本发明涉及一种生产乙酰化类鞘氨醇碱的Starmerella属的修饰微生物以及使用该微生物的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法。
背景技术：
鞘脂通过始自L-丝氨酸和脂肪酰辅酶A例如棕榈酰辅酶A之间的缩合反应的生物合成获得。鞘脂的基本结构，即，类鞘氨醇碱，其主要以链长为18个碳原子的分子合成，并且已知为，例如鞘氨醇、植物鞘氨醇、二氢鞘氨醇(二氢神经鞘氨醇sphinganine)、和6-羟基鞘氨醇。
鞘脂具有许多生理学功能。特别是神经酰胺和类鞘氨醇碱，其参与了皮肤保湿功能和皮肤屏障功能，抑制了水分从皮肤的蒸发并且在保护人体免于多种外部刺激中起作用。植物鞘氨醇被报道为针对金黄色葡萄球菌(Staphyrococcusaureus)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)具有生长抑制作用(非专利文献1和2)。具体而言，植物鞘氨醇在痤疮丙酸杆菌上的抗菌作用高于红霉素的，所述红霉素是一种大环内酯类抗生素(非专利文献3)。
已知通过外部敷用提供神经酰胺或类鞘氨醇碱显示出改善皮肤性质的作用。进而，已经证实，当向皮肤敷用植物鞘氨醇和乙酰化植物鞘氨醇的四乙酰基植物鞘氨醇时，其渗透进入皮肤并且转变为神经酰胺(专利文献1)。因此，外部敷用的神经酰胺、类鞘氨醇碱或乙酰化植物鞘氨醇预期具有对皮肤性质的改善作用以及针对造成感染的微生物的生长抑制作用。
近来，已经创立了用于对皮肤的神经酰胺构成进行具体分析的技术，并且已经发现有12类(340种或更多种)由脂肪酸和类鞘氨醇碱的组合形成的神经酰胺分子类型(非专利文献4)。例如，发现了由饱和脂肪酸和植物鞘氨醇的组合、链长为23-30个碳原子的脂肪酸和链长为16-26个碳原子的植物鞘氨醇的组合形成的神经酰胺NP，并且已知存在具有脂肪酸中的链长总计为40-52个碳原子和植物鞘氨醇的分子。作为由饱和脂肪酸和鞘氨醇的组合形成的神经酰胺NS，发现了链长为16-30个碳原子的脂肪酸和链长为16-26个碳原子的鞘氨醇的组合，并且已知存在具有脂肪酸中的链长总计为40-54个碳原子和鞘氨醇的分子(非专利文献4)。已知健康皮肤包含大量的长链神经酰胺；反之粗糙皮肤中的神经酰胺的含量较低，另外短链神经酰胺的量增加(非专利文献5)。由此，长链神经酰胺或者类鞘氨醇碱的利用性可以预期。
但是，目前市面可得的神经酰胺、类鞘氨醇碱和乙酰化植物鞘氨醇极其昂贵，例如每kg几十万日元。另外，它们的碳链长度受到限制。例如，对于神经酰胺NP和神经酰胺NS，仅可得到具有34、36或40个碳原子的分子；对于植物鞘氨醇和鞘氨醇，仅可得到具有18个碳原子的分子。
由于难以将源自动物或植物的鞘脂进行分离和提纯，近来已经开发出通过酵母发酵制备鞘脂的方法来作为制备神经酰胺和类鞘氨醇碱的方法。备选的酵母菌株包括毕赤酵母(pichiaciferrii)；目前的Wickerhamomyces酵母、产蛋白假丝酵母(Candidautilis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并且已经积极地开发出使用Wickerhamomyces酵母得到四乙酰基植物鞘氨醇的方法，其使四乙酰基植物鞘氨醇从酵母细胞中分泌(secrets)出来(专利文献6)。通过这样的方法制备的乙酰化植物鞘氨醇主要为18个碳原子的。将乙酰化植物鞘氨醇脱乙酰化并用作植物鞘氨醇，或者通过酰胺键通过化学合成键合到脂肪酸上并用作神经酰胺。
由生物合成途径的体外分析已经阐明，在Wickerhamomyces酵母中四乙酰基植物鞘氨醇合成的限速步骤是丝氨酸与棕榈酰辅酶A的缩合反应以及植物鞘氨醇的乙酰化反应。另外，发现了两种用于植物鞘氨醇的乙酰化酶，SLI1和ATF2(非专利文献7)。在它们之中，当SLI1在酿酒酵母中表达时其产生三乙酰基植物鞘氨醇(非专利文献6)。由此认为，SLI1参与了植物鞘氨醇3个羟基的任何三个位点和单一氨基的乙酰化。
另一方面，Starmerella属的微生物例如Starmerellabombicola(旧学名：Candidabombicola)已知能够在细胞外产生大量作为糖脂质的生物表面活性剂，，并且为具有高脂质利用性的微生物(非专利文献8)。但是，关于该微生物是否产生神经酰胺或者鞘脂知之甚少。
[专利文献1]US5578641
[专利文献2]JP-A-9-504434
[非专利文献1]BibelD.J.et.al.,J.Invest.Dermatol.,98,269,(1992)
[非专利文献2]BibelD.J.et.al.,Clin.Exper.Dermatol.,20,395,(1995)
[非专利文献3]ParkC.et.al.,Fragrancejournal,10,84,(1999)
[非专利文献4]MasukawaY.et.al.,J.LipidRes.,49,1466,(2008)
[非专利文献5]IshikawaJ.et.al.,J.Invest.Dermatol.,130,2511,(2010)
[非专利文献6]Veld,F.et.al.,Appl.Microbiol,Biotechnol.,97,8537,(2013)
[非专利文献7]Barenholz,Y.et.al.,Biochim.Biophys.Acta,306,341,(1973)
[非专利文献8]UdoR.et.Al.,BiotechnologyLetters,18(2),149,(1996)
技术实现要素：
本发明涉及下述(1)或(2)的发明：
(1)一种乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其包括：培养导入了编码多肽的异种基因(xenogeneticgene)的Starmerella属的微生物，所述多肽具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性。
(2)一种导入了编码多肽的异种基因的Starmerella属的微生物，所述多肽具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性。
附图说明
图1是显示乙酰化植物鞘氨醇的表达量的图，其中(A)显示了三乙酰基植物鞘氨醇(TriAPS)的生产，且(B)显示了四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)的生产。
具体实施方式
本发明涉及提供一种通过使用修饰的Starmerella属的微生物、尤其是修饰的Starmerellabombicola来制备乙酰化类鞘氨醇碱的方法。
