相关申请的交叉引用本申请要求2013年10月23日提交的美国临时专利申请系列号61/894,879和2013年11月8日提交的美国临时专利申请系列号61/901,942的优先权，将其全部内容在本文通过提述并入。技术领域本申请涉及生物技术领域，且更具体地，涉及重组糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A)的产生和受试者中溶酶体贮积症(例如，法布里病)的治疗。背景溶酶体贮积症是超过40种病症的集合，它们由细胞溶酶体中编码降解糖脂或多糖废物的酶的基因缺陷所致。酶促产物例如糖和脂质随后循环成为新的产物。这些病症的每一种都由影响溶酶体中酶的水平的遗传性常染色体或X连锁隐性性状所致。一般而言，受影响个体的细胞和组织中这些酶的生物学或功能性活性减少或无活性。示例性的溶酶体贮积症和相关的酶的缺陷的列表示于图1且描述于美国专利号6,066,626的表1中。在这些疾病中，酶功能缺陷产生脂质和糖底物在机体细胞的溶酶体中的进行性系统沉积，最终导致器官功能的丧失和死亡。法布里病是由溶酶体酶α-半乳糖苷酶-A的缺陷导致的溶酶体贮积症。该溶酶体水解酶的缺陷导致糖鞘脂globotriasylceramide(GL3)和相关脂质在机体的大多数组织中的进行性沉积。GL3沉积物最初在血管内皮中发现。GL3的进行性内皮积累导致器官如肾、心脏或脑中的缺血和梗塞，导致难以忍受的疼痛、肾衰竭和心脏和脑血管疾病。未用酶替代疗法治疗来自血管疾病的肾、心脏和/或脑并发症的法布里病患者的平均寿命对于男性为50岁且对于女性为70岁(Lidove等人，Int.J.Clin.Pract.61:293-302,2007)。用于在医疗处理中使用的重组蛋白经常由细胞培养方法产生，所述方法包括使用包含血液产品(例如，非人动物血清或血浆)的液体培养基。包含重组蛋白的药物产品的污染已成为生物技术工业中的问题(Nims,BioProcessingJ.10:4-10,2011；Plavsic等人，BioProcessingJ.9:6-12,2011；Plavsic等人，Dev.Biol.Stand99:95-109,1999)。例如，在这种药物产品中的多种不同病毒的存在，在一些情况中，归因于用于培养产生重组蛋白的细胞的液体培养基中存在的血液产品(例如，非人动物血清或血浆)。已经在重组蛋白产生细胞培养物中发现并且被认为是由动物产品(例如，动物血清、动物血浆或动物血清蛋白)的使用造成的污染物的实例在本文描述。在重组蛋白产生细胞培养物中无血清培养基或无动物产品培养基的使用是有益的，因为所述培养基是更好限定的并且简化的，具有降低程度的污染物，消除或减少重组蛋白产生细胞培养物中的污染风险或污染物水平，并且致使使用细胞培养物产生重组蛋白的成本更低。概述本发明至少部分基于发现了具有改变的(例如，改进的)糖基化概貌的蛋白(例如，酶，例如，α-半乳糖苷酶-A)可使用本文所述方法产生。相应地，本文提供了在糖型中具有减少的可变性、具有减少的污染风险或水平(例如，减少的病毒污染风险或水平)和/或改变的和改进的糖基化概貌(例如，与用于酶替代疗法的之前制造的酶相比)的α-半乳糖苷酶-A蛋白、包括这些α-半乳糖苷酶-A蛋白中的一种或多种的药物组合物和试剂盒(例如在糖型上具有减少的可变性和/或减少的污染风险或水平(例如，减少的病毒污染风险或水平)的药物组合物)、生成用于糖蛋白(例如，α-半乳糖苷酶-A)重组表达的哺乳动物细胞的方法、产生重组糖蛋白(例如，α-半乳糖苷酶-A)的方法、治疗法布里病的方法和减少受试者中globotriaosylceramide血清水平的方法和在哺乳动物细胞(例如，体外细胞或在受试者中的细胞)内的溶酶体中增加α-半乳糖苷酶-A水平的方法。还提供了包含编码α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的表达载体。本文提供了重组人α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白，其具有一种或两种下列结构特征：约0.1％至约1.5％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖；且大于约9％的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖。例如，权利要求1的rhAGA蛋白具有下列结构特征：约0.1％至约1.5％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖；且大于约9％的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约0.1％至约1.3％(例如，约0.1％至约1.0％或约0.1％至约0.7％)的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约8.5％(例如，大于约9.0％)的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖。本文提供的rhAGA蛋白可进一步具有选自下组的一种或多种结构特征：大于约13.5％的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖；大于约2.0％的百分比的总N-连接寡糖为2型三唾液酸化寡糖；和大于约3.0的唾液酸/蛋白的摩尔/摩尔比率。例如，本文提供的rhAGA蛋白可进一步具有下列结构特征：大于约13.5％的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖；大于约2.0％的百分比的总N-连接寡糖为2型三唾液酸化寡糖；和大于约3.0的唾液酸/蛋白的摩尔/摩尔比率。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约13.8％(例如，大于约14.0％)的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约4％(例如，大于约6％)的百分比的总N-连接寡糖为2型三唾液酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约3.2(例如，大于约3.4)的唾液酸/蛋白的摩尔/摩尔比率。本文提供的rhAGA蛋白可进一步具有一种或多种选自下组的结构特征：约0.1％至约3.9％的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖；约0.1％至约3.0％的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖；约0.1％至约5.3％的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化寡糖；约0.1％至约9.0％的百分比的总N-连接寡糖为1型三唾液酸化寡糖；约1％至约7.0％的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖；大于约14.8％的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(monophosphosphorylatedoligosaccharides)；大于约4.9％的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化寡糖；和大于约8.2％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化和单磷酸化寡糖。例如，本文所述的rhAGA蛋白可具有选自下组的四种或多种结构特征：约0.1％至约3.9％的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖；约0.1％至约3.0％的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖；约0.1％至约5.3％的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化寡糖；约0.1％至约9.0％的百分比的总N-连接寡糖为1型三唾液酸化寡糖；约1％至约7.0％的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖；大于约14.8％的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖；大于约4.9％的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化寡糖；和大于约8.2％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化和单磷酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约0.1％至约3.0％(例如，约0.1％至约2.0％)的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约1.0％至约2.0％(例如，约1.5％至约2.0％)的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约3.0％至约5.0％(例如，约4.0％至约5.0％)的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约0.5％至约8.0％(例如，约0.5％至约5.0％)的百分比的总N-连接寡糖为1型三唾液酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有约4％至约6.9％(例如，约5％至约6.8％)的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约15％(例如，大于约16％)的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约6％的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化寡糖。在一些实施方案中，所述rhAGA蛋白具有大于约8.5％(例如，大于约9.0％)的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化和单磷酸化寡糖。本文提供的rhAGA蛋白具有一种或两种下列的特性：(i)相比通过表达甘露糖-6-磷酸受体蛋白的哺乳动物细胞的内吞作用增加；和(ii)相比对甘露糖-6-磷酸受体蛋白的亲和力增加。例如，本文提供的rhAGA蛋白可具有(i)相比通过表达甘露糖-6-磷酸受体蛋白的哺乳动物细胞的内吞作用增加；和(ii)相比对甘露糖-6-磷酸受体蛋白的亲和力增加。任何本文提供的rhAGA蛋白可不具有或具有不可检测水平的存在于动物产品(例如动物血清、动物血浆或动物血液产品)中的蛋白、脂质、糖、核酸和污染物(例如任何本文所述的污染物)。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是在仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是在仅使用无蛋白和/或化学限定的培养基的细胞培养中产生的rhAGA蛋白。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是在仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生并使用整合和连续过程分离的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。在一些实施方案中，整合和连续过程包括步骤：(a)提供包含本文提供的rhAGA蛋白的液体培养基，其基本上无细胞，其中将所述液体培养基补给入第一多重层析系统(MCCS1)；(b)在液体培养基中使用MCCS1捕获rhAGA蛋白，其中将包含重组治疗性蛋白的MCCS1的洗脱物连续补给入第二多重柱层析系统(MCCS2)；和(c)使用MCCS2纯化并精制重组治疗性蛋白，其中来自MCCS2的洗脱物是rhAGA药物物质，且其中所述过程是整合的并从液体培养基连续运行至来自MCCS2的、为rhAGA药物物质的洗脱物。在一些实施方案中，MCCSl和/或MCCS2实施两个不同的单元操作。在一些实施方案中，MCCSl或MCCS2或两者的使用涉及柱切换。在一些实施方案中，MCCSl实施捕获重组蛋白和灭活病毒的单元操作。在一些实施方案中，MCCS2实施纯化和精制重组治疗性蛋白的单元操作。在一些实施方案中，MCCSl和/或MCCS2利用至少两个层析柱。在一些实施方案中，MCCSl是第一周期性逆流层析系统(PCCS1)，例如包括四柱PCCS的PCCS1。在一些实施方案中，四柱PCCS(在PCCS1的实施方案中)的四个柱中的三个实施从液体培养基捕获重组治疗性蛋白的单元。在一些实施方案中，将来自四柱PCCS(在PCCS1的实施方案中)的四个柱中的三个的包含本文提供的rhAGA蛋白的洗脱物补给入四柱PCCS的第四个柱。在一些实施方案中，四柱PCCS(在PCCS1的实施方案中)的第四个柱通过在用于病毒灭活的低pH保持包含重组治疗性蛋白的洗脱物实施灭活病毒的单元操作。在一些实施方案中，包括在来自四柱PCCS的第四柱的洗脱物补给入PCCS2前使用在线缓冲调整贮液器调整来自四柱PCCS的第四柱的洗脱物的pH。在一些实施方案中，PCCS2包含三个层析柱和层析膜。在一些实施方案中，PCCS2中的三个层析柱实施从PCCS1的洗脱物通过阳离子或阴离子交换层析纯化本文提供的rhAGA的单元操作。在一些实施方案中，将来自PCCS2中三个层析柱的洗脱物补给入PCCS2中的层析膜。在一些实施方案中，PCCS2中的层析膜通过阳离子或阴离子交换层析实施精制来自PCCS2中三个层析柱的洗脱物中的本文提供的rhAGA蛋白的单元操作。在一些实施方案中，PCCS2中的层析膜通过阳离子交换实施精制的单元操作。在一些实施方案中，PCCS2中层析膜的流通液和洗涤液是rhAGA药物物质。还提供了药物组合物，其包含本文所述的任何rhAGA蛋白和药学上可接受的载剂。例如，可以配制所述药物组合物用于静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内施用。在一些实施方案中，所述药物组合物包含约4mg/mL至约6mg/mL(例如，约5mg/mL)的浓度的rhAGA。在一些实例中，所述药物组合物是无菌的冻干粉末。在一些实施方案中，所述药学上可接受的载剂是一种或多种选自下组的作用剂：甘露糖醇、磷酸二氢钠、一水合物、磷酸氢二钠和七水合物。任何本文提供的药物组合物可不具有或具有不可检测水平的存在于动物产品(例如动物血清、动物血浆或动物血液产品)中的蛋白、脂质、糖、核酸和污染物(例如任何本文所述的污染物)。任何本文提供的药物组合物可包含仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生的本文提供的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定的培养基。任何本文提供的药物组合物可包含仅使用无蛋白培养基和/或化学限定培养基的细胞培养中产生的本文提供的rhAGA蛋白。任何本文提供的药物组合物可包含通过仅使用选自下组的培养基的细胞培养产生并使用整合和连续过程(例如使用任何本文所述的示例性的整合和连续过程)分离的本文提供的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定的培养基。还提供了表达载体，其包含：编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列；与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列；与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列；和与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的3’末端可操作连接的编码多聚(A)识别位点的序列。在一些实施方案中，所述启动子序列选自下组：仓鼠rpS21启动子、仓鼠β-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；且编码多聚(A)识别位点的序列是SV40早期多聚(A)识别序列。在一些实施方案中，所述表达载体进一步包含编码人或狗谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶的序列。在一些实施方案中，编码人或狗谷氨酰胺合成酶的序列的5’末端与SV40早期启动子可操作连接且编码人或狗谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶的序列的3’末端与SV40早期内含子和多聚(A)信号序列可操作连接。还提供了生成对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：(a)提供血清依赖性永生化哺乳动物细胞系；(b)在下列中顺序培养所述哺乳动物细胞系：(1)在包含第一浓度(1X)的动物血清的细胞培养基中培养约5天至约10天；(2)在包含约0.2X至约0.3X浓度的动物血清的细胞培养基中培养约5天至约10天；和(3)在包含约0.01X至约0.08X动物血清的细胞培养基中培养约5天至约10天；(c)从(b)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；(d)选择具有可接受的转染效率的(c)的亚克隆，在无血清培养基中使细胞生长，并表达重组蛋白；(d)在无蛋白、无血清、化学限定的培养基中培养(d)中选择的亚克隆约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天或约5天至约10天)；(e)从(d)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；且(f)选择具有可接受的转染效率、峰细胞密度、生长特性、体积生产率(VPR)和糖蛋白糖基化概貌的(e)的亚克隆，其中(f)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的。