高速逆流色谱仪进样量可达几克甚至几十克，一次分离出的玛咖生物碱单体的量即可约达中试水平。具体实施方式实施例1（1）取玛咖粉2kg，加入12L20%的乙醇溶液，混匀，超声提取40min，过滤，将残渣再按上述方法超声提取两次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏。用1%HCI溶解上述浸膏，过滤，滤液再用氢氧化钠调pH值至9，然后用氯仿萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱粗提物。（2）将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水按体积比5:1:5:1比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分离出上下相，并超声脱气20min备用。取200mg玛咖生物碱粗提物溶于20ml下相中，振荡使之完全溶解，以备高速逆流色谱分离。将配好的上相作为固定相，以20ml/min的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，开启循环水浴并设定恒温器温度为35℃，同时调整主机转速为700r/min，将配好的下相作为流动相，以2ml/min昀流速泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收集，待进样3h后，停止主机转动，将固定相推出，固定相保留率为70%，得纯度为75%的玛咖生物碱。（3）将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上硅胶柱层析，以氯仿-甲醇按照10：1，7：3进行梯度洗脱，结合液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到纯度为98%的玛咖生物碱化合物。实施例2（1）取玛咖粉5kg，加入50L60%的甲醇溶液，混匀，微波提取25min，过滤，将残渣再按上述方法提取一次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏；用2.5%醋酸溶解上述浸膏，过滤，滤液再用氨水调pH值至10，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱粗提物。（2）将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水接按体积比5:5:7:5比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分离出上下相，上相加入lOmM的三乙胺，下相加入lOmM的HCI，并超声脱气15min备用。取300mg玛咖生物碱粗提物溶于20ml下相中，振荡使之完全溶解，以备高速逆流色谱分离。将配好的上相作为固定相，以lOml/min的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，开启循环水浴并设定恒温器温度为20℃，同时调整主机转速为800r/min，将配好的下相作为流动相，以3ml/min的流速泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收集，待进样4h后，停止主机转动，将固定相推出，固定相保留率为60%，得纯度为80%的玛咖生物碱。（3）将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上中性氧化铝柱层析，以苯一氯仿按照1：1进行洗脱，结合液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到纯度为96%的玛咖生物碱化合物。以上所述为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。