本发明人对已知具有高脂质利用性的Starmerella属的微生物进行了研究。结果发现，该微生物无法产生足以利用的量的神经酰胺或鞘脂。他们进一步进行了探讨。结果出乎意料地发现，通过将编码多肽的异种基因导入Starmerella属的微生物并且培养该修饰的微生物，能够制备足以利用的量的乙酰化类鞘氨醇碱，所述多肽具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性，并且其产物的碳链长度主要是19或20个碳原子，这与使用Wickerhamomyces酵母的情况下的18个碳原子不同。
根据本发明，通过采用现有技术中无法产生足以利用的量的神经酰胺或者鞘脂的Starmerella属的微生物，可以以足以利用的量制备作为合成神经酰胺或神经酰胺前体物质的中间体有用的乙酰化类鞘氨醇碱，优选链长为19或20个碳原子的乙酰化植物鞘氨醇。
在本说明书中，氨基酸序列的同源性是指，对两个氨基酸序列进行比对时，两个氨基酸序列之间存在相同氨基酸残基的位点的数目相对于氨基酸残基的总数的比率(％)。具体而言，同源性根据Lipman-Pearson法进行计算(Science，227，1435，(1985))，并且在遗传信息处理软件(Genetyx-Win，Ver.5.1.1；SoftwareDevelopment)的同源性分析(同源性检索)程序的基础上通过将单位尺寸设定在2进行比较(ktup)而计算得到。
此外，术语“基因”不仅包括双链DNA，还包括构成双链DNA的单链DNA分子，例如有义链和反义链，并且不受其长度限制。进而，作为多核苷酸，能够例示的例子有RNA和DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。
在本说明书中，编码具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性的多肽的基因也称为乙酰转移酶基因，编码SLI1的基因也称为SLI1基因。
在本说明书中，“异种”指的是来自被分类为除Starmerella属之外的种属的微生物或生物体。
在本发明中，“类鞘氨醇碱”指的是链长为18-20个碳原子并具有以下基团的长链氨基醇，
链长为18个碳原子的类鞘氨醇碱的例子包括(2S,3S,4R)-2-氨基十八烷基-1,3,4-三醇(植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇(鞘氨醇)和(2S,3R)-2-氨基十八烷基-1,3-二醇(二氢鞘氨醇)；链长为19个碳原子的类鞘氨醇碱的例子包括(2S,3S,4R)-2-氨基十九烷基-1,3,4-三醇(C19植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-十九烯-1,3-二醇(C19鞘氨醇)和(2S,3R)-2-氨基十九烷基-1,3-二醇(C19二氢鞘氨醇)；并且链长为20个碳原子的鞘氨醇例子包括(2S,3S,4R)-2-氨基二十烷基-1,3,4-三醇(C20植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-二十烯-1,3-二醇(C20鞘氨醇)和(2S,3R)-2-氨基二十烷基-1,3-二醇(C20二氢鞘氨醇)。在它们之间，优选链长为19-20个碳原子的植物鞘氨醇，且更优选链长为20个碳原子的植物鞘氨醇。
在本发明中，导入Starmerella属的微生物的基因不受限制，只要该基因是被分类为除Starmerella属之外的种属的微生物或生物体所具有的，并且编码具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性的多肽即可。优选的例子包括在Wickerhamomycesciferrii、酿酒酵母或毕赤酵母中发现的被命名为SLI1的乙酰转移酶、或者由该多肽演变的多肽，具体而言可以举出编码由选自以下(a)至(i)的氨基酸序列构成并具有乙酰转移酶活性的多肽：
(a)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列构成的多肽，
(b)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(c)由与SEQIDNO：2表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(d)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列构成的多肽，
(e)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(f)由与SEQIDNO：4表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(g)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列构成的多肽，
(h)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，和
(i)由与SEQIDNO：6表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本文中，由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列构成的多肽为源自Wickerhamomycesciferrii的SLI1；由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列构成的多肽为源自酿酒酵母的SLI1；由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列构成的多肽为源自毕赤酵母的SLI1；且它们均具有乙酰转移酶活性，优选使类鞘氨醇碱乙酰化的活性。
此外，在(b)、(e)和(h)的多肽中，“一个至数个”表示1-80个、优选1-40个、更优选1-20个、更加优选1-10个。
与SEQIDNO：2表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列(c)指的是，当将其相应序列与由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列适当比对时，与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列。与SEQIDNO：4表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列(f)指的是，当将其相应序列与由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列适当比对时，与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列。与SEQIDNO：6表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列(i)指的是，当将其相应序列与由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列适当比对时，与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列。