还提供了生成对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：(a)提供血清依赖性永生化哺乳动物细胞系；(b)在下列中顺序培养所述哺乳动物细胞系：(1)在包含第一浓度(1X)的动物血清的细胞培养基中培养约1天至约10天(例如，约3天)；(2)在包含约0.2X至约0.6X(例如，0.5X)浓度的动物血清的细胞培养基中培养约1天至约10天(例如，约3天)；和(3)在包含约0X至约0.10X动物血清的细胞培养基中培养约5天至约10天(例如，约8天)；(c)从(b)之后的培养物生成单细胞亚克隆培养物；(d)选择具有可接受的转染效率的(c)的亚克隆，在无血清培养基中使细胞生长，并表达重组蛋白；(e)从(d)中选择的亚克隆生成单细胞亚克隆培养物；且(f)选择具有可接受的转染效率、峰细胞密度、生长特性、体积生产率(VPR)和重组蛋白表达的(e)的亚克隆，其中(f)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的。在一些实例中，所述血清依赖性永生化哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。在一些实施方案中，所述血清依赖性永生化哺乳动物细胞系不内源性表达二氢叶酸还原酶。在一些实施方案中，(f)中选择的亚克隆在悬液中生长。在一些实施方案中，重组蛋白表达是抗体和酶之一或两者的表达(例如，人α-半乳糖苷酶-A蛋白)。还提供了通过本文提供的任何方法产生的对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞。还提供了产生重组糖蛋白的方法，其包括：提供通过本文提供的任何方法产生的对于糖蛋白重组表达有用的哺乳动物细胞；将包含编码糖蛋白的序列的表达载体引入所述细胞；在无血清生长培养基中在足以产生所述糖蛋白的条件下培养所述细胞；且从所述细胞或生长培养基收获所述糖蛋白。在一些实例中，所述培养使用悬浮细胞培养实施。在一些实施方案中，所述培养使用生物反应器实施。在一些实施方案中，所述培养使用无蛋白、无血清、化学限定的培养基实施(例如，使用无蛋白、无血清、化学限定的培养基培养中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在一些实施方案中，所述CHO细胞不内源性表达二氢叶酸还原酶。在一些实施方案中，所述重组糖蛋白是酶(例如，人α-半乳糖苷酶-A蛋白)。在一些实施方案中，编码所述糖蛋白的序列与SEQIDNO:1至少90％相同。在一些实施方案中，所述表达载体进一步包含：与编码所述糖蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列；与编码所述糖蛋白的序列的5’末端可操作连接的使用TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列；和与编码所述糖蛋白的序列的3’末端可操作连接的编码多聚(A)识别位点的序列。在一些实施方案中，所述启动子序列选自下组：仓鼠rpS21启动子、仓鼠β-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子；且编码多聚(A)识别位点的序列是SV40早期多聚(A)识别序列。在一些实施方案中，表达载体进一步包含编码人或狗谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶的序列。在一些实施方案中，编码人或狗谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶的序列的5’末端与SV40早期启动子可操作连接且编码人或狗谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶的序列的3’末端与SV40早期内含子和多聚(A)信号序列可操作连接。在一些实例中，所述糖蛋白从所述细胞收获。在一些实例中，所述糖蛋白从所述细胞培养基收获。还提供了通过本文提供的任何方法产生的重组糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)。还提供了包含通过本文提供的任何方法产生的重组糖蛋白和药学上可接受的载剂的药物组合物。例如，可以配制所述组合物用于静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内施用。在一些实施方案中，所述糖蛋白是重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白且所述药物组合物包含约4mg/mL至约6mg/mL(例如，约5mg/mL)浓度的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白。在一些实施方案中，所述药物组合物是无菌的冻干粉末。还提供了在受试者中治疗法布里病(Fabrydisease)的方法，所述方法包括对具有法布里病的受试者施用治疗上有效量的本文提供的任何重组人α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白。在一些实施方案中，所述施用是系统施用(例如，静脉内施用)。在一些实施方案中，以约0.5mg/kg体重至约2.0mg/kg体重的剂量对所述受试者施用rhAGA(例如，约1.0mg/kg体重)。在一些实施方案中，对所述受试者施用两个或多个剂量的rhAGA蛋白。例如，所述两个或多个剂量的rhAGA蛋白的至少两个分开约两周施用。一些实施方案进一步包括对所述受试者施用一种或多种选自下组的其他治疗剂：镇痛剂、抗凝血剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、β-阻断剂和葡糖神经酰胺合酶抑制剂。在一些实施方案中，所述受试者是人受试者。在一些实施方案中，所述受试者已诊断为具有法布里病。还提供了在哺乳动物细胞内的溶酶体中增加α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的方法，所述方法包括将哺乳动物细胞与有效量的本文提供的任何重组人α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白接触。在一些实施方案中，所述细胞在体外(例如，体外人细胞)。在一些实施方案中，所述细胞在受试者中(例如，人)。在一些实施方案中，所述受试者已诊断为具有法布里病。在一些实例中，所述接触通过对所述受试者系统施用rhAGA实施。例如，所述系统施用可以是静脉内施用。在一些实施方案中，对所述受试者以约0.5mg/kg体重至约2.0mg/kg体重的剂量施用rhAGA(例如，约1.0mg/kg体重)。在一些实施方案中，对所述受试者施用两个或多个剂量的rhAGA蛋白。例如，所述两个或多个剂量的rhAGA蛋白的至少两个分开约两周施用。还提供了减少受试者血清中globotriaosylceramide水平的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗上有效量的本文提供的任何重组人α-半乳糖苷酶-A(rhAGA)蛋白。在一些实施方案中，所述受试者具有大于8μg/mL的globotriasoylceramde血清水平。在一些实例中，所述受试者已诊断为具有法布里病。在一些实施方案中，所述施用是系统施用(例如，静脉内施用)。在一些实施方案中，对所述受试者以约0.5mg/kg体重至约2.0mg/kg体重的剂量施用rhAGA(例如，约1.0mg/kg体重)。在一些实施方案中，可以对所述受试者施用两个或多个剂量的rhAGA蛋白。例如，所述两个或多个剂量的rhAGA蛋白的至少两各分开约两周施用。一些实施方案进一步包括对所述受试者施用一种或多种选自下组的其他治疗剂：镇痛剂、抗凝血剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、β-阻断剂和葡糖神经酰胺合酶抑制剂。在一些实施方案中，所述受试者是人。术语“分离的”意为与至少一种污染物(例如，蛋白、核酸、脂质或糖，或其组合)分开的分子。在非限制性实例中，分离的α-半乳糖苷酶-A蛋白或其他糖蛋白按重量为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。术语“液体培养基”意为包含允许哺乳动物细胞在体外生长或增殖的足够营养物的流体。例如，液体培养基可包含一种或多种的：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸腺嘧啶)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸腺嘧啶、氰钴胺、丙酮酸、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可包含来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不包含血清或另一来自哺乳动物的提取物(限定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可包含微量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一实例是基本培养基(例如，仅包含无机盐、碳源和水的培养基)。液体培养基的非限制性实例在本文中描述。液体培养基的另一实例为本领域已知且可商业获得。液体培养基可包含任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文使用，从生物反应器去除的一定体积的液体培养基可以基本上无哺乳动物细胞。术语“无血清液体培养基”意为不包含哺乳动物血清的液体培养基。术语“包含血清的液体培养基”意为包含哺乳动物血清的液体培养基。术语“化学限定的液体培养基”是本领域的术语且意为其中全部化学组分已知的液体培养基。例如，化学限定的液体培养基不包含胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，由于这些制剂通常包含白蛋白和脂质的复杂混合物。术语“无蛋白液体培养基”意为不包含任何蛋白(例如，任何可检测的蛋白)的液体培养基。术语“整合方法”意为使用合作发挥功能以实现特定结果的结构元件的方法(例如，从液体培养基中生成治疗性蛋白药物物质(例如，包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白))。术语“连续方法”意为连续通过用于从包含重组蛋白(例如，任何本文所述的重组蛋白)的培养基产生药物物质(例如，包含重组蛋白的药物物质)的系统的至少一部分补给液体的方法。例如，在操作中持续将包含重组治疗蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)的液体培养基补给入系统且治疗性蛋白药物物质馈送出系统。可用于实施连续方法的这种系统的非限制性实例描述于美国临时专利申请号61/856,930和61/775,060。术语“多重柱层析系统”或“MCCS”意为两个或多个相互连接或切换的层析柱和/或层析膜的系统。一个示例性的多重柱层析系统是周期逆流层析系统(PCC)，其包括两个或多个相互连接或切换的层析柱和/或层析膜。多重柱层析系统的其他实例为本领域已知。术语“分泌蛋白”或“分泌重组蛋白”为本领域熟知且意为至少部分从哺乳动物细胞分泌入至少细胞外间隙(例如，到外部进入液体培养基)的蛋白(例如，重组蛋白)。本领域的技术人员将理解的是“分泌”蛋白不需要完全从细胞解离以被认作分泌蛋白。术语“灌注培养”意为在第一液体培养基中培养多个细胞(例如，哺乳动物细胞)，其中所述培养包括第一液体培养基的周期性或持续去除且同时或之后不久添加基本上相同的体积的第二培养基至容器(例如，生物反应器)。在一些实例中，在培养期间，在增量周期中(例如，约24小时的时间段、约1分钟至约24小时的时间段或多于24小时的时间段)存在去除和添加的第一液体培养基体积的增量变化(例如，增加或减少)(例如，以每日为基础的培养基的重新补给速率)。每天去除和替换的培养基的份额(fraction)取决于培养的特定细胞、初始接种密度和在特定时间的细胞密度可发生改变。“RV”或“反应器体积”意为在培养过程的初始存在的培养基的体积(例如，接种后存在的培养基的总体积)。可用于实施灌注培养的生物反应器为本领域已知。本领域的技术人员将理解的是生物反应器可适于在灌注培养中使用(例如，适配为灌注生物反应器)。术语“补料分批培养”是本领域的术语且意为在第一液体培养基中培养多个细胞(例如，哺乳动物细胞)，其中在容器(例如，生物反应器)中存在的细胞的培养包括向第一液体培养基周期性或连续添加第二液体培养基而不实质或显著从细胞培养物去除第一液体培养基或第二液体培养基。第二液体培养基可与第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些实例中，添加作为干粉的第二液体培养基。本领域的技术人员将理解的是生物反应器可适于在补料分批培养中使用(例如，适配为补料分批生物反应器)。“比生产率”或“SPR”是本领域的术语且在本文中用于指代每哺乳动物细胞每日产生的重组治疗蛋白的质量或酶活性。重组治疗性抗体的SPR通常作为质量/细胞/日测量。重组治疗酶的SPR通常作为单位/细胞/日或(单位/治疗)/细胞/日测量。“体积生产率”或“VPR”是本领域的术语且在本文用于指代每日每培养物体积(例如，每L的生物反应器、容器或管体积)产生的重组治疗性蛋白的质量或酶活性。重组治疗性抗体的VPR通常作为质量/L/日测量。重组治疗性酶的VPR通常作为单位/L/日或质量/L/日测量。除非另外表明，本文使用的全部的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解具有相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用其他本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅为阐述性且并非意在限制。全部公开物、专利申请、序列、数据库条目和其他本文提及的参考文献通过提述以其全文并入。在冲突的情况中，以本说明书包括定义部分为准。本发明一个或多个实施方案的细节阐述于附图和下列说明书中。其他本发明的特征、目的和优势由说明书和附图以及权力要求将是显而易见的。附图说明图1是溶酶体贮积症和对应每种疾病的相应的酶缺陷的列表。图2是编码前体人α-半乳糖苷酶-A蛋白的cDNA序列和前体人α-半乳糖苷酶-A蛋白的氨基酸序列(分别为SEQIDNO:1和2)，和成熟前体人α-半乳糖苷酶-A蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。图3是包含编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(2GFZ)的cDNA序列的pGZ629-2GFZ载体的图谱。图4是可用于表达重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的载体的图谱。图5是显示用于生成针对表达重组糖蛋白优化的亲代细胞系的步骤流程图。图6是显示从尺寸排阻柱洗脱和的色谱图。图7A是的质量-电荷基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)概貌。图7B是的MALTI-TOFMS质谱概貌。图8是(上图)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)(中图或下图)的三次质量-电荷MALDI-TOF质谱概貌的集合。图9是和的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的图片。图10是用2-邻氨基苯甲酸(AA-标记的)衍生的N-连接寡糖的示例性色谱洗脱概貌，其显示对应每个峰的N-连接寡糖结构。小图显示两个三触角、三唾液酸化的寡糖结构，其中在用2-AA衍生的N-连接寡糖的色谱洗脱概貌中，两结构之一对应峰6(1型)且两结构的另一个对应峰6’(2型)。图11是来自(蓝色)和(红色)的AA-标记的N-连接寡糖的色谱洗脱概貌。图12是显示(两条形每组的左侧条形)和(两条形每组的右侧条形)中占总N-连接寡糖的电中性寡糖(峰1)、包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖(峰2)、单唾液酸化的寡糖(峰3)、包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(峰4)、双唾液酸化寡糖(峰5)、三触角、三唾液酸化寡糖(1型；峰6)、三触角、三唾液酸化寡糖(2型；峰6′)、甘露糖-6-磷酸寡糖(峰7)、单磷酸化寡糖(峰8)、三唾液酸化寡糖(峰9)、单唾液酸化和单磷酸化寡糖(峰10)和双-甘露糖-6-磷酸寡糖(峰11)(由左至右)的百分比的图。图13是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和中Asn108氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图14是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和中Asn161氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图15是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和中Asn184氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图16是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和FZ2G中Asn108氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图17是显示在对存在于和FZ2G中Asn108氨基酸残基处的N-连接寡糖进行LCMS分析后，显示存在于每个峰的N-连接寡糖结构的示例图。图18是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和FZ2G中Asn161氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图19是显示如通过每种酶消化蛋白的LCMS分析所确定，在和FZ2G中Asn184氨基酸残基处存在的N-连接寡糖的分布图。图20是来自和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的AA-标记的N-连接寡糖的色谱洗脱概貌。图21A是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中电中性寡糖(峰1)占总N-连接寡糖的百分比的图。图21B是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中单唾液酸化减去岩藻糖的寡糖(monosialyated,minusfucoseoligosaccharides)占总N-连接寡糖百分比的图。图21C是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中包含单唾液酸化的岩藻糖的寡糖(峰2)占总N-连接寡糖的百分比的图。图22A是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，Fabrazyme和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(峰4)占总N-连接寡糖的百分比的图。图22B是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中双唾液酸化的寡糖(峰5)占总N-连接寡糖的百分比的图。图22C是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中三触角、三唾液酸化的寡糖(1型；峰6)占总N-连接寡糖百分比的图。图23A是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中三触角、三唾液酸化的寡糖(2型；峰6’)占总N-连接寡糖百分比的图。图23B是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中甘露糖-6-磷酸寡糖(峰7)占总N-连接寡糖的百分比的图。图23C是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中单磷酸化寡糖(峰8)占总N-连接寡糖的百分比的图。图24A是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中四唾液酸化的寡糖(峰9)占总N-连接寡糖的百分比的图。图24B是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中单唾液酸化和单磷酸化的寡糖(峰10)占总N-连接寡糖的百分比的图。图24C是显示如通过AA-标记的N-连接寡糖的色谱分析确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)中双-甘露糖-6-磷酸寡糖(峰11)占总N-连接寡糖的百分比的图。图25A是显示(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的甘露糖-6-磷酸比蛋白(上图)的摩尔比摩尔比率的图。图25B是显示(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的N-乙酰神经氨酸(NANA)比蛋白的摩尔比摩尔比率的图。图26是显示(FZ)(红色)和(绿色)的表面等离子体共振(Biacore)可溶阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体结合数据的图。图27是显示(FZ)(红色)和(绿色)的表面等离子体共振(Biacore)可溶阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体结合数据的图。图28是显示如通过表面等离子体共振(Biacore)所确定，(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的相对可溶性阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体结合的图。图29是显示使用增加浓度的甘露糖-6-磷酸从甘露糖-6-磷酸受体亲和柱洗脱的(FZ)和的相对百分比的图。图30是显示使用增加浓度的甘露糖-6-磷酸从甘露糖-6-磷酸受体亲和柱洗脱的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的相对百分比的图。图31是和的成像的毛细管等电聚焦(icIEF)峰概貌。图32A是显示ciIEF峰1-5存在的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的百分比的图。图32B是显示ciIEF峰6-11存在的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的百分比的图。图32C是显示ciIEF峰12-14存在的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的百分比的图。图33是使用合成的pNP底物确定的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的Km的图。图34是使用合成的pNP底物确定的(FZ)和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)Vmax的图。图35是来自反相高压液相色谱(RP-HPLC)柱的(蓝色)和(绿色)的洗脱谱。图36是显示在法布里小鼠模型中单次静脉内施用0.1mg/kg后3天或14天，或单次静脉内施用0.1mg/kg的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白(FZ2G)后3天或14天，或在静脉内施用单剂量的媒剂的法布里小鼠模型中的肝组织中GL3的量(ngGL3/mg肝组织)的图。将一个样品从分析中排除，这是由于其根据Grubbs’检验计算为异常点(p<0.01)(在图中示为“a”组)。图37是显示在法布里小鼠模型中单次静脉内施用0.1mg/kg后3天或14天，或单次静脉内施用0.1mg/kg的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白(FZ2G)后3天或14天，或在静脉内施用单剂量的媒剂的法布里小鼠模型中的脾组织中GL3的量(ngGL3/mg脾组织)的图。图38是显示在法布里小鼠模型中单次静脉内施用1.0mg/kg后3天或14天，或单次静脉内施用1.0mg/kg的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白(FZ2G)后3天或14天，或在静脉内施用单剂量的媒剂的法布里小鼠模型中的心脏组织中GL3的量(ngGL3/mg心脏组织)的图。图39是显示在法布里小鼠模型中单次静脉内施用1.0mg/kg后3天或14天，或单次静脉内施用1.0mg/kg的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白(FZ2G)后3天或14天，或在静脉内施用单剂量的媒剂的法布里小鼠模型中的肾组织中GL3的量(ngGL3/mg肾组织)的图。图40是显示在法布里小鼠模型中单次静脉内施用1mg/kg(圆圈，每时间点5只小鼠)或1mg/kg的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白(方块，每时间点8只小鼠)后，随时间的酶活性的图。发明详述本文提供了与相比具有改变的糖基化概貌的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白，和包含至少一种所述重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的组合物、药物组合物和试剂盒。本发明提供的重组糖蛋白和包含本发明提供的重组糖蛋白的组合物具有例如下列益处：糖型中较少的可变性和/或较低的污染风险或水平(例如，较低的病毒污染风险或水平)。与相比，本发明提供的重组糖蛋白还可具有下列一种或多种任意组合的非限制性优势：减少的对肝的非特异性靶向(通过与在将所述重组糖蛋白施用至受试者例如人受试者后与表达在肝细胞表面上表达的脱唾液酸糖蛋白受体结合)、增加的通过在其表面表达甘露糖-6-磷酸受体蛋白的哺乳动物细胞(例如，人细胞)进行的重组糖蛋白内吞率、对甘露糖-6-磷酸受体蛋白增加的亲和力、增加的血清半衰期和减少的有效剂量。还提供了生成对于重组表达重组糖蛋白(例如，人α-半乳糖苷酶-A蛋白)有用的哺乳动物细胞的方法和产生重组糖蛋白(例如，人α-半乳糖苷酶-A蛋白)的方法。还提供了治疗法布里病的方法、减少受试者血清中globotriaosylcermaide水平的方法和增加哺乳动物细胞(例如，体外细胞或受试者中的细胞)内溶酶体中α-半乳糖苷酶-A水平的方法。还提供了包含编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的表达载体。α-半乳糖苷酶-A人α-半乳糖苷酶-A(α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；α-galA；EC3.2.1.22)是由Xq22上的基因编码的溶酶体糖苷外切酶。成熟的人α-半乳糖苷酶-A是由两个非共价连接的398个氨基酸的亚单元组成的同二聚体(约51kD)，其每一个亚单元包含活性位点和可能的三个N-连接的糖基化位点(N139、N192和N215)。α-半乳糖苷酶-A蛋白的活性位点具有两个对于催化活性至关重要的天冬氨酸残基(D170和D231)。α-半乳糖苷酶-A蛋白的三维晶体结构公开于1996(Munier-Lehmann等人，J.Biol.Chem.271:15166-15174,1996)。α-半乳糖苷酶-A催化globotriaosylceramide(GL-3)和其他末端为α-半乳糖酰(galactyl)-的中性鞘糖脂如galabiosylceramide和B血型(BloodGroupB)底物水解为神经酰胺二己糖苷和半乳糖。重组形式的α-半乳糖苷酶-A的比活性可使用合成的底物检验，例如，p-硝基苯-α-D-半乳糖吡喃糖苷(pNP)。人α-半乳糖苷酶-A蛋白的糖基化允许其靶向人细胞中的溶酶体。用于糖基化人α-半乳糖苷酶-A蛋白和其他人糖蛋白的细胞途径的简明总结在下文提供。人α-半乳糖苷酶-A蛋白在内质网中合成。在合成后，人α-半乳糖苷酶-A蛋白的每种单体在高尔基体中经历翻译后修饰。如上文指出，每种人α-半乳糖苷酶-A蛋白的单体具有三种可能的N-糖基化位点(N139、N192和N215)。存在数种人α-半乳糖苷酶-A蛋白的生理糖型。N139残基连接复杂的糖，而N192和N215残基连接富含甘露糖的寡糖，且因此参与使所述酶成为溶酶体摄取的靶。在内质网中合成后，溶酶体酶的前体转移至高尔基体。翻译后修饰且特别是甘露糖-6-磷酸(M6P)残基的添加在高尔基体内侧(cis-golgi)发生。M6P-酶复合物与M6P受体结合且从高尔基体外侧(trans-golgi)释放，在那里其被转运至前溶酶体/内体区室。一旦在内体区室内，酸性pH导致酶从其受体解离。其随后经历去磷酸化以产生成熟和功能性肽。受体随后循环至高尔基体外侧以招募其他的酶，或移动至质膜，在此其可收集内源酶(Sly等人，J.CellBiochem.18:67-85,1982；Helenius等人，Ann.Rev.Biochem.32:1-100,1997)。全部真核N-聚糖的生物合成始于内质网(ER)膜的细胞质一面上，其中将GlcNAc-P从UDP-GlcNAc转移至脂质样前体磷酸多萜醇(Dol-P)以生成焦磷酸多萜醇N-乙酰葡糖胺(Dol-P-P-GlcNAc)。在将整个聚糖通过蛋白寡糖基转移酶转移至在ER中蛋白质中的Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺前，将十四个糖顺序添加至Dol-P以获得Glc3Man9GlcNAc2的聚糖。结合蛋白的N-聚糖随后在ER和高尔基体中通过由结合膜的糖苷酶和糖基转移酶催化的一系列复杂反应重塑。14糖寡甘露糖聚糖共价附接至Asn-X-Ser/Thr后，在ER中使用一系列反应以从Glc3Man9GlcNAc2去除三个糖。这些修整步骤在所有真核细胞中都是保守的。Glc3Man9GlcNAc2的修整始于通过α-糖苷酶I和II对葡萄糖残基的顺序去除。两种葡萄糖苷酶都在ER腔中发挥功能，其中α-糖苷酶I作用于末端α1-2Glc而α-葡萄糖苷酶II顺序去除两个内部α1-3Glc残基。离开ER前，多种糖蛋白受到ERα-甘露糖苷酶I的作用，其随后从Man9GlcNAc2的中心臂去除末端α1-2Man以获得Man8GlcNAc2异构体。大部分离开ER前往高尔基体的途中的糖蛋白具有带有8或9个甘露糖残基的N-聚糖(取决于其是否已受到ERα-甘露糖苷酶I的作用)。对于大多糖蛋白，其他甘露糖残基在高尔基体的内侧区室中去除直至生成Man5GlcNAc2。混合(hybrid)和复杂的N-聚糖的生物合成在内侧高尔基体中通过称为GlcNAcT-1的N-乙酰葡糖胺转移酶的作用起始。GlcNAcT-1将N-乙酰基-葡糖胺残基添加至Man5GlcNAc2核心的甘露糖α1-3的C-2，其起始N-聚糖的第一个支链。一旦该步骤发生，大部分的N-聚糖通过α-甘露糖苷酶II修整，其从GlcNAcMan5GlcNAc2去除末端α1-3Man和α1-6Man残基以形成GlcNAcMan3GlcNAc2。一旦去除两个甘露糖残基，将第二N-乙酰葡糖胺通过GlcNAcT-II添加至甘露糖α1-6的C-2以获得全部双触角、复杂N-聚糖的前体。获得的聚糖具有两个触角或分支，它们通过两个末端N-乙酰葡糖胺残基的添加起始。额外的支链可在核心甘露糖α1-3的C-4(通过GlcNAcT-IV)和核心甘露糖α1-6的C-6(通过GlcNAcT-V)起始以获得三或四触角N-聚糖。另一称为GlyNAcT-IX或GlcNAcT-Vb的酶在C-6核心甘露糖α1-6上催化与GlcNAcT-V相同的反应，但与GlcNAcT-V不同的是，GlnNAcT-IX/Vb也可转移N-乙酰葡糖胺至核心甘露糖α1-3的C-6。另一支链可以在核心甘露糖α1-3的C-4通过GlcNAcT-VI起始。复杂和混合的N-聚糖可携带通过GlcNAcT-III附接至核心的β-甘露糖的二等分N-乙酰葡糖胺残基。当GlcNAcT-III在α-甘露糖苷酶II后发挥作用且支链由GlcNAcT-II、GlcNAcT-IV和GlcNAcT-V起始时，合成具有一分为二的(bisecting)N-乙酰葡糖胺的双、三和四触角复杂N-聚糖。大多在高尔基体外侧发生的进一步的糖添加将混合和带支链的N-聚糖转换成成熟、复杂的N-聚糖的大量阵列。糖可添加至核心，带支链的N-乙酰葡糖胺残基可通过糖的添加延伸，且延伸的支链可加帽或装饰。例如GlcNAcT-II的产物是可通过添加岩藻糖、半乳糖和唾液酸延伸的双触角N-聚糖以生成具有两条支链的复杂N-聚糖。复杂的N-聚糖可例如，具有许多额外的糖包括附接至N-聚糖核心的那些、额外的支链、使用多聚-N-乙酰乳糖胺单元延伸的支链和不同的加帽结构。复杂类型的寡糖在高尔基体中从包含甘露糖-3的寡糖合成，例如，通过添加N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸残基合成。核心修饰经常是以α1-6连接添加岩藻糖至与聚糖核心中的天冬酰胺临近的N-乙酰葡糖胺。参与将岩藻糖转移至该核心N-乙酰葡糖胺的岩藻糖基转移酶需要GlcNAcT-1的事先作用。大部分复杂和混合的N-聚糖具有通过将β-连接的半乳糖残基添加至初始N-乙酰葡糖胺生成的延长的支链以产生称为2型N-乙酰乳糖胺的遍在构成单元(ubiquitousbuildingblock)Galβ1-4GlcNAc。触角可进一步通过N-乙酰葡糖胺和半乳糖残基的顺序添加延长，获得称为多聚-N-乙酰乳糖胺的LacNAc(-3Galβ1-4GlcNAcβ1-)n的串联重复。在另一实例中，将β-连接的半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺的C-3以获得称为1型N-乙酰乳糖胺序列的Galβ1-3GlcNAc。在一些蛋白中，将β-连接的N-乙酰半乳糖胺而非β-连接半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺，获得具有GalNAcβ1-4GlcNAc延伸的触角。加帽或装饰反应涉及将唾液酸、岩藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺和硫酸根添加至支链。加帽的糖最通常为α-连接且因此从β-连接的带状多聚-N-乙酰基乳糖胺支链向外延伸。溶酶体酶可能需要在高尔基体内侧的寡甘露糖N-聚糖上的甘露糖残基的C-6处GlcNAc-1-P。N-乙酰-葡糖胺随后在高尔基体外侧通过糖苷酶去除，由此暴露由Man-6-P受体识别的Man-6-P残基并前往酸化的前溶酶体区室。混合类型的寡糖在高尔基体中从甘露糖-3和甘露糖-5核心结构通过添加例如N-乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸残基合成。如果GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖未受到α-甘露糖苷酶II作用，形成混合的N-聚糖，使得成熟的糖蛋白中外周的α1-3Man和α1-6Man残基保持完整且不经修饰。α-甘露糖苷酶II的不完全作用可导致GlcNAcMan4GlcNAc2混合体。另一高尔基体甘露糖苷酶α-甘露糖苷酶IIX也作用于由GlcNAcT-1生成的GlnNAcMan5GlcNAc2。用于生成N-连接聚糖(例如，高甘露糖型寡糖)的生物合成途径和酶的详细说明描述于Stanley等人，“N-Glycans”inEssentialsofGlycobiology,Ed.Varki,Cummings,andEskho,ColdSpringHarborPress,2009。如上所述，重组人α-半乳糖苷酶-A的翻译后糖基化对于蛋白的正确运输至关重要。例如，在氨基酸位置215处的丝氨酸残基的取代导致破坏向溶酶体的酶运输(Munier-Lehmann等人，J.Biol.Chem.271:15166-15174,1996；Wildt等人，Nat.Rev.Microbiol.3:119-128,2005)。描述表达于CHO细胞中的不同糖型的人α-半乳糖苷酶-A蛋白的研究描述于Matsuura等人，Glycobiology8:329-339,1998。人α-半乳糖苷酶-A蛋白的示例性的前体成熟序列分别示于图2(分别为SEQIDNO:1和2)。如本文所述的重组人α-半乳糖苷酶蛋白可包含与SEQIDNO:1或2至少95％相同(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％相同)的序列。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有(例如，其组成为)与SEQIDNO:1或2至少95％相同(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％相同)的序列。