编码多肽(a)至(i)的基因可以具有任意选定的密码子，只要肽的氨基酸序列与(a)至(i)的氨基酸序列相对应。例如，优选选择适合于Starmerella属的微生物的密码子。
乙酰转移酶活性具体包括，催化与类鞘氨醇碱的乙酰化反应的活性，优选催化与植物鞘氨醇的羟基和氨基的乙酰化反应的活性。
本发明的基因通过常规PCR法使用引物能够易于得到，所述引物按照由SEQIDNO：1、3或5表示的核苷酸序列以及以每个基因作为模板的微生物的基因组DNA来制备。
更具体而言，本发明的基因能够通过例如化学合成寡核苷酸A和寡核苷酸B；并且使用一套这些寡核苷酸A和B以及Wickerhamomycesciferrii的基因组DNA作为模板进行PCR而得到，所述寡核苷酸A由包含由SEQIDNO：1表示的SLI1基因的N-端起始密码子的序列构成，所述寡核苷酸B由和包含基因的终止密码子的序列互补的序列构成。为有效地克隆基因片段从而得到质粒载体等，能够向寡核苷酸引物的5’-端加入用于限制酶切割的序列。作为本文的引物，通常能够使用在SLI1基因的核苷酸序列上的信息的基础上化学合成的核苷酸；然而，能够令人满意地使用已经得到的SLI1基因或其片段。核苷酸的例子包括与SEQIDNO：1相对应并由10-50个连续碱基、优选15-35个连续碱基构成的部分核苷酸序列。
PCR条件为，例如，98℃下2分钟，(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下1分钟)×30个周期。
此外，本发明的基因可以由人工合成通过使用DNA合成物根据核酸序列或氨基酸序列得到。在合成DNA中，可以选择另一编码相同氨基酸残基的密码子来代替最初使用的密码子(密码子转换)。由密码子转换得到的DNA的一个方面包括DNA，在其中将在编码Wickerhamomycesciferrii的SLI1的DNA中存在但在Starmerella属的微生物中极少存在密码子(在微生物中不常使用的密码子)转换成编码相同氨基酸且在Starmerella属中非常频繁地用在微生物的翻译机制中的密码子。更具体而言，例示了由SEQIDNO：7表示的核苷酸序列构成的DNA。同样地，作为在其中将在编码酿酒酵母的SLI1的DNA中存在的密码子转换成编码相同氨基酸序列且在Starmerella属的微生物中非常频繁地使用的密码子的DNA，例示了由SEQIDNO：8表示的核苷酸序列构成的DNA。进而，作为在其中将在编码毕赤酵母的SLI1的DNA中存在的密码子转换成编码相同氨基酸序列且在Starmerella属的微生物中非常频繁地使用的密码子的DNA，例示了由SEQIDNO：9表示的核苷酸序列构成的DNA。
在本发明中，向Starmerella属的微生物中导入乙酰转移酶包括导入乙酰转移酶基因的方法，从而基因能在Starmerella属的微生物中表达。
用于导入基因从而能够表达该基因的方法没有具体的限制。可以导入核酸苷酸片段、其上游，所述片段包含乙酰转移酶基因并且适当地键合在DNA片段上，所述DNA片段包含转录起始调控区或者转录起始调控区和核糖体结合的位点。
这样的片段能够通过(1)作为核酸片段直接导入、或在质粒载体等中以核苷酸片段导入；或者通过(2)为了同源重组作为具有在两端处均具有部分寄主生物体的部分基因组序列的核苷酸片段导入，被基因稳定地保持在寄主微生物中。要被导入的基因的拷贝数没有具体限制。换句话说，可以导入单个拷贝或多个拷贝。
向寄主微生物中导入核苷酸片段的方法(1)的例子包括电穿孔法和醋酸锂法。
另外，如果根据(2)导入片段，同源重组发生在与寄主染色体的序列相对应的位点处、添加至核酸片段，并且导入的核酸片段被整合进入微生物的染色体。
需要注意的是，转录起始调控区或者结合至乙酰转移酶基因的位点上游的转录起始调控区与核糖体的结合位点没有具体限制，只要其在寄主微生物中起作用。作为例子，例示了乙酰转移酶基因的原始转录起始调控区或转录起始调控区与核糖体的结合位点，或者另一种已知的转录起始调控区或转录起始调控区与核糖体的结合位点。作为选择，例如，能够使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶、细胞色素P450单加氧酶和UDP-葡糖基转移酶基因。
向其中导入基因的Starmerella属目标微生物不受限制，只要该微生物具有产生类鞘氨醇碱、至少为鞘氨醇或植物鞘氨醇的代谢系统。其例子包括Starmerellabombicola、candidaapicola和candidafloricola。在它们之中，优选Starmerellabombicola。更具体而言，例示了StarmerellabombicolaKSM36菌株(JP-A-61-31084)。Starmerellabombicola已知产生槐糖脂(SL)(非专利文献6)但不能产生乙酰化类鞘氨醇碱。
在本发明中，乙酰化类鞘氨醇碱指的是通过将类鞘氨醇碱具有的可乙酰化的基团(羟基、氨基等)的至少一个氢原子替换为乙酰基而得到。其例子包括(2S,3S,4R)-2-氨基十八烷基-1,3,4-三醇(植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-十八烯-1,3-二醇(鞘氨醇)、(2S,3R)-2-氨基十八烷基-1,3-二醇(二氢鞘氨醇)、(2S,3S,4R)-2-氨基十九烷基-1,3,4-三醇(C19植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-十九烯-1,3-二醇(C19鞘氨醇)、(2S,3R)-2-氨基十九烷基-1,3-二醇(C19二氢鞘氨醇)、(2S,3S,4R)-2-氨基二十烷基-1,3,4-三醇(C20植物鞘氨醇)、(2S,3R,4E)-2-氨基-4-二十烯-1,3-二醇(C20鞘氨醇)和(2S,3R)-2-氨基二十烷基-1,3-二醇(C20二氢鞘氨醇)的乙酰化化合物。在它们之中，优选通过将链长为19或20个碳原子的类鞘氨醇碱的至少一个羟基或氨基替换为乙酰基得到的乙酰化类鞘氨醇碱。在它们之中，更优选通过将链长为19或20个碳原子的植物鞘氨醇的至少一个羟基或氨基乙酰化得到的乙酰化植物鞘氨醇。进而，更加优选通过将链长为20个碳原子的植物鞘氨醇的至少一个羟基或氨基乙酰化得到的的乙酰化植物鞘氨醇。