在其他实例中，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可包含从N-末端去除1-30个氨基酸(例如，1-25个氨基酸、1-20个氨基酸、1-15个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-3个氨基酸、1或2个氨基酸、20-25个氨基酸、15-25个氨基酸、10-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-8个氨基酸和5-15个氨基酸)和/或从C-末端去除1-30个氨基酸(例如，1-25个氨基酸、1-20个氨基酸、1-15个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-3个氨基酸、1或2个氨基酸、20-25个氨基酸、15-25个氨基酸、10-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-8个氨基酸和5-15个氨基酸)的SEQIDNO:2的序列。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可与异源氨基酸序列或标签共价键合。可与重组人α-半乳糖苷酶蛋白键合的异源氨基酸序列的非限制性实例包括：多聚-His标签、壳多糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶和链霉亲和素。任何类型的标签可与人α-半乳糖苷酶-A蛋白共价键合(例如，荧光团、放射性核苷酸和荧光蛋白)。可与人α-半乳糖苷酶-A蛋白共价键合的分子的其他实例包括聚合物例如，聚乙二醇、聚乙烯、聚酯、聚交酯、聚乙交酯、聚己内酯及其共聚物。人α-半乳糖苷酶-A蛋白的示例性前体和成熟序列分别示于图2(分别为SEQIDNO:1和2)。如本文所述的重组人α-半乳糖苷酶蛋白可包括与SEQIDNO:1或2至少95％相同(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％相同)的序列。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有(例如，其组成为)与SEQIDNO:1或2至少95％相同(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％相同)的序列。在其他实例中，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可包含从N-末端去除1-30个氨基酸(例如，1-25个氨基酸、1-20个氨基酸、1-15个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-3个氨基酸、1或2个氨基酸、20-25个氨基酸、15-25个氨基酸、10-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-8个氨基酸和5-15个氨基酸)和/或从C-末端去除1-30个氨基酸(例如，1-25个氨基酸、1-20个氨基酸、1-15个氨基酸、1-10个氨基酸、1-5个氨基酸、1-3个氨基酸、1或2个氨基酸、20-25个氨基酸、15-25个氨基酸、10-25个氨基酸、1-10个氨基酸、1-8个氨基酸和5-15个氨基酸)的SEQIDNO:2的序列。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可与异源氨基酸序列或标签共价键合。可与重组人α-半乳糖苷酶蛋白键合的异源氨基酸序列的非限制性实例包括：多聚-His标签、壳多糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶和链霉亲和素。任何类型的标签可与人α-半乳糖苷酶-A蛋白共价键合(例如，荧光团、放射性核苷酸和荧光蛋白)。可与人α-半乳糖苷酶-A蛋白共价键合的分子的其他实例包括聚合物例如，聚乙二醇、聚乙烯、聚酯、聚交酯、聚乙交酯、聚己内酯及其共聚物。示例性的编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸(例如，cDNA)示于图2(SEQIDNO:1)。在一些实例中，本文所述的任何核酸(例如，cDNA)可与一种或多种荧光标签和淬灭剂共价键合。在其他实例中，任何核酸(例如，cDNA)可包含或进一步包含至少一个含有放射性同位素(例如，P32、P33和/或S35)的核苷酸。α-半乳糖苷酶-A蛋白改变的糖型本说明书提供与相比具有改变的(例如，改进的)糖基化的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白具有例如增加的双-甘露糖-6-磷酸寡糖占总N-连接寡糖的百分比(相比)，其导致与甘露糖-6-磷酸受体增加的结合，继而可增加通过在其表面表达甘露糖-6-磷酸受体蛋白的哺乳动物细胞(例如，人细胞)进行的对重组蛋白的内吞率(相比)。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白还可具有与相比减少的单唾液酸化寡糖占总N-连接寡糖的百分比和增加的四唾液酸化寡糖占总N-连接寡糖的百分比之一或两者，相比其可分别导致减少的重组蛋白对肝的非特异性靶向(施用所述重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白至受试者例如人受试者后通过与表达在肝细胞表面上的脱唾液酸糖蛋白受体结合)和增加的血清半衰期。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶A蛋白在其组合物中还例如显示较少的可变性(例如，糖型的较少可变性)和/或为更安全的产品(例如，受到噬菌体、细菌、分枝杆菌和病毒(例如，肠病毒(例如，人或动物肠病毒)、鼻病毒(例如，动物或人鼻病毒)、动物或人小核糖核酸病毒(picobirnavirus)，嵴病毒(kobuvirus)、传染性牛鼻气管炎、牛病毒性腹泻病毒、牛呼肠弧病毒-3、杯状病毒科病毒(caliciviridae)、埃可病毒(echovirus)、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒(例如，动物或人轮状病毒)、牛泡沫病毒、猪内源性逆转录病毒、牛免疫缺陷病毒、肝炎病毒、水疱疹病毒(vesivirus)(例如，水疱疹病毒2117)、诺如病毒(例如，动物或人诺如病毒)、星状病毒(例如，人或动物星状病毒)、动物或人副流感病毒或偏肺病毒(metapneumovirus)、指环病毒(anellovirus)、冠状病毒、白蛉病毒(phlebovirus)、牛施马伦贝格病毒(bovineschmallenbergvirus)、杯状病毒、环病毒(cyclovirus)、圆环病毒(circovirus)(例如，猪或牛圆环病毒)、cosaviruses、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、库巴病毒(kubavirus)、瘟病毒、多瘤病毒(例如，牛多瘤病毒)、牛乳头瘤病毒、2型新啮齿动物乳头瘤SV40、细小病毒(例如，猪、啮齿动物、人或牛细小病毒)、心病毒(例如，EMCV)、副粘病毒、水泡性口炎病毒、环转病毒(gyrovirus)、cosavirus、塞涅卡谷病毒(Senecavalleyvirus)、冠状病毒、马传染性贫血、人腺病毒、猫杯状病毒、2型腺病毒、牛3型腺病毒、伪狂犬病病毒、牛病毒性腹泻、3型副流感、牛传染性鼻气管炎、蓝舌病病毒、猫白血病病毒、小鼠的细小病毒、牛细小病毒、卡奇谷病毒(cachevalleyvirus)、呼肠孤病毒(例如，动物或人呼肠孤病毒)、犬腺病毒、SV-40病毒、脑心肌炎病毒、猪PRRSV、牛疱疹病毒4或口蹄疫)中一种或多种污染的风险或水平降低)。相比之前显示具有显著不同的糖基化模式(Lee等人，Glycobiology13:305-313,2003)。认为和的糖基化模式的显著不同部分是由于用来产生这些蛋白的不同的细胞系(例如，由CHO细胞系产生而由人细胞系产生)。是Genzyme生产和销售的人α-半乳糖苷酶-A蛋白的重组形式。和制备的方法描述于例如美国专利号5,356,804。是由Shire生产和销售的人α-半乳糖苷酶-A蛋白的重组形式。和制备的方法描述于例如美国专利号6,083,725；6,458,574；6,395,884和7,133,354.本文提供的重组人α-半乳糖苷酶蛋白(FZ2G)具有下文(i)至(xii)列举的任何结构特征的两种或多种(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)(例如，任何组合)。(i)至(xii)的一个或多个参数中的每一个的下文所列值的任何范围可在本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白中存在。此外，本文提供的任何重组人α-半乳糖苷酶蛋白可具有本部分中所述的示例性功能特性的一种或多种(例如，一种、二种或三种)。本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的物理特征和/或功能特性的任何组合可以任何方式组合。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的结构特征的示例性的组合在下文描述。此外，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)在结构上可具有较少的可变性(例如，糖型的较少可变性)和/或减少的污染风险或水平(例如，减少的污染风险或水平)。任何本文提供的rhAGA蛋白可具有不可检测水平的或不具有存在于动物产品(例如动物血清、动物血浆或动物血液产品)中的蛋白、脂质、糖、核酸和污染物(例如任何本文所述的污染物)。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是在仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是在仅使用无蛋白和/或化学限定的培养基的细胞培养中产生的rhAGA蛋白。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生并使用整合和连续过程(例如，本文或WO14/137903中描述的任何整合和连续过程)分离的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。任何本文提供的rhAGA蛋白可以是具有改进的安全性概貌的rhAGA蛋白(例如，减少的污染风险(例如，任何本文描述的或本领域已知的示例性污染物)，如与通过包括使用含有动物产品(例如，动物血清、动物血浆或动物血液因子或蛋白)的培养基的方法产生的本文提供的rhAGA蛋白相比)。生物物理特征I.N-连接单唾液酸化的寡糖相比本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有减少的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖。相比本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有大约相同或略微减少的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化的岩藻糖的寡糖。该特征是具有优势的，这是由于单唾液酸化的寡糖可包含与肝中的肝细胞上表达的脱唾液酸糖蛋白受体结合的暴露的半乳糖残基。肝并非重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的靶组织，且因此认为单唾液酸化寡糖的量的减少也减少了人机体中该酶的非有效(non-productive)靶向。具有约1.7％至约3.2％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰3)。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有约0.1％至约1.6％(例如，约0.1％至约1.5％、约0.1％至约1.4％、约0.1％至约1.3％、约0.1％至约1.2％、约0.1％至约1.1％、约0.1％至约1.0％、约0.1％至约0.9％、约0.1％至约0.8％、约0.1％至约0.7％、约0.1％至约0.6％、约0.1％至约0.5％、约0.1％至约0.4％、约0.2％至约1.4％、约0.2％至约1.3％、约0.2％至约1.2％、约0.2％至约1.0％、约0.2％至约0.9％、约0.2％至约0.8％、约0.2％至约0.7％、约0.3％至约1.4％、约0.3％至约1.3％、约0.3％至约1.3％、约0.3％至约1.2％、约0.3％至约1.2％、约0.3％至约1.1％、约0.3％至约1.0％、约0.3％至约0.9％、约0.3％至约0.8％、约0.3％至约0.7％、约0.4％至约1.4％、约0.4％至约1.3％、约0.4％至约1.2％、约0.4％至约1.1％、约0.4％至约1.0％、约0.4％至约0.9％、约0.4％至约0.8％、约0.4％至约0.7％、约0.5％至约1.4％、约0.5％至约1.3％、约0.5％至约1.2％、约0.5％至约1.1％、约0.5％至约1.0％、约0.5％至约0.9％或约0.6％至约1.2％)的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰3)。具有约2.0％至约5.7％的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化的岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰2)。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约0.1％至约3.0％(例如，约0.1％至约2.9％、约0.1％至约2.8％、约0.1％至约2.7％、约0.1％至约2.6％、约0.1％至约2.5％、约0.1％至约2.4％、约0.1％至约2.3％、约0.1％至约2.2％、约0.1％至约2.1％、约0.1％至约2.0％、约0.1％至约1.9％、约0.1％至约1.8％、约0.1％至约1.7％、约0.1％至约1.6％、约0.1％至约1.5％、约0.1％至约1.4％、约0.1％至约1.3％、约0.1％至约1.2％、约0.3％至约3.0％、约0.3％至约2.9％、约0.3％至约2.8％、约0.3％至约2.7％、约0.3％至约2.6％、约0.3％至约2.5％、约0.3％至约2.4％、约0.3％至约2.3％、约0.3％至约2.2％、约0.3％至约2.1％、约0.3％至约2.0、约0.3％至约1.9％、约0.3％至约1.8％、约0.3％至约1.7％、约0.3％至约1.6％、约0.3％至约1.5％、约0.3％至约1.4％、约0.3％至约1.3％或约0.3％至约1.2％)的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化的岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰2)。用于确定单唾液酸化寡糖或包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例。其他方法为本领域已知。II.N-连接双-甘露糖-6-磷酸寡糖与相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰11)。增加的双-甘露糖-6-磷酸寡糖水平导致对于在其质膜上表达甘露糖-6-磷酸受体的细胞的靶向增加。与甘露糖-6-磷酸受体的结合触发酶内吞入细胞和酶向细胞溶酶体的穿梭(shuttle)。具有约4.0％至约7.0％的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰11)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有大于约7.5％(例如，大于约7.6％、大于约7.7％、大于约7.8％、大于约7.9％、大于约8.0％、大于约8.1％、大于约8.2％、大于约8.2％、大于约8.3％、大于约8.4％、大于约8.5％、大于约8.6％、大于约8.7％、大于约8.8％、大于约8.9％、大于约8.9％、大于约9.0％、大于约9.1％、大于约9.2％、大于约9.3％、大于约9.4％、大于约9.5％、大于约9.6％、大于约9.7％、大于约9.8％、大于约9.9％、大于约10.0％、大于约10.1％、大于约10.2％、大于约10.3％、大于约10.4％、大于约10.5％、大于约10.6％、大于约10.7％、大于约10.8％、大于约10.9％或大于约11％)的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰11)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约7.0％至约13％、约8.0％至约12.0％或约9.0％至约11.0％的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖。用于确定双-甘露糖-6-磷酸寡糖占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。III.N-连接双唾液酸化和包含N-连接双唾液酸化岩藻糖的寡糖与相比，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有大约相同或增加的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)。与相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有减少的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰5)。认为增加的包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖的水平增加蛋白体内和/或体外(例如，在受试者的血清中或在药物组合物中)的半衰期。具有约11.0％至约14.2％的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大于约13.0％(例如，大于约13.1％、大于约13.2％、大于约13.3％、大于约13.4％、大于约13.5％、大于约13.6％、大于约13.7％、大于约13.8％、大于约13.9％、大于约14.0％、大于约14.1％、大于约14.2％、大于约14.3％、大于约14.4％、大于约14.5％、大于约14.6％、大于约14.7％、大于约14.8％、大于约14.9％或大于15.0％)的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约13.0％至约15.0％、约13.5％至约15.5％、约14.0％至约16.0％或约14.5％至约16.5％的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)。具有约5.6％至约7.1％的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰5)。