由此制备的微生物具有产生乙酰化类鞘氨醇碱、且优选乙酰化的链长为19或20个碳原子的植物鞘氨醇的能力。当培养微生物时，乙酰化类鞘氨醇碱在培养基中蓄积。
通过在培养基中培养本发明所述的微生物、在培养液中蓄积乙酰化类鞘氨醇碱，以及将培养液中所含的乙酰化类鞘氨醇碱回收，从而制备乙酰化类鞘氨醇碱。
如稍后在实施例中所述，链长为19或20个碳原子的乙酰化类鞘氨醇碱(例如，乙酰化的C19植物鞘氨醇和乙酰化的C20植物鞘氨醇)能够通过使用本发明的微生物产生。进而，通过在补充有十五酸烷基酯、十七酸烷基酯或十九酸烷基酯的培养基中培养微生物，链长为19个碳原子的乙酰化类鞘氨醇碱的含量或比率能够增加。进而，通过在补充有十八酸烷基酯的培养基中培养微生物，链长为20个碳原子的乙酰化类鞘氨醇碱的比率能够增加。
在本文中，作为烷基酯，例示了具有1-4个碳原子的烷基酯，且优选例示了甲基酯或乙基酯。
加入的脂肪酸烷基酯的量优选为1质量％或更多，且优选30质量％或更低、优选10％或更低、更加优选3％或更低。换句话说，加入的量优选为1-30质量％、更优选1-10质量％、更加优选1-3质量％。
作为用于培养的培养基，能够使用包含碳源、氮源、无机盐，如有必要的微量营养素例如氨基酸和微生物的常用培养基。任何类型的碳源和氮源可以用在培养基中，只要要被培养的酵母菌株能够利用它。
作为碳源，能够使用糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖浆。除了这些之外，有机酸例如乙酸和柠檬酸能够单独或与另一种碳源结合使用。作为氮源，能够使用硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵或硝酸盐。作为有机微量营养素，能够使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸；以及包含这些的蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物。如果使用为了生长需要氨基酸的营养缺陷型突变体(auxotrophicmutant)，优选加入需要的营养。作为无机盐，能够使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐。
优选在将培养温度控制在20-35℃时进行培养。如果在这样的条件之下进行培养，优选进行约24小时至120小时，乙酰化类鞘氨醇碱能够在培养液中蓄积。
在培养完成后，将乙酰化类鞘氨醇碱从培养液中回收。回收方法不受特别限制，并且回收可以根据已知的回收方法进行。乙酰化类鞘氨醇碱能够通过，例如将酵母细胞从培养液中除去、接着通过应用浓缩结晶法或柱色谱而回收。
关于前述实施方式，在本发明中公开了以下方面。
<1>一种乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其包括培养导入了编码多肽的异种基因的Starmerella属的微生物，所述多肽具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性。
<2>根据<1>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性的多肽由选自以下(a)至(i)的氨基酸序列构成：
(a)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列构成的多肽，
(b)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(c)由与SEQIDNO：2表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(d)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列构成的多肽，
(e)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(f)由与SEQIDNO：4表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(g)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列构成的多肽，
(h)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，和
(i)由与SEQIDNO：6表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽。
<3>根据<2>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中在(b)、(e)和(h)的多肽中，一个至数个氨基酸表示1-80、优选1-40、更优选1-20、更加优选1-10个氨基酸。
<4>根据<2>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中多肽(c)是与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列；多肽(f)是与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列；多肽序列(i)是与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列。
<5>根据<1>至<4>中任一项的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中Starmerella属的微生物是Starmerellbombicola。
<6>根据<5>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中Starmerellabombicola是StarmerellabombicolaKSM36菌株或者StarmerellabombicolaNBRC10243菌株。
<7>根据<1>至<6>中任一项的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中乙酰化类鞘氨醇碱是乙酰化植物鞘氨醇。
<8>根据<1>至<7>中任一项的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中乙酰化类鞘氨醇碱是链长为19或20个碳原子的乙酰化类鞘氨醇碱。