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有约0.1％至约5.3％(例如，约0.1％至约5.2％、约0.1％至约5.1％、约0.1％至约5.0％、约0.1％至约4.9％、约0.1％至约4.8％、约0.1％至约4.7％、约0.1％至约4.6％、约0.1％至约4.5％、约0.1％至约4.4％、约0.1％至约4.3％、约0.1％至约4.2％、约0.1％至约4.1％、约0.1％至约4.0％、约0.1％至约3.9％、约0.1％至约3.8％、约0.1％至约3.7％、约0.1％至约3.6％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.4％、约0.1％至约3.3％、约0.1％至约3.2％、约0.1％至约3.1％、约0.1％至约3.0％、约0.1％至约2.9％、约0.1％至约2.8％、约0.1％至约2.7％、约0.1％至约2.6％、约0.1％至约2.5％、约0.3％至约5.2％、约0.3％至约5.1％、约0.3％至约5.0％、约0.3％至约4.9％、约0.3％至约4.8％、约0.3％至约4.7％、约0.3％至约4.6％、约0.3％至约4.5％、约0.3％至约4.4％、约0.3％至约4.3％、约0.3％至约4.2％、约0.3％至约4.1％、约0.3％至约4.0％、约0.3％至约3.9％、约0.3％至约3.8％、约0.3％至约3.7％、约0.3％至约3.6％、约0.3％至约3.5％、约0.3％至约3.5％、约0.3％至约3.4％、约0.3％至约3.3％、约0.3％至约3.2％、约0.3％至约3.1％、约0.3％至约3.0％、约0.3％至约2.9％、约0.3％至约2.8％、约0.3％至约2.7％、约0.3％至约2.6％或约0.3％至约2.5％)的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰5)。用于确定双唾液酸化和包含双唾液酸化的岩藻糖占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他为本领域已知。IV.N-连接三唾液酸化寡糖相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角、三唾液酸化寡糖(即邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6’)。相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白具有减少的百分比的总N-连接寡糖是1型三触角、三唾液酸化寡糖(即邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6)。图10的小图显示两个三触角、三唾液酸化寡糖结构，其中在使用2-AA衍生化的N-连接寡糖的色谱洗脱谱中，两结构之一对应峰6(1型)且两结构中的另一个对应峰6’(2型)。认为增加的包含三唾液酸化岩藻糖的寡糖水平可在体内和/或体外(例如，受试者的血清中或药物组合物中)增加蛋白的半衰期。具有约0.5％至约1.2％的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角三唾液酸化寡糖(例如邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6’)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大于2.0％(例如，大于2.1％、大于2.2％、大于2.3％、大于2.4％、大于2.5％、大于2.6％、大于2.7％、大于2.8％、大于2.9％、大于3.0％、大于3.1％、大于3.2％、大于3.3％、大于3.4％、大于3.5％、大于3.6％、大于3.7％、大于3.8％、大于3.9％、大于4.0％、大于4.1％、大于4.2％、大于4.3％、大于4.4％、大于4.5％、大于4.6％、大于4.7％、大于4.8％、大于4.9％、大于5.0％、大于5.1％、大于5.2％、大于5.3％、大于5.4％、大于5.5％、大于5.6％、大于5.7％、大于5.8％、大于5.9％、大于6.0％、大于6.1％、大于6.2％、大于6.3％、大于6.4％、大于6.5％、大于6.7％、大于6.8％、大于6.9％、大于7.0％或大于7.1％)的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角、三唾液酸化寡糖(例如邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6’)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约5.0％至约9.0％、约5.5％至约8.5％、约6.0％至约8.0％或约6.5％至约7.5％的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角、三唾液酸化寡糖(例如邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6’)。具有约9.5％至约13％的百分比的总N-连接寡糖为1型三触角、三唾液酸化寡糖(例如邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有约0.1％至约9.0％(例如，约0.1％至约8.9％、约0.1％至约8.8％、约0.1％至约8.7％、约0.1％至约8.6％、约0.1％至约8.5％、约0.1％至约8.4％、约0.1％至约8.3％、约0.1％至约8.2％、约0.1％至约8.1％、约0.1％至约8.0％、约0.1％至约7.9％、约0.1％至约7.8％、约0.1％至约7.7％、约0.1％至约7.6％、约0.1％至约7.5％、约0.1％至约7.4％、约0.1％至约7.3％、约0.1％至约7.2％、约0.1％至约7.1％、约0.1％至约7.0％、约0.1％至约6.9％、约0.1％至约6.8％、约0.1％至约6.7％、约0.1％至约6.6％、约0.1％至约6.5％、约0.1％至约6.4％、约0.1％至约6.3％、约0.1％至约6.2％、约0.1％至约6.1％、约0.1％至约6.0％、约0.1％至约5.9％、约0.1％至约5.8％、约0.1％至约5.7％、约0.1％至约5.6％、约0.1％至约5.5％、约0.1％至约5.4％、约0.1％至约5.3％、约0.1％至约5.2％、约0.1％至约5.1％、约0.1％至约5.0％、约0.1％至约4.9％、约0.1％至约4.8％、约0.1％至约4.7％、约0.1％至约4.6％、约0.1％至约4.5％、约0.1％至约4.4％、约0.1％至约4.3％、约0.1％至约4.2％、约0.1％至约4.1％、约0.1％至约4.0％、约0.1％至约3.9％、约0.1％至约3.8％、约0.1％至约3.7％、约0.1％至约3.6％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.4％、约0.1％至约3.3％、约0.1％至约3.2％、约0.1％至约3.1％或约0.1％至约3.0％)的百分比的总N-连接寡糖为1型三触角、三唾液酸化寡糖(例如邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6)。用于确定三唾液酸化寡糖占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。V.唾液酸/蛋白的摩尔/摩尔比率本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有与大约相同或更大的唾液酸比蛋白的摩尔比摩尔比率。认为在寡糖中存在的增加的唾液酸分子数目增加蛋白在体外或和/或体内(例如，在药物组合物中和在哺乳动物的血清中)的半衰期。具有约2.6至约3.3的唾液酸比蛋白的摩尔比摩尔比率。还具有大于1.5的唾液酸比甘露糖-6-磷酸的摩尔比摩尔比率。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大于3.0(例如，大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4、大于3.5、大于3.6、大于3.7、大于3.8、大于3.9、大于4.0、大于4.1、大于4.2、大于4.3、大于4.4、大于4.5、大于4.6、大于4.7、大于4.8、大于4.9或大于5.0)的唾液酸比蛋白的摩尔/摩尔比率。用于确定唾液酸比蛋白的摩尔/摩尔比率的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。VI.N-连接电中性寡糖与相比，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有减少的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)。具有约4.0％至约7.1％的百分比的总N-连接寡糖为N-连接电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有约0.1％至约3.9％(例如，约0.1％至约3.8％、约0.1％至约3.7％、约0.1％至约3.6％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.4％、约0.1％至约3.3％、约0.1％至约3.2％、约0.1％至约3.1％、约0.1％至约3.0％、约0.1％至约2.9％、约0.1％至约2.8％、约0.1％至约2.7％、约0.1％至约2.6％、约0.1％至约2.5％、约0.1％至约2.4％、约0.1％至约2.3％、约0.1％至约2.2％、约0.1％至约2.1％、约0.1％至约2.0％、约0.1％至约1.9％、约0.1％至约1.8％、约0.1％至约1.7％、约0.1％至约1.6％、约0.1％至约1.5％、约0.1％至约1.4％、约0.1％至约1.3％、约0.1％至约1.2％、约0.1％至约1.1％、约0.1％至约1.0％、约0.3％至约3.9％、约0.3％至约3.8％、约0.3％至约3.7％、约0.3％至约3.6％、约0.3％至约3.5％、约0.3％至约3.4％、约0.3％至约3.3％、约0.3％至约3.2％、约0.3％至约3.1％、约0.3％至约3.0％、约0.3％至约2.9％、约0.3％至约2.8％、约0.3％至约2.7％、约0.3％至约2.6％、约0.3％至约2.5％、约0.3％至约2.4％、约0.3％至约2.3％、约0.3％至约2.2％、约0.3％至约2.1％、约0.3％至约2.0％、约0.3％至约1.9％、约0.3％至约1.8％、约0.3％至约1.7％、约0.3％至约1.6％、约0.3％至约1.5％、约0.3％至约1.4％、约0.3％至约1.3％、约0.3％至约1.2％、约0.3％至约1.1％或约0.3％至约1.0％)的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)。用于确定电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。VII.N-连接甘露糖-6-磷酸寡糖相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白具有大约相同或略微减少的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖。具有约5.5％至约10.0％的百分比的总N-连接寡糖为N-连接甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约0.1％至约7.0％(例如，约0.1％至约6.9％、约0.1％至约6.8％、约0.1％至约6.7％、约0.1％至约6.6％、约0.1％至约6.5％、约0.1％至约6.4％、约0.1％至约6.3％、约0.1％至约6.2％、约0.1％至约6.1％、约0.1％至约6.0％、约0.1％至约5.9％、约0.1％至约5.8％、约0.1％至约5.7％、约0.1％至约5.6％、约0.1％至约5.5％、约0.1％至约5.4％、约0.1％至约5.3％、约0.1％至约5.2％、约0.1％至约5.1％或约0.1％至约5.0％)的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约5.0％至约7.0％的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)。用于确定甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。VIII.N-连接单磷酸化寡糖相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖。具有约10.9％至约14.7％的百分比的总N-连接寡糖为N-连接单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有大于约14.8％(例如，大于约14.9％、大于15.0％、大于约15.1％、大于约15.2％、大于约15.3％、大于约15.4％、大于约15.5％、大于约15.6％、大于约15.7％、大于约15.8％、大于约15.9％、大于约16.0％、大于约16.1％、大于约16.2％、大于约16.3％大于约16.4％、大于约16.5％、大于约16.6％、大于约16.7％、大于约16.8％、大于约16.9％、大于约17.0％、大于约17.1％、大于约17.2％、大于约17.3％、大于约17.4％、大于约17.5％、大于约17.6％、大于约17.7％、大于约17.8％、大于约17.9％、大于约18.0％、大于约18.1％、大于约18.2％、大于约18.3％、大于约18.4％、大于约18.5％、大于约18.6％、大于约18.7％、大于约18.8％、大于约18.9％、大于约19.0％、大于约19.1％、大于约19.2％、大于约19.3％、大于约19.4％、大于约19.5％、大于约19.6％、大于约19.7％、大于约19.8％、大于约19.9％、大于约20.0％、大于约20.1％、大于约20.2％、大于约20.3％、大于约20.4％、大于约20.5％、大于约20.6％、大于约20.7％、大于约20.8％、大于约20.9％、大于约21.0％、大于约21.1％、大于约21.2％、大于约21.3％、大于约21.4％、大于约21.5％、大于约21.6％、大于约21.7％、大于约21.8％、大于约21.9％、大于约22.0％、大于约22.1％、大于约22.2％、大于约22.3％、大于约22.4％、大于约22.5％、大于约22.6％、大于约22.7％、大于约22.8％、大于约22.9％或大于约23.0％)的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约15.5％至约17.5％、约16.0％至约18.0％或约16.5％至约18.5％的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)。用于确定单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。IX.N-连接四唾液酸化寡糖相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)。认为增加的四唾液酸化寡糖的水平增加蛋白在体内和/或体外(例如，在受试者血清中或在药物组合物中)的半衰期。具有约2.3％至约4.8％的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有大于约4.9％(例如，大于约5.0％、大于约5.1％、大于约5.2％、大于约5.3％、大于约5.4％、大于约5.5％、大于约5.6％、大于约5.7％、大于约5.8％、大于约5.9％、大于约6.0％、大于约6.1％、大于约6.2％、大于约6.3％、大于约6.4％、大于约6.5％、大于约6.6％、大于约6.7％、大于约6.8％、大于约6.9％、大于约7.0％、大于约7.1％、大于约7.2％、大于约7.3％、大于约7.4％、大于约7.5％、大于约7.6％、大于约7.7％、大于约7.8％、大于约7.9％或大于约8.0％)的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约6.0％至约8.0％、约6.5％至约8.5％、约6.0％至约9.0％或约7.0％至约9.0％的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)。用于实施和确定四唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。X.单唾液酸化的和单磷酸化的N-连接混合结构相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有增加的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化、单磷酸化、混合结构。具有约6.0％至约8.1％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化、单磷酸化、混合寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有大于约8.2％(例如，大于约8.3％、大于约8.4％、大于约8.5％、大于约8.6％、大于约8.7％、大于约8.8％、大于约8.9％、大于约9.0％、大于约9.1％、大于约9.2％、大于约9.3％、大于约9.4％、大于约9.5％、大于约9.6％、大于约9.7％、大于约9.8％、大于约9.9％、大于约10.0％、大于约10.1％、大于约10.2％、大于约10.3％、大于约10.4％、大于约10.5％、大于约10.6％、大于约10.7％、大于约10.8％、大于约10.9％、大于约11.0％、大于约11.1％、大于约11.2％、大于约11.3％、大于约11.4％或大于约11.5％)的百分比的总N-连接混合寡糖为单唾液酸化、单磷酸化、混合寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白具有约8.5％至约10.5％、约9.0％至约11.0％或约8.5％至约9.5％的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化、单磷酸化混合寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)。用于确定单唾液酸化和单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)占总N-连接寡糖的百分比的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。XI.等电点相比当通过成像的毛细管等电聚焦(icIEF)分析时，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白还具有迁移的等电点(参见实施例3和表3)。用于确定多肽等电点的示例性方法描述于实施例中。其他用于确定多肽等电点的方法(例如，等点聚焦凝胶)为本领域已知。XII.甘露糖-6-磷酸/蛋白的摩尔/摩尔比率相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有大约相同或较大的甘露糖-6-磷酸比蛋的摩尔比摩尔比率。认为增加的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比摩尔比率增加通过在质膜中表达甘露糖-6-磷酸受体的细胞进行的蛋白的细胞摄取。具有约1.7至约3.1的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比摩尔比率。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有基本上与相同或大于1.7(例如，大于1.8、大于1.9、大于2.0、大于2.1、大于2.2、大于2.3、大于2.4、大于2.5、大于2.6、大于2.7、大于2.8、大于2.9、大于3.0、大于3.1、大于3.2、大于3.3、大于3.4或大于3.5)的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比摩尔比率。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)可具有约1.8至约3.5(例如，约1.8至约3.4、约1.8至约3.3、约1.8至约3.2、约1.8至约3.1、约1.8至约3.0、约1.8至约2.9、约1.8至约2.8、约1.8至约2.7、约1.8至约2.6、约1.8至约2.5、1.8至约2.4、约1.8至约2.3、约1.8至约2.2、约1.8至约2.1、约1.8至约2.0、约1.9至约3.5、约1.9至约3.4、约1.9至约3.3、约1.9至约3.2、约1.9至约3.1、约1.9至约3.0、约1.9至约2.9、约1.9至约2.8、约1.9至约2.7、约1.9至约2.6、约1.9至约2.5、约1.9至约2.5、约1.9至约2.4、约1.9至约2.3、约1.9至约2.2、约1.9至约2.1、约2.0至约3.5、约2.0至约3.4、约2.0至约3.3、约2.0至约3.2、约2.0至约3.1、约2.0至约3.0、约2.0至约2.9、约2.0至约2.8、约2.0至约2.7、约2.0至约2.6、约2.0至约2.5、约2.0至约2.4、约2.0至约2.3、约2.0至约2.2、约2.1至约3.5、约2.1至约3.4、约2.1至约3.3、约2.1至约3.2、约2.1至约3.1、约2.1至约3.0、约2.1至约2.9、约2.1至约2.8、约2.1至约2.7、约2.1至约2.6、约2.1至约2.5、约2.1至约2.4、约2.1至约2.3、约2.2至约3.5、约2.2至约3.4、约2.2至约3.3、约2.2至约3.2、约2.2至约3.1、约2.2至约3.0、约2.2至约2.9、约2.2至约2.8、约2.2至约2.7、约2.2至约2.6、约2.2至约2.5、约2.2至约2.4、约2.3至约3.5、约2.3至约3.4、约2.3至约3.3、约2.3至约3.2、约2.3至约3.1、约2.3至约3.0、约2.3至约2.9、约2.3至约2.8、约2.3至约2.7、约2.3至约2.6、约2.3至约2.5、约2.4至约3.5、约2.4至约2.9、约2.4至约2.8、约2.4至约2.7、约2.4至约2.6、约2.5至约3.5、约2.5至约3.4、约2.5至约3.3、约2.5至约3.2、约2.5至约3.1、约2.5至约3.0、约2.5至约2.9、约2.5至约2.8、约2.5至约2.7、约2.6至约3.5、约2.6至约3.4、约2.6至约3.3、约2.6至约3.2、约2.6至约3.1、约2.6至约3.0、约2.6至约2.9、约2.6至约2.8、约2.7至约3.5、约2.7至约3.4、约2.7至约3.3、约2.7至约3.2、约2.7至约3.1、约2.7至约3.0、约2.7至约2.9、约2.8至约3.5、约2.8至约3.4、约2.8至约3.3、约2.8至约3.2、约2.8至约3.1、约2.8至约3.0、约2.9至约3.5、约2.9至约3.4、约2.9至约3.3、约2.9至约3.2、约2.9至约3.1、约3.0至约3.5、约3.0至约3.4、约3.0至约3.3、约3.0至约3.2、约3.1至约3.5、约3.1至约3.4、约3.1至约3.3、约3.2至约3.5、约3.4至约3.4或约3.3至约3.5)的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比摩尔比率。用于确定甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔/摩尔比率的示例性方法描述于实施例中。其他方法为本领域已知。功能性特征本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有一种或多种(例如，一种、两种或三种)下列功能性特征：增加的通过表达甘露糖-6-磷酸受体的哺乳动物细胞进行的内吞作用(例如，增加的内吞率)、减少的与脱唾液酸化糖蛋白受体的结合和增加的与甘露糖-6-磷酸受体的亲和力，各自与相比。用于确定表达甘露糖-6-磷酸的哺乳动物细胞中重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的内吞作用(例如，内吞率)的方法为本领域已知(例如，Osborne等人，Curr.Protoc.CellBiol.,Chapter11,Unit11.18,2005)。表达甘露糖-6-磷酸受体的哺乳动物细胞的非限制性实例包括成纤维细胞和上皮细胞。如本领域已知，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的内吞作用可通过组织培养基(或哺乳动物血清)中蛋白水平的减少、表达甘露糖-6-磷酸受体的哺乳动物细胞中重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白溶酶体或细胞内水平的增加，或间接地通过例如在接触的哺乳动物细胞或在组织培养基中(或哺乳动物血清中)具有末端α-半乳糖基残基的糖鞘脂如globotriaoscylceramide(GL-3)积累的减少检测。组织培养基(或哺乳动物血清)中重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的减少可例如使用基于抗体的试验(例如，酶联免疫吸附试验)或活性试验(例如，使用pNP或4MU作为底物的活性试验)确定。与重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白结合的抗体的实例可从Millipore、LifeSpanBioSciences,Inc.、ThermoScientificPierceAntibodies、AcrisAntibodiesGmbH和R&DSystems获得。用于确定溶酶体或细胞内重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的方法可包括例如使用免疫荧光显微术、细胞透化和免疫印迹，和/或细胞或溶酶体裂解物的质谱。可例如通过在组织培养基或在哺乳动物血清中使用质谱(例如，Kim等人，KoreanJ.Intern.Med.25:415-421,2010)或基于抗体的试验(例如，美国专利申请号2012/0178105)检测随时间的GL-3的水平确定globotriaoscylceramide(GL-3)积累的减少。在每个实例中，可将重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的内吞作用与进行比较。用于确定蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)与脱唾液酸糖蛋白受体结合的能力的方法为本领域已知。例如，确定重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白与脱唾液酸糖蛋白受体的结合的试验可包括接触表达脱唾液酸糖蛋白的细胞(例如，肝细胞)的步骤。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白与脱唾液酸糖蛋白的结合还可使用表面等离子体共振(例如，Biacore技术)(参见例如，Stokmaier等人，Bioorg.Med.Chem.17:7254-7264,2009)或Kornilova等人(Anal.Biochem.425:43-46,2012)中所述的荧光极化脱唾液酸糖蛋白受体结合试验确定。在任何情况中，可与比较重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白与脱唾液酸糖蛋白受体的结合。用于确定重组α-半乳糖苷酶-A蛋白与甘露糖-6-磷酸受体结合的方法可使用包括使重组α-半乳糖苷酶-A蛋白与表达甘露糖-6-磷酸受体的细胞(例如，成纤维细胞或上皮细胞)接触的步骤的试验实施。在其他实例中，重组α-半乳糖苷酶-A蛋白与甘露糖-6-磷酸受体的结合可使用表面等离子体共振(例如，Biacore技术)或亲和层析方法确定。可与比较重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白与甘露糖-6-磷酸受体的结合。示例性的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可具有约0.1％至约1.6％(例如，约0.1％至约1.3％或约0.1％至约1.0％)的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰3)且大于约7.5％(例如，大于约8.5％、大于约9.0％或大于约9.5％)的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰11)。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可进一步具有大于约13.0％(例如，大于约13.5％、大于约14.0％、大于约14.5％、大于约15.0％、大于约15.5％或大于约16.0％)的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)且大于约2.0％(例如，大于约2.5％、大于约3.0％、大于约3.5％、大于约4.0％、大于约4.5％、大于约5.0％、大于约5.5％、大于约6.0％、大于约6.5％或大于约7.0％)的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角、三唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6′)。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可进一步具有一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或9种)下列物理特征：约0.1％至约3.9％(例如，约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.0％、约0.1％至约2.5％或约0.1％至约2.0％)的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)；约0.1％至约3.0％(例如，约0.1％至约2.5％或约0.1％至约2.0％)的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰2)；约0.1％至约5.3％(例如，约0.1％至约5.0％、约0.1％至约4.5％、约0.1％至约4.0％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.0％或约0.1％至约2.5％)的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰5)；约0.1％至约9.0％(例如，约0.1％至约8.5％、约0.1％至约8.0％、约0.1％至约7.5％、约0.1％至约7.0％、约0.1％至约6.5％、约0.1％至约6.0％、约0.1％至约5.5％、约0.1％至约5.0％、约0.1％至约4.5％、约0.1％至约4.0％、约0.1％至约3.5％、约0.1％至约3.0％、约0.1％至约2.5％或约0.1％至约2.0％)的百分比的总N-连接寡糖为1型三触角、三唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6)；约0.1％至约7.0％(例如，约0.1％至约6.5％、约0.1％至约6.0％、约0.1％至约5.5％、约0.1％至约5.0％、约0.1％至约4.5％或约0.1％至约4.0％)的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)；大于约14.8％(例如，大于约15.0％、大于约15.5％、大于约16.0％、大于约16.5％、大于约17.0％、大于约17.5％、大于约18.0％、大于约18.5％、大于约19.0％、大于约19.5％、大于约20.0％、大于约20.5％、大于约21.0％、大于约21.5％、大于约22.0％、大于约22.5％或大于约23.0％)的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)；大于约4.9％(例如，大于约5.0％、大于约5.5％、大于约6.0％、大于约6.5％、大于约7.0％、大于约7.5％或大于约8.0％)的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)；和大于约8.2％(例如，大于约8.5％、大于约9.0％、大于约9.5％或大于约10.0％)的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化、单磷酸化混合寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)。相比重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白还可具有下列一种或多种功能性特征：增加的通过表达甘露糖-6-磷酸受体的哺乳动物细胞进行的内吞作用(例如，增加的内吞率)、减少的与脱唾液酸化糖蛋白受体的结合和增加的与甘露糖-6-磷酸受体的亲和力。在其他实例中，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白具有小于的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰3)且大于的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰11)。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白还可具有约与相同或更大的百分比的总N-连接寡糖为包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰4)，且大于的百分比的总N-连接寡糖为2型三触角、三唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6’)。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白还可具有一种或多种下列结构特征：少于的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰1)；约与相同或更小的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰2)；小于的百分比的总N-连接寡糖为双唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰5)；小于的百分比的总N-连接寡糖为1型三触角、三唾液酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰6)；约与相同或较小的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰7)；大于的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰8)；大于的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰9)；和大于的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化、单磷酸化混合结构(例如，邻氨基苯甲酸标记的N-连接寡糖概貌中的峰10)。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白还可具有一种或多种下列的功能性特征：增加的通过表达甘露糖-6-磷酸受体的哺乳动物细胞进行的内吞作用(例如，增加的内吞率)、减少的与脱唾液酸糖蛋白受体的结合和增加的与甘露糖-6-磷酸受体的亲和力，各自与相比。表达载体本文还提供了包含编码本发明重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)的表达载体。例如，所述表达载体可包含与SEQIDNO:1至少90％相同(例如，至少90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％相同)的编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)。除该序列外，表达载体可包含与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)5’末端可操作连接的启动子(和任选地一种或多种增强子序列)。表达载体可包含与编码重组蛋白的序列(例如，cDNA)的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列；和与编码重组蛋白的序列(例如，cDNA)的3’末端可操作连接的编码多聚(A)识别位点的序列。表达载体可包含编码哺乳动物选择标记物(例如，人或狗合成酶蛋白)的序列(例如，cDNA)和与所述编码哺乳动物选择标记物的序列(例如，cDNA)5’末端可操作连接的启动子序列，和任选的与编码哺乳动物选择基因的序列(例如，cDNA)的3’末端均可操作连接的SV40早期内含子序列和多聚(A)信号序列。