<9>根据<8>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中链长为19或20个碳原子的乙酰化类鞘氨醇碱是链长为19或20个碳原子的植物鞘氨醇。
<10>根据<1>至<9>中任一项的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中将选自十五酸烷基酯、十七酸烷基酯、十八酸烷基酯和十九酸烷基酯的至少一种脂肪酸烷基酯加入到培养基中。
<11>根据<10>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中脂肪酸烷基酯是具有1-4个碳原子的烷基和脂肪酸的酯。
<12>根据<10>或<11>的乙酰化类鞘氨醇碱的制备方法，其中加入至培养基中的脂肪酸烷基酯的量优选为1-30质量％、更优选1-10质量％、更加优选1-3质量％。
<13>一种导入了编码多肽的异种基因的Starmerella属的微生物，其中，所述多肽具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性。
<14>根据<13>的Starmerella属的微生物，其中具有使类鞘氨醇碱乙酰化的活性的多肽由选自以下(a)至(i)的氨基酸序列构成：
(a)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列构成的多肽，
(b)由SEQIDNO：2表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(c)由与SEQIDNO：2表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(d)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列构成的多肽，
(e)由SEQIDNO：4表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，
(f)由与SEQIDNO：4表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽；
(g)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列构成的多肽，
(h)由SEQIDNO：6表示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个至数个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的多肽，和
(i)由与SEQIDNO：6表示的氨基酸序列具有80％或更高的同源性的氨基酸序列构成的多肽。
<15>根据<14>的Starmerella属的微生物，其中(b)、(e)和(h)中的一个至数个氨基酸表示1-80个、优选1-40个、更优选1-20个、更加优选1-10个。
<16>根据<14>的Starmerella属的微生物，其中多肽(c)是与SEQIDNO：2的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列；多肽(f)是与SEQIDNO：4的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列；多肽序列(i)是与SEQIDNO：6的氨基酸序列具有90％或更高、更优选95％或更高的同源性的氨基酸序列。
<17>根据<13>至<16>中任一项的Starmerella属的微生物，其中Starmerella属的微生物为Starmerellabombicola。
<18>根据<17>的Starmerella属的微生物，其中所述Starmerellabombicola是StarmerellabombicolaKSM36菌株或者StarmerellabombicolaNBRC10243菌株。
本发明的内容将通过以下实施例的方式进行更具体的阐述。
实施例
实施例1：制备向其中导入源自Wickerhamomycesciferrii的WcSLI1基因的菌株
(1)构建要导入的基因片段
按照Starmerellaciferrii的密码子用法人工合成源自Wickerhamomycesciferrii的乙酰转移酶基因(WcSLI1)(SEQIDNO：7)。然后，用乙酰转移酶基因(WcSLI1)作为模板以及SEQIDNO：10和12的引物或者SEQIDNO：11和12的引物进行PCR，得到WcSLI1基因片段。PCR条件为，例如，98℃下2分钟，(98℃10秒，55℃5秒，72℃1分钟)×30个周期。为了WcSLI1的表达，使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(5’-GAPDH)的启动子和葡糖基转移酶(5’-UGT)基因的启动子。独立的启动子序列通过PCR、使用SEQIDNO：13和14的引物和SEQIDNO：15和16的引物、以及使用StarmerellabombicolaKSM36菌株的基因组DNA作为模板获得。另外，使用细胞色素C(3’-CYC)的终止子。3’-CYC的序列通过PCR、使用SEQIDNO：17和18的引物、以及StarmerellabombicolaKSM36菌株的基因组DNA作为模板获得。通过SOE-PCR将这些连接，得到[5’-GAPDH或5’-UGT][WcSLI1][3’-CYC]基因片段。以限制性酶SacI和NcoI对基因片段和质粒pHsp70A/RbcS2-Chlamy(ChlamydomonasResourceCenter)进行处理，并且通过使用融合克隆试剂盒(in-Fusioncloningkit，Clontech)进行连接，得到质粒1。通过使用潮霉素抗性基因(SEQIDNO：19)对转变株(transformant)进行筛选。通过PCR、使用SEQIDNO：20和21的引物和具有潮霉素抗性基因作为模板的质粒loxP-PGK-gb2-hygro-loxP(GeneBridge)而得到潮霉素抗性基因，然后通过PCR、使用StarmerellabombicolaKSM36菌株作为模板、以及SEQIDNO：22和23或24和25的引物对URA3的启动子和终止子进行单独扩增。将潮霉素抗性基因与产物连接由此通过SOE-PCR的方法扩增，得到基因片段[5’-URA3][潮霉素抗性基因][3’-URA3]。进而，使质粒pUC-Arg7-lox-BARG7经过PCR用SEQIDNO：26和27，扩增除ARG7之外的区域，其通过SOE-PCR通过使用融合克隆试剂盒(Clontech)与扩增产物连接，得到质粒2。使用质粒1和质粒2的loxP序列通过cre重组酶反应进行连接，得到作为质粒3的[5’-GAPDH或5’-UGT][WcSLI1][3’-CYC]-[5’-URA3][潮霉素抗性基因]。使质粒3经过PCR使用SEQIDNO：13和25或15和25的引物，得到导入WcSLI1的基因片段。