表达载体可包含下列一者或多者(例如，两者或三者)：与编码原核选择基因(例如氨苄青霉素抗性基因)的序列的5’末端可操作连接的原核启动子序列、原核复制起点序列和真核复制起点序列。可与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)可操作连接的启动子序列(和任选的一种或多种增强子序列)的非限制性实例包括：猿猴病毒40(SV40)早期启动子、核糖体蛋白21(rpS21)启动子、仓鼠β-肌动蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，CMV即刻早期启动子(参见例如，Teschendorf等人，AnticancerRes.22:3325-3330,2002)、泛素C(UBC)启动子、延伸因子1-α(EF1A)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PCK)启动子、来自小鼠CMV的IE2启动子/增强子区(参见例如，Chatellard等人，Biotechnol.Bioeng.96:106-117,2007)和鸡β-肌动蛋白启动子。可在本文所述的任何表达载体中使用的人基因启动子的其他非限制性实例描述于哺乳动物启动子数据库(WistarInstitutewebsiteatmrpombdb.wister.upenn.edu)中。可在表达载体中使用的哺乳动物启动子序列的其他实例为本领域已知。可在表达质粒中使用的启动子和增强子的一个非限制性实例为具有CMV增强子的鸡β-肌动蛋白启动子(本领域称为CAGG启动子)。本文提供的表达载体包括与编码人重组α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)的5’末端可操作连接的rpS21启动子、仓鼠β-肌动蛋白启动子或SV40早期启动子序列；与编码人重组α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，编码本文所述的人重组α-半乳糖苷酶-A蛋白的任何核酸)(例如，cDNA)的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列，和与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸序列的3’末端可操作连接的包含多聚(A)识别位点的序列。多聚(A)识别位点序列的非限制性实例是牛生长激素多聚(A)识别位点。多聚(A)识别位点的结构特征描述于Nunes等人，EMBOJ.29:1523-1536,2010中。其他多聚(A)识别位点为本领域已知。在一些实例中，表达载体包含与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)的5’末端均可操作连接的仓鼠β-肌动蛋白启动子和具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列，和与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列(例如，cDNA)的3’末端可操作连接的SV40早期内含子和多聚(A)识别序列。一些表达载体可包含编码哺乳动物选择基因的序列。哺乳动物选择基因的非限制性实例包括：二氢叶酸还原酶基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀稻瘟素抗性基因、博莱霉素(zeocin)抗性基因、谷氨酰胺合成酶基因、二氢叶酸抗性基因和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。编码这些哺乳动物选择基因的序列的实例为本领域已知。编码哺乳动物选择基因的序列的5’末端可与启动子(例如，本领域已知或本文所述的任何示例性启动子)可操作连接。一些表达载体(例如，任何本文所述的表达载体)可包含哺乳动物复制起点序列和/或原核复制起点序列。哺乳动物复制起点序列为本领域已知(例如，Todorovic等人，Front.Biosci.4:D859-D568,1999；Aladjem,Front.Biosci.9:2540-2547,2004；Hamlin,Bioessays14:651-659,1992)。原核复制起点序列为本领域已知(例如，Marczynski等人，Curr.Opin.Genet.Dev.3:775-782,1993)。载体的非限制性实例为质粒。本文提供的质粒的非限制性实例示于图3和4中。图3描述了编码下列元件的质粒：编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸(例如，cDNA)、与编码人α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸的5’末端连接的启动子(例如，仓鼠β-肌动蛋白启动子)、与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52的肽的序列、与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的3’末端可操作连接的多聚(A)识别序列(例如，SV40早期多聚(A)识别序列)、编码哺乳动物选择基因(标记物)的核酸序列(例如，二氢叶酸还原酶基因或人或狗谷氨酰胺合成酶基因)，和与编码哺乳动物选择基因(标记物)的核酸序列的5’末端可操作连接的启动子序列(例如，SV40早期启动子)。图4描述了包含下列的表达质粒：编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列、与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列(例如，CMV启动子和内含子)、与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的3’末端可操作连接的多聚(A)识别序列(例如，SV40早期多聚(A)识别序列)、编码哺乳动物选择基因(标记物)(例如，谷氨酰胺合成酶)的序列、与编码哺乳动物选择基因(标记物)的序列的5’末端可操作连接的启动子序列(例如，SV40启动子)、原核复制起点序列、编码原核选择基因(标记物)(例如，氨苄青霉素抗性基因)的序列、与原核选择基因(标记物)的5’末端可操作连接的原核启动子序列，和真核复制起点序列。表达载体可以是病毒载体。病毒载体的非限制性实例包括腺病毒载体、疱疹病毒载体、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。表达载体还可以是质粒或粘粒。宿主细胞本文还提供了包含编码本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的宿主细胞。所述序列可与启动子序列(例如，任何本文所述的示例性启动子序列或本领域已知的任何病毒或哺乳动物启动子序列)可操作连接。例如，编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列和与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列的序列可整合入宿主细胞的染色体中。在其他实例中，编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列和与编码重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5’末端可操作连接的启动子序列存在于宿主细胞内的表达载体中(例如，任何本文所述的表达载体)。用于将核酸(例如，任何本文所述的核酸或表达载体)引入细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)的方法为本领域已知。例如，核酸可使用脂质体转染、电穿孔、磷酸钙介导的转染、病毒(例如，逆转录病毒)转导、DEAE-葡聚糖介导的细胞转染、树枝状聚合物介导的转染、sono-穿孔、光转染、刺穿染(impalefection)、水动力递送、磁转染或弹道转染(ballistictransfection)引入细胞。宿主细胞可以是任何类型的哺乳动物细胞。例如，宿主细胞可以是细胞系例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHODG44细胞、CHO-K1s细胞、C02.31克隆细胞、A14.13克隆细胞、C02.57克隆细胞和F05.43克隆细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如，NS/0)、B-细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚胎肾(HEK)细胞(例如，HEK293E和HEK293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)或Madin-Darby犬类(CockerSpaniel)肾上皮细胞(MDCK)细胞。其他可使用本文所述的方法培养的哺乳动物细胞为本领域已知。宿主细胞可以是例如，上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、肾细胞、肺细胞、T-细胞、骨髓瘤细胞或B-细胞。一些宿主细胞可在悬浮细胞培养或在贴壁细胞培养中生长。生成哺乳动物细胞系的方法本文还提供了生成对于糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、任何其他列于表1的酶或任何其他本领域已知的糖蛋白)重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法。图5是可用于生成针对表达重组糖蛋白优化的亲代细胞系的步骤的流程图。这些方法可包括提供血清依赖性永生化细胞系和在下列中顺序培养所述哺乳动物细胞系：(1)在包含第一浓度(1X)的动物血清的细胞培养基中培养约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天或约5天至约7天)；(2)在包含约0.2X至约0.4X(例如，约0.2X至约0.3X)浓度的动物血清的细胞培养基中培养约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天或约5天至约7天)；和(3)在包含约0.01X至约0.25X(例如，约0.01X至约0.20X、约0.01X至约0.15X或约0.01X至约0.08X)动物血清的细胞培养基中培养约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天或约5天至约7天)，顺序培养后从培养物生成单细胞亚克隆培养物，并选择具有可接受转染效率的亚克隆、在无血清培养基中使细胞生长并表达重组蛋白；并在无蛋白、无血清、化学限定的培养基中培养所选亚克隆约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天或约5天至约7天)；在无蛋白、无血清、化学限定的培养基中培养后从培养物生成单细胞亚克隆培养物；并选择具有可接受的转染效率、峰细胞密度、生长特性、体积生产率(VPR)和糖蛋白糖基化概貌的亚克隆，其中(f)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的。还提供了生成对于糖蛋白(例如，任何本文所述或本领域已知的重组糖蛋白)重组表达有用的哺乳动物细胞系的方法，其包括：(a)提供血清依赖性永生化细胞系和在下列中顺序培养所述哺乳动物细胞系：(1)在包含第一浓度(1X)(例如，约5％)的动物血清(例如，胎牛血清)的细胞培养基中培养约1天至约30天(例如，约2天至约25天、约2天至约20天、约2天至约15天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天或约2天至约7天)；(2)在包含约0.2X至约0.6X(例如，约0.2X至约0.5X)浓度的动物血清(例如，胎牛血清)的细胞培养基中培养约1天至约30天(例如，约2天至约25天、约2天至约20天、约2天至约15天、约2天至约12天、约2天至约11天、约2天至约10天、约2天至约9天、约2天至约8天或约2天至约7天)；和(3)在包含约0X至约0.20X(例如，约0X至约0.15X、约0X至约0.10X或约0X至约0.05X)动物血清(例如，胎牛血清)的细胞培养基中培养约5天至约30天(例如，约5天至约25天、约5天至约20天、约5天至约15天、约5天至约12天、约5天至约11天、约5天至约10天、约5天至约9天、约5天至约8天或约5天至约7天)；(b)顺序培养后从培养物生成单细胞亚克隆培养物，并选择具有可接受转染效率的亚克隆，在无血清培养基中使细胞生长并表达重组蛋白(例如，选择与其他检验的亚克隆培养物相比具有最佳转染效率、细胞生长和重组蛋白表达的亚克隆培养物)；(c)从(b)选择的亚克隆培养物生成单细胞亚克隆培养物；并(d)选择(c)中生成的具有可接受的转染效率、峰细胞密度(例如，无血清培养基中的峰细胞密度)、生长特性(例如，无血清培养基中的生长)、体积生产率(VPR)和重组蛋白表达的单细胞亚克隆，其中(d)中选择的亚克隆对于糖蛋白的重组表达是有用的(例如，与其他检验的亚克隆培养物相比具有最佳转染效率、峰细胞密度、生长特征、VPR和重组蛋白表达的亚克隆培养物)。本文还提供了由本文所述的任何方法产生的哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。可在本文所述任何方法中使用的血清依赖性永生化细胞系的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤细胞、B-细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚胎肾(HEK)细胞、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)和Madin-Darby犬类(CockerSpaniel)肾上皮细胞(MDCK)细胞。其他可用于本文所述任何方法中的血清依赖性永生化细胞系为本领域已知。例如，血清依赖性永生化细胞系可以是上皮细胞系、内皮细胞系、淋巴细胞细胞系、肾细胞系、肺细胞系、T-细胞系、骨髓瘤细胞系或B-细胞系。在一些实例中，血清依赖性永生化细胞系在悬液中生长。在其他实例中，血清依赖性永生化细胞系在贴壁细胞培养中生长。在一些实例中，血清依赖性永生化细胞系不内源性表达二氢叶酸还原酶。选择的亚克隆(在方法中选择的第一或第二亚克隆)可在悬液中生长。用于培养永生化哺乳动物细胞系的方法为本领域已知。用于确定转染效率、在无血清培养基中的细胞生长、重组蛋白表达、峰细胞密度(例如，峰活细胞密度)、细胞生长特性、体积生产率和产生的重组蛋白的糖基化概貌的方法为本领域已知。例如，转染效率可通过检测转染入细胞的表达质粒中报告基因的表达水平确定(例如，这种报告基因的表达可使用荧光辅助的细胞分选检测)。重组蛋白表达可例如通过使用与所述重组蛋白特异性结合的抗体检测组织培养基中和细胞内存在的重组蛋白的水平确定。重组蛋白表达可以是例如抗体或酶之一或两者(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或任何列于图1中的酶)。可通过例如随时间测量在细胞培养物中的细胞密度(例如，活细胞密度)(例如，使用血细胞计数或其它市售自动细胞计数器)评估峰细胞密度和细胞生长。细胞的体积生产率可使用本领域已知的方法通过随时间评估在细胞培养基中或细胞内存在的重组蛋白的水平确定。由细胞产生的重组糖蛋白的糖基化概貌可例如使用本说明书实施例部分中所述的任何方法确定(例如，2-氨基苯甲酸(AA)-衍生化和具有激光诱导荧光检测的毛细管电泳)。如本领域已知，通过本文所述方法产生的哺乳动物细胞系可在低温保存(例如，低于-20℃、低于-30℃、低于-40℃、低于-50℃、低于-60℃、低于-70℃或低于-80℃)以供未来使用。制备用于在低温保存的哺乳动物细胞系储液的方法描述于例如Hewitt,MethodsMol.Biol.640:83-105,2010和helan,Curr.Protoc.Hum.Genet.Apendix3:3G,2006)中。在一些实例中，由本文所述方法产生的哺乳动物细胞系未暴露于包含血清和/或包含血清的培养基(例如，保存前和/或保存后)。在一些实例中，本文所述方法产生的哺乳动物细胞系仅在无动物衍生组分(ADC)的培养基中培养。在一些实例中，本文所述方法产生的哺乳动物细胞系仅在无血清、无蛋白、化学限定的培养基中培养。产生重组糖蛋白的方法本文还提供产生重组糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、任何列于图1中的酶或任何本领域已知的重组糖蛋白)的方法。这些方法包括提供由任何本文所述方法产生的哺乳动物细胞、将包含编码糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、任何列于图1中的酶或任何本领域已知的重组糖蛋白)的序列的核酸(例如，表达载体)导入细胞、在足以产生所述糖蛋白的条件下于无血清培养基中培养细胞，并从细胞或生长培养基收获所述糖蛋白。还提供可通过任何本文所述方法产生的重组糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)。在一些实例中，包含编码糖蛋白的序列的核酸是表达载体(例如，任何本文所述的表达载体)。在其他实例中，包含编码糖蛋白的序列的核酸整合入哺乳动物细胞的染色体。在一些实例中，培养使用悬浮细胞培养实施。在其他实例中，使用多个具有允许哺乳动物细胞附着和生长的表面的微载体实施培养。所述多个微载体可具有下列平均直径：例如，约20μm至约1mm(例如，约20μm至约250μm、约100μm至约250μm、约150μm至约250μm、约250μmand500μm、约200μm至约300μm、约750μmand1mm、约200μm至约800μm、约200μm至约500μm或约500μm至约800μm)，其中微载体具有允许或促进哺乳动物细胞(例如，任何本文所述或本领域已知的哺乳动物细胞)附着的表面。在一些实例中，微载体可包含一个或多个孔(例如，一个或多个具有约10μm至约100μm的平均直径的孔)。在一些实例中，微载体的表面和/或多个微载体的一个或多个孔的表面用促进哺乳动物细胞附着至微载体的作用剂包被(例如，与微载体的外表面和/或微载体中的孔的表面附着)。微载体在形状上可以是大致球形或椭球形。在一些实施方案中，微载体具有的外表面和/或微载体孔具有的表面带正电(例如，由于N，N-二乙基氨基乙基基团的存在带正电)。