进而，如下制备为了删除cyp52M1要导入的基因片段。通过PCR使用SEQIDNO：28和29的引物对cyp52M1基因的上游区域进行扩增；通过PCR使用SEQIDNO：30和31对其下游区域；且通过使用SEQIDNO：32和33的引物、使用StarmerellabombicolaKSM36菌株的基因组DNA作为模板对URA3基因进行扩增。由此获得的三个片段被用作cyp52M1缺失片段。
实施例1中使用的引物总结于表1中。
[表1]
(2)尿嘧啶营养缺陷型菌株的采集
将StarmerellabombicolaKSM36菌株(FERMBP-799)接种至包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.03％的尿嘧啶和1.5％的琼脂的SD-U琼脂培养基中，然后在30℃下培养一个月。通过铂环将得到的酵母细胞取出并悬浮在1mL的0.8％的生理盐水中。将100μL的悬浮液涂抹在包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.03％的尿嘧啶和1.5％的琼脂的SD-U琼脂培养基上并在30℃下培养2周。将生长的菌落在SD-UF琼脂培养基中再次培养。此后，就尿嘧啶营养缺陷型和5-氟乳清酸抗性方面分别对培养产物进行了证实，然后，得到了尿嘧啶营养缺陷型菌株。
将StarmerellabombicolaKSM36菌株和得到的尿嘧啶营养缺陷型菌株分别通过铂环取出，并接种至100-mL体积的试管中包含的5mL的50g/L的YPD肉汤(JapanBD制备)中，并在30℃和250rpm下培养48小时。将培养液(1mL)在5000rpm在4℃下离心5分钟收集酵母细胞。从该酵母细胞中，按照所附说明中所述的方法通过使用Dr.GenTLETM提取基因组DNA。使用表1所列的引物(SEQIDNO：32，33)和KOD-plus.ver2(TOYOBO)，将参与尿嘧啶生物合成的编码乳清酸核苷脱羧酶的URA3基因进行扩增。使用PCR产物作为模板对URA3基因的序列进行分析并与StarmerellabombicolaNBRC10243菌株(GenBank登记号：DQ916828)的序列进行比较。结果，证实StarmerellabombicolaKSM36菌株具有与StarmerellabombicolaNBRC10243菌株的URA基因相同的序列；尿嘧啶营养缺陷型菌株均在54-位置处具有突变(半胱氨酸变为酪氨酸)。得到的尿嘧啶缺陷型菌株被用作StarmerellabombicolaKSM36-ura3菌株。
(3)用于尿嘧啶营养缺陷型菌株的采集方法
由于在部分(2)中确定了尿嘧啶营养缺陷型菌株的突变位置，容易地制备尿嘧啶营养缺陷型菌株变得可能，例如，通过使用以下基因重组手段。
使用StarmerellabombicolaKSM36菌株的基因组DNA作为模板和SEQIDNO：32和33的引物对URA3基因进行扩增。将扩增的基因片段导入合适的载体以导入点突变，用于将54-位置处的半胱氨酸变为酪氨酸。通过使用SEQIDNO：32和33的引物将向其导入点突变的载体进行扩增，得到包含导入URA3基因的突变的转换的片段。通过铂环将StarmerellabombicolaKSM36菌株取出，接种至包含于100mL体积的试管中的YPD肉汤(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液接种，以便得到包含在坂口瓶中的YPD肉汤(50mL)中1％的浓度，并在30℃和120rpm下培养直到OD600达到1至2。通过在3000rpm和4℃下离心5分钟将繁殖的酵母细胞收集起来，并用冰冷的无菌水(20mL)清洗两次。将酵母细胞悬浮在1mL冰冷的1M山梨糖醇溶液中，并在5000rpm和4℃下离心5分钟。在将上清液排出后，加入400μL的1M的山梨糖醇溶液。允许该混合物保持冰冷并且通过移液管悬浮。将酵母悬浮液(50μL)取出并分配，并且加入用于转换的DNA(1μg)。将酵母悬浮液转移至具有0.2cm间隔的冰冷的腔(chamber)(BIO-RAD)中，之后，通过使用GENEPULSERII(BIO-RAD)施加脉冲(25μF，350Ω，2.5kV)。加入冰冷的含有1M山梨糖醇溶液的YPD肉汤，并将混合物转移至体积为1.5mL的管中，在30℃下振荡2小时，然后在5000rpm和4℃下离心5分钟，使酵母细胞回收。将酵母细胞再次悬浮在200μL的1M的山梨糖醇溶液中。取出等份(100μL)，涂抹在选定的培养基上并在30℃下培养约一周。作为选定的培养基，使用包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.03％的尿嘧啶、5-氟乳清酸和1.5％的琼脂的SD-UF琼脂培养基。将生长的菌落在SD-UF琼脂培养基中进行再次培养。此后，对培养产物的尿嘧啶营养缺陷型和5-氟乳清酸抗性分别进行了证实。以这样的方式，可以得到尿嘧啶营养缺陷型菌株。
(4)cyp52M1基因缺陷型菌株的采集
使用铂环将如上得到的StarmerellabombicolaKSM36-ura3菌株取出，接种至体积为100mL的试管中包含的YPD肉汤(5mL)中，并且在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液进行接种，以便得到包含在坂口瓶中的YPD肉汤(50mL)中1％的浓度，并且在30℃和120rpm下培养直到OD600达到1至2。通过在3000rpm和4℃下离心1分钟将繁殖的酵母细胞收集起来，并用冰冷的无菌水(20mL)清洗两次。将酵母细胞悬浮在1mL冰冷的1M的山梨糖醇溶液中，并在5000rpm和4℃下离心5分钟。在将上清液排出后，加入400μL的1M的山梨糖醇溶液。允许该混合物保持冰冷并且通过移液管悬浮。将酵母悬浮液(50μL)取出并分配，并且加入用于转换的1μg的DNA(cyp52M1缺陷型基因片段)。将酵母悬浮液转移至具有0.2cm间隔的冰冷的腔(chamber)(BIO-RAD)中，此后，通过使用GENEPULSERII(BIO-RAD)施加脉冲(25μF，350Ω，2.5kV)。加入冰冷的含有1M山梨糖醇溶液的YPD肉汤，并将混合物转移至体积为1.5mL的管中，在30℃下振荡2小时，然后在5000rpm和4℃下离心1分钟，使酵母细胞回收。将酵母细胞再次悬浮在200μL的1M的山梨糖醇溶液中。取出等份(100μL)，涂抹在选定的培养基上并在30℃下培养约一周。作为选定的培养基，使用包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.077％的CSM-ura(Funakoshi)和1.5％的琼脂的SD-ura琼脂培养基。使用SEQIDNO：28和31作为引物通过KOD-FX-Neo(TOYOBO)使生长的菌落经过菌落PCR。在证实扩增后的序列的长度改变之后，得到cyp52M1基因缺陷型菌株。
(5)将WcSLI1基因导入Starmerellabombicola
通过铂环将Starmerellabombicolacyp52M1基因缺陷型菌株和StarmerellabombicolaKSM36菌株分别取出，接种至体积为100mL的试管中包含的YPD肉汤(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液进行接种，以便得到包含在坂口瓶中的YPD肉汤(50mL)中的1％的浓度，并在30℃和120rpm下培养直到OD600nm达到1至2。通过在3000rpm和4℃下离心5分钟将繁殖的酵母细胞收集起来，并用冰冷的无菌水(20mL)清洗两次。将酵母细胞悬浮在1mL冰冷的1M的山梨糖醇溶液中，并在5000rpm和4℃下离心1分钟。在将上清液排出后，加入400μL的1M的山梨糖醇溶液。允许该混合物保持冰冷并且通过移液管悬浮。将酵母悬浮液(50μL)取出并分配，并且加入用于转换的1μg的DNA(导入WcSLI1的基因片段)。将酵母悬浮液转移至具有0.2cm间隔的冰冷的腔(BIO-RAD)中，此后，通过使用GENEPULSERII(BIO-RAD)施加脉冲(25μF，350Ω，2.5kV)。加入冰冷的含有1M山梨糖醇溶液的YPD肉汤，并将混合物转移至体积为1.5mL的管中，在30℃下振荡2小时，然后在5000rpm和4℃下离心1分钟。将酵母细胞回收并再次悬浮在200μL的1M的山梨糖醇溶液中。取出等份(100μL)，涂抹在选定的培养基上并在30℃下培养约一周。作为选定的培养基，使用包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.077％的CSM-ura(Funakoshi)、200μg/mL的潮霉素和1.5％和琼脂的SD-ura+潮霉素的琼脂培养基。使用SEQIDNO：13和18或15和18的引物通过KOD-FX-Neo(TOYOBO)使生长的菌落经过菌落PCR。在证实基因插入基因组中之后，得到具有导入至Starmerellabombicolacyp52M1缺陷型菌株中的基因的Δcyp52M1/pGAPDH-WcSLI1菌株(使用GAPDH启动子)和Δcyp52M1/pUGT-WcSLI1菌株(使用UGT启动子)；以及具有导入至StarmerellabombicolaKSM36菌株中的基因的pGAPDH-WcSLI1菌株和pUGT-WcSLI1菌株。进而，作为对照，得到了具有向其中单独导入潮霉素抗性基因的菌株。
实施例2：分析在具有导入其中的WcSLI1基因的菌株中的乙酰化植物鞘氨醇的生产率(1)
(1)分析具有导入其中的基因的菌株的脂质构成
将对照菌株(潮霉素抗性基因)、Δcyp52M1/pGAPDH-WcSLI1菌株和Δcyp52M1/pUGT-WcSLI1菌株分别涂抹在YPD琼脂培养基上。用铂环将生长的菌落取出，接种至体积为100mL的试管中包含的SD-Ura培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液(500μL)接种至体积为100mL的试管中包含的SD-Ura培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时至72小时。然后，分析脂质构成。
(2)乙酰化植物鞘氨醇的定量化
在将培养液(1mL)回收后，加入4mL包含比例为2：1的氯仿和甲醇的溶液混合物，漩涡振荡(vortexed)，然后允许其静置15分钟。将混合物在3000rpm下离心15分钟，收集下层(氯仿层)。将收集的溶液通过氮气吹扫干燥，悬浮在1mL甲醇中，适当地稀释并通过过滤器过滤。过滤后，将样品通过LC-MS/MS测定。LC-MS/MS的条件如下：
LC条件：CapcellcoreC182.1×50mm(ShiseidoCO.0Ltd)，炉温40℃，溶液A：水中0.1％的HCO2H，溶液B：MECN，(A60％、B40％)0.5分钟→[(A60％、B40％)→(A0％、B100％)5.5分钟]→B100％2分钟，[(A0％、B100％)→(A60％、B40％)0.01分钟]→(A60％、B40％)2分钟，流速0.6ml/分钟，注入5μl，MS/MS设备：API3200QTrap(ABSCIEX)。
[表2]
用于定量乙酰化植物鞘氨醇的离子
培养24小时和48小时之后的脂质构成示于表1中。在对照菌株中，既不产生三乙酰基植物鞘氨醇(TriAPS)(碳链长度：18)也不产生四乙酰基植物鞘氨醇(TAPS)(碳链长：18)；相反地，在具有导入其中的WcSLI1基因的Starmerellabombicola中，证实了TriAPS和TAPS的产生。
在培养开始后72小时产生的乙酰化植物鞘氨醇的量和产物的比率示于表3和表4中。
[表3]
产生的链长为18-20个碳原子的三乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
[表4]
产生的链长为18-20个碳原子的四乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
实施例3：分析在具有导入其中的WcSLI1基因的菌株中乙酰化植物鞘氨醇的生产率(2)
将Δcyp52M1/pGAPDH-WcSLI1菌株涂抹在YPD琼脂培养基上。通过铂环将生长的菌落取出，接种至体积为100mL的试管中包含的SD-Ura培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液(100μL)接种至体积为100mL的试管中包含的具有C15至C19的脂肪酸乙酯(50mM)的SD-Ura培养基(5mL)中，在30℃和250rpm下培养72小时。然后，以与实施例2相同的方式分析脂质构成。
培养开始后72小时产生的C18至C20的乙酰化植物鞘氨醇的量以及产物的比率示于表5和表6中。
[表5]
产生的链长为18-20个碳原子的三乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
[表6]
产生的链长为18-20个碳原子的四乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
对比例：分析具有导入其中的WcSLI1基因的菌株中的乙酰化植物鞘氨醇的生产率(3)
分别将Δcyp52M1/pGAPDH-WcSLI1菌株、pGAPDH-WcSLI1菌株、Δcyp52M1/pUGT-WcSLI1菌株和pUGT-WcSLI1菌株涂抹在YPD肉汤培养基上。通过铂环将生长的菌落取出，接种至体积为100mL的试管中包含的YPD培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液(100μL)接种至体积为100mL的试管中包含的改良YPD培养基(10％的葡萄糖、10％的十六酸乙酯、2％的蛋白胨、1％的酵母提取物、25mM的CaCl2·2H2O、50mM的L-丝氨酸)(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养7天。然后以与实施例2相同的方式分析脂质构成。脂质分析的结果示于表7中。进而，通过使用2mL的正己烷将脂肪酸乙酯或脂肪酸从培养液(1mL)中萃取出来。在收集正己烷层之后，将乙酸乙酯(2mL)加入到剩余的水层中，萃取槐糖脂并收集乙酸乙酯层。将乙酸乙酯层干燥并进行分析。结果，证实了Δcyp52M1/pGAPDH-WcSLI1菌株和Δcyp52M1/pUGT-WcSLI1菌株不产生槐糖脂；相反地，pGAPDH-WcSLI1菌株和pUGT-WcSLI1菌株产生槐糖脂。
[表7]
产生的链长为18-20个碳原子的三乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
实施例4制备具有导入的多个异种SLI1的菌种
(1)制备用于导入的片段
通过PCR使用SEQIDNO：34和35的引物以及StarmerellabombicolaKSM36菌株作为模板使CYP52M1基因的上游位点进行扩增，并与质粒1连接，其通过使用SEQIDNO：36和37的引物、通过使用融合克隆试剂盒(Clontech)将CYP52M1的上游位点插入到GAPDH启动子之前进行扩增。这被指定为质粒1-A。随后，通过PCR使用SEQIDNO：22和25的引物和StarmerellabombicolaKSM36菌株作为模板使包含URA3基因的启动子和终止子的区域扩增。进而，使用SEQIDNO：26和27的引物对除了质粒pUC-Arg7-lox-BARG7的ARG7的区域进行扩增，并通过使用融合克隆试剂盒(Clontech)与URA3的扩增产物进行连接。得到的质粒被指定为质粒2-A。进而，通过PCR使用SEQIDNO：38和39的引物和StarmerellabombicolaKSM36菌株作为模板使CYP52M1基因的下游位点进行扩增，并与通过扩增使用SEQIDNO：40和41的引物、通过使用融合克隆试剂盒(Clontech)将CYP52M1基因插入到URA3终止子之后得到的质粒2-A进行连接。这被指定为质粒2-B。质粒1-A和质粒2-B通过Cre重组酶反应进行连接，得到质粒4。使用SEQIDNO：28和31的引物以及质粒4作为模板进行PCR，得到cyp52M1：：pGAPDH-WcSLI1片段。
(2)制备用于导入异种SLI1的片段
按照Starmerellabombicola的密码子用法人工合成源自酿酒酵母和毕赤酵母的SLI1基因，分别得到SEQIDNO：8和9表示的序列。使用这些作为模板和SEQIDNO：42、43和44、45的引物进行PCR，得到ScSLI1和PpSLI1片段。随后，使用SEQIDNO：46和47的引物以及质粒4作为模板进行PCR，使除了WcSLI1之外的区域扩增。用质粒通过使用融合克隆试剂盒(Clontech)将ScSLI1片段和PpSLI1片段连接，分别得到质粒5和6。使用SEQIDNO：28和31的引物和质粒5和6作为模板进行PCR，得到cyp52M1：：pGPDH-PpSLI1片段和cyp52M1::pGAPDH-PpSLI1片段。
(3)制备多种导入SLI1的菌株
通过铂环将上述StarmerellabombicolaKSM36-ura3菌株取出，并接种至体积为100mL的试管中包含的YPD肉汤(5mL)中，并在30℃在250rpm下培养24小时。将得到的培养液接种，以便得到包含在坂口瓶中的肉汤(50mL)中的1％的浓度。通过在3000rpm和4℃下离心5分钟收集繁殖的酵母细胞，并用冰冷的无菌水(20mL)清洗两次。将酵母细胞悬浮在1mL冰冷的1M的山梨糖醇溶液中，并在5000rpm和4℃下离心1分钟。在将上清液排出后，加入400μL1M的山梨糖醇溶液。将生成物混合物置于冰上并通过移液管悬浮。将酵母悬浮液(50μL)取出并分配，并加入1μg用于转换的DNA。将酵母悬浮液转移至具有0.2cm间隔的冰冷的腔(BIO-RAD)中，此后，通过使用GENEPULSERII(BIO-RAD)施加脉冲(25μF、350Ω、2.5kV)。加入冰冷的1M的含有山梨糖醇的YPD肉汤，并将混合物转移至体积为1.5mL的管中，在30℃下振荡2小时，然后在5000rpm和4℃下离心1分钟。将酵母细胞回收并再次悬浮在200μL的1M的山梨糖醇溶液中。取出等份(100μL)，涂抹在选定的培养基上并在30℃下培养约一周。作为选定的培养基，使用包含0.68％酵母氮基w/o氨基酸、2％的葡萄糖、0.077％的CSM-ura(Funakoshi)和1.5％的琼脂的SD-ura琼脂培养基。使用SEQIDNO：28和31的引物通过KOD-FX-Neo(TOYOBO)使生长的菌落经过菌落PCR。在证实扩增的序列的长度改变之后，得到了cyp52M1：：pGAPDH-WcSLI1菌株，cyp52M1：：pGAPDH-ScSLI1菌株和cyp52M1：：pGPDH-PpSLI1菌株。实施例4中使用的引物汇总于表8中。
[表8]
实施例5评估表达菌种的多种SLI1的乙酰化植物鞘氨醇的生产率
将实施例4中得到的三种菌种和cyp52M1缺陷型菌种分别涂抹在YPD琼脂培养基上。通过铂环将生长的菌落取出，并接种至体积为100mL的试管中包含的SD-Ura培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养24小时。将得到的培养液接种至体积为100mL的试管中包含的SD-Ura培养基(5mL)中，并在30℃和250rpm下培养120小时。然后，以与实施例2相同的方式分析脂质构成。在培养开始后第120小时处产生的C18至C20的乙酰化植物鞘氨醇的量示于表9和表10中。
[表9]
产生的链长为18-20个碳原子的单乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率
[表10]
产生的链长为18-20个碳原子的三乙酰基植物鞘氨醇的量和产物的比率