可在本文所述任何方法中使用的非限制性的示例性微载体包括CytoPoreTM1和CytoPoreTM2(可从GEHealthcare、LifeSciences、Piscataway、NewJersey获得)。其他可用于培养的微载体的实例可公开获得且为本领域已知。在一些实例中，使用生物反应器实施培养。生物反应器可具有例如，约1L至约10,000L(例如，约1L至约50L、约50L至约500L、约500L至约1000L、约500L至约5000L、约500L至约10,000L、约5000L至约10,000L、约1L至约10,000L、约1L至约8,000L、约1L至约6,000L、约1L至约5,000L、约100L至约5,000L、约10L至约100L、约10L至约4,000L、约10L至约3,000L、约10L至约2,000L或约10L至约1,000L)的体积。生物反应器中存在的液体培养基的量可以是例如约0.5L至约5,000L(例如，约0.5L至约25L、约25L至约250L、约250L至约500L、约250L至约2500L、约250L至约5,000L、约2500L至约5,000L、约0.5L至约5,000L、约0.5L至约4,000L、约0.5L至约3,000L、约0.5L至约2,500L、约50L至约2,500L、约5L至约50L、约5L至约2,000L、约5L至约1,500L、约5L至约1,000L或约5L至约500L)。培养细胞可使用例如补料分批生物反应器或灌注生物反应器实施。培养可通过补料分批培养或灌注培养实施(例如，在生物反应器中)。任何本文所述的生物反应器的内表面可具有至少一种涂层(例如，至少一种明胶、胶原蛋白、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的涂层)，和如本领域已知的一个或多个用于将O2、CO2和N2喷射入液体培养基的端口和用于搅拌液体培养基的搅拌机制。生物反应器可在受控的潮湿环境中温育细胞培养物(例如，在大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度或100％湿度)。生物反应器还可配备能够从生物反应器去除一定体积的液体培养基的机械装置和任选的在将液体培养基转出生物反应器的过程中从液体培养基去除细胞的机械装置内的过滤器(例如，交替切向流(ATF)或切向流过滤(TFF)系统)。培养可包括在生物反应器中将液体培养基暴露至包括最多或约15％CO2(例如，最多或约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或最多或约1％CO2)的环境(atmosphere)。培养可在约31℃至约40℃的温度实施。本领域的技术人员将理解的是在培养过程中特定的时间点可改变温度，例如，以每小时或每日为基础。例如，温度可在用哺乳动物细胞初始接种生物反应器后的约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或约20天或更久改变或迁移(例如，增加或减少)。例如，温度可上移(例如，多至或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或多至或约20℃的变化)。例如，温度可下移(例如，大于0.05℃或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或至多或约20℃的变化)。培养可使用无蛋白、无血清、化学限定的培养基实施。这种培养基的非限制性实例为本领域已知且可商业获得。有效的培养基的非限制性实例包括例如CDCHO、OptiCHO和FortiCHO(全部可从LifeTechnologies；GrandIsland,NY获得)、HycellCHO培养基(ThermoFisherScientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cellCDCHOFusion培养基(Sigma-AldrichCo.；St.Louis,MO)和PowerCHO培养基(LonzaGroup,Ltd.；Basel,Switzerland)。哺乳动物细胞可以是任何本文所述的哺乳动物细胞。例如，哺乳动物细胞可以是CHO细胞。哺乳动物细胞可以是不内源性表达二氢叶酸还原酶的细胞(例如，不内源性表达二氢叶酸还原酶的CHO细胞)。重组糖蛋白可以是酶(例如，人α-半乳糖苷酶-A蛋白，任何图1列举的蛋白或任何其他本领域已知的糖蛋白)或抗体或其抗原结合片段。在一些实例中，核酸(例如，表达载体)包含与SEQIDNO:1至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相同的序列。核酸(例如，表达载体)可包含与编码糖蛋白的核酸的5’末端可操作连接的启动子序列、与编码糖蛋白的核酸的5’末端可操作连接的具有TTG起始密码子的编码人CD52蛋白的肽的序列，和与编码糖蛋白的核酸的3’末端可操作连接的编码多聚(A)识别位点的序列。例如，启动子序列可选自下组：仓鼠rpS21启动子、仓鼠β-肌动蛋白启动子和SV40早期启动子。编码多聚(A)识别位点的序列可以是SV40早期多聚(A)识别序列。在一些实例中，启动子序列可以是仓鼠β-肌动蛋白启动子且多聚(A)识别序列是SV40早期多聚(A)识别序列。在一些实例中，核酸进一步包含编码人或狗谷氨酰胺合成酶的序列(例如，其中编码人或狗谷氨酰胺合成酶的核酸的5’末端与SV40早期启动子可操作连接且编码人或狗谷氨酰胺合成酶的核酸的3’末端与SV40早期内含子和多聚(A)信号序列可操作连接)。在一些实例中，所述核酸进一步包含编码二氢叶酸还原酶(DHFR)(例如，人或小鼠DHFR)的序列(例如，其中编码二氢叶酸还原酶的核酸的5’末端与SV40早期启动子可操作连接且编码二氢叶酸还原酶的核酸的3’末端与SV40早期内含子和多聚(A)信号序列可操作连接)。培养可使用灌注生物反应器实施。灌注培养为本领域已知且包括从生物反应器去除第一体积的第一液体培养基(例如，包含任何浓度的哺乳动物细胞的培养基，例如基本上无细胞的第一液体培养基的第一体积)，并将第二体积的第二液体培养基添加至第一液体培养基。去除和添加可同时或顺序或以两种方式的组合进行。此外，去除和添加可持续实施(例如，在任何给定的时间段(例如，在24小时的时间段、在约1小时至约24小时的增量时间段或在大于24小时的增量时间段)以去除和替换生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％-800％(例如，1％-700％、1％-600％、1％-500％、1％-400％、1％-350％、1％-300％、1％-250％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％、4％-30％)的速率)或定期实施(例如，每三天一次、每两天一次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)或其组合。在定期实施的情况中，去除或替换的体积(例如，24小时的时间段内、约1小时至约24小时的增量时间段内或大于24小时的增量时间段内)可以是生物反应器体积或第一液体培养基体积的例如0.1％-800％(例如，1％-700％、1％-600％、1％-500％、1％-400％、1％-300％、1％-200％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％和4％-30％)。去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积在一些情况中可在培养全程或部分在每24小时的时间段(或可替换地，约1小时至约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)保持大致相同。如本领域已知，第一液体培养基的第一体积去除的速率(体积/时间单位)和第二液体培养基的第二体积的添加速率(体积/时间单位)可发生变化。第一液体培养基的第一体积去除的速率(体积/时间单位)和第二液体培养基的第二体积的添加速率(体积/时间单位)可大约相同或可不同。可替换地，去除和添加的体积可在培养期过程中每24小时的时间段(或可替换地，1小时至约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)内改变(例如，逐渐增加)。例如，在培养期过程中去除的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积在每24小时的时段内(或可替换地，约1小时至24小时以上的增量时间段或大于24小时的增量时间段)可从生物反应器体积或第一液体培养基的体积的0.5％至约20％增加(例如，逐渐或通过交错递增)至生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。本领域的技术人员将理解的是第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基(例如，无血清或无血清、无蛋白、化学限定的培养基)。在其他情况中，第一液体培养基和第二液体培养基可不同。第一体积的第一液体培养基可使用例如机械系统和/或通过使所述体积渗出或在重力下流过具有排除存在于所述体积中的哺乳动物细胞的分子量截留的无菌膜来去除。可以自动化的方式添加第二体积的第二液体培养基至第一液体培养基，例如，通过灌注泵。在一些实例中，去除第一体积的第一液体培养基(例如，基本上无哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)和添加第二体积的第二液体培养基至第一液体培养基不在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内发生(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)。可替换地或此外，培养可使用补料分批生物反应器实施。这种培养为本领域已知且在培养期的大部分时间包括添加第二体积的第二液体培养基至第一液体培养基(例如，定期或持续添加)。第二液体培养基的添加可持续实施(例如，在任何给定时间段(例如，在24小时的时间段、在约1小时至约24小时的增量时间段或在大于24小时的增量时间段)以添加生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％-300％(例如，1％-250％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％,和4％-30％)的速率)或定期实施(例如，每三天一次、每两天一次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)或以其组合实施。在定期实施的情况中，添加的体积(例如，24小时的时间段内、约1小时至约24小时的增量时间段内或大于24小时的增量时间段内)可以是例如生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％、300％(例如，1％-200％、1％-100％、100％-200％、5％-150％、10％-50％、15％-40％、8％-80％和4％-30％)。添加的第二体积的第二液体培养基在一些情况中可在培养全程或部分在每24小时的时间段(或可替换地，约1小时至约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)保持大致相同。如本领域已知，第二液体培养基的第二体积的添加速率(体积/时间单位)在培养全程或部分可发生变化。例如，在培养期过程中添加的第二液体培养基的体积可在每24小时的时间段(或可替换地，1小时至约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)变化(例如，逐渐增加)。例如，在培养期过程中添加的第二液体培养基的体积可在每24小时的时间段(或可替换地，1小时至24小时以上的增量时间段或大于24小时的增量时间段)从生物反应器体积或第一液体培养基的体积的0.5％至约20％增加(例如，逐渐或通过交错递增)至约生物反应器体积或第一液体培养基体积的25％至约150％。第二体积的第二液体培养基的添加速率(体积/时间单位)在培养全程或部分中可大约相同。本领域的技术人员将理解的是第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基(例如，无蛋白培养基或无血清、无蛋白、化学限定的培养基)。在其他情况中，第一液体培养基可以与第二液体培养基不同类型。第二液体培养基的体积可以自动化的方式添加至第一液体培养基，例如，通过灌注泵。在一些情况中，添加第二体积的第二液体培养基至第一液体培养基不在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内但在不超过7天时发生(例如，至少至2小时、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后，但不超过用哺乳动物细胞接种生物反应器之后7天)。补料分批培养中的细胞培养基通常在培养期结束时收获，然而，补料分批培养中的细胞培养基也可在培养时间段的一个或多个时间点收获。本领域的技术人员将理解的是本文记载的用于培养的任何不同的参数(例如，生物反应器、体积、替换培养体积的速率或频率、搅拌、温度、培养基和/或CO2浓度)可在实施这些方法中以任何组合使用。可实施分离重组糖蛋白的额外的步骤。如本领域已知，这些方法根据糖蛋白的物理性质和活性有所不同。例如，当设计用于分离重组糖蛋白(例如，从培养基或从细胞)的步骤时，应考虑参数如糖蛋白的结合特异性(例如，底物或抗原结合活性)、净电荷和/或尺寸。可使用一种或多种下列的方法以分离重组糖蛋白(例如，使用本文所述的任何方法产生的重组糖蛋白)：亲和柱层析、离子(例如，阳离子或阴离子)交换柱层析、尺寸排阻柱层析、反相柱层析、过滤和沉淀。用于分离重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的非限制性方法描述于实施例中。在一些实例中，从液体培养基分离重组糖蛋白可使用整合、连续过程实施(例如，包括使用至少两个多重柱层析系统(MCCS)的过程)。用于分离重组糖蛋白的整合、连续过程的非限制性实例描述于美国临时申请号61/775,060和61/856,390和WO14/137903。用于从液体培养基分离本文提供的rhAGA的整合和连续过程的非限制性实例在下文描述。本文所述的方法可进一步包括将分离的重组糖蛋白配制到药学上可接受的赋形剂或缓冲剂中(例如，用于向受试者的施用)。这些方法可进一步包括无菌过滤、病毒灭活、UV照射和/或冻干，或其任何组合。用于分离rhAGA蛋白的整合和连续步骤本文提供的rhAGA可使用整合和连续过程分离。用于使用整合和连续过程分离重组蛋白的方法和关于这些过程的步骤的细节为本领域已知。参见WO14/137903和美国专利公开号2014/0225994。此外，WO14/137903还描述了可用于实施这些整合和连续过程的系统和设备。例如，用于分离本文提供的rhAGA蛋白的整合和连续过程可包括：(a)提供包含本文提供的rhAGA蛋白的液体培养基，其基本上无细胞，其中将所述液体培养基补给入第一多重柱层析系统(MCCS1)；(b)在液体培养基中使用MCCS1捕获本文提供的rhAGA蛋白，其中将包含本文提供的rhAGA蛋白的MCCS1的洗脱物连续补给入第二多重柱层析系统(MCCS2)；和(c)使用MCCS2纯化和精制本文提供的rhAGA蛋白，其中来自MCCS2的洗脱物是分离的本文提供的rhAGA蛋白或是rhAGA蛋白药物物质，且所述过程是整合的并从所述液体培养基连续运行至来自MCCS2的、为本文提供的分离的rhAGA蛋白或rhAGA蛋白药物物质的洗脱物。MCCS1和/或MCCS2可例如实施至少两个单元操作。在一些实施方案中，MCCS1或MCCS2或两者涉及柱切换。在一些实施方案中，MCCS1实施捕获本文提供的rhAGA蛋白的单元操作并灭活病毒。在一些实施方案中，MCCS2实施纯化和精制本文提供的rhAGA蛋白的单元操作。MCCS1和/或MCCS2可利用例如至少两个层析柱。MCCS1和/或MCCS2可利用例如至少两个层析膜。MCCSl和/或MCCS2可利用例如至少一个层析柱和至少一个层析膜。MCCSl可以是例如周期性逆流层析系统(PCCSl)。PCCSl可以是例如四柱PCCS。在一些实施方案中，四柱PCCS中的四个柱可实施从液体培养基捕获本文提供的rhAGA蛋白的单元操作。捕获可使用例如亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析或分子筛层析实施。亲和层析可使用选自以下的捕获机制实施：例如，蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合机制。来自四柱PCCS中四个柱中三个的包含本文提供的rhAGA蛋白的洗脱物可补给入四柱PCCS的第四个柱。四柱PCCS的第四个柱可实施例如灭活病毒(通过在用于病毒灭活的低pH保持包含本文提供的rhAGA蛋白的洗脱物)的单元操作。例如，四柱PCCS的第四个柱可持续约10分钟至约1.5小时在用于病毒灭活的低pH保持包含本文提供的rhAGA蛋白的洗脱物。在一些实施方案中，MCCS2可以是例如周期性逆流层析系统(PCCS2)。在一些实例中，所述过程进一步包括在将来自四柱PCCS的第四个柱的洗脱物补给入PCCS2前使用在线的缓冲调整贮液器调整来自四柱PCCS的第四个柱的洗脱物的pH的步骤。PCCS2可例如包括三个层析柱和层析膜。PCCS2中的三个层析柱可实施例如纯化本文提供的rhAGA蛋白的单元操作(例如通过阳离子或阴离子交换层析)。来自PCCS2中三个柱的洗脱物可补给入例如PCCS2中的层析膜。PCCS2中的层析膜可例如实施精制PCCS2中三个层析柱洗脱物中的本文提供的rhAGA蛋白的单元操作(例如通过阳离子或阴离子交换层析)。层析膜的流通液和洗涤液可以是本文提供的分离的rhAGA蛋白或rhAGA蛋白药物物质。一些实例进一步包括在将来自PCCS2中三个柱的洗脱物补给入PCCS2中的层析膜前使用在线缓冲调整来调整来自PCCS2中三个柱的洗脱物的离子浓度。一些实施方案进一步包括在PCCSl和PCCS2间使用中止罐。一些实例进一步包括在将来自PCCSl的洗脱物补给入PCCS2前对其过滤。一些实施方案进一步包括将液体培养基补给入MCCS1前对其过滤。药物组合物和试剂盒本文还提供了包含至少一种(例如，一种、两种、三组或四种)本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的药物组合物。药物组合物中可以任何组合存在两种或多种(例如，两种、三组或四种)任何本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白。本文还提供包含、其组成为或其组成基本上为本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白和药学上可接受载剂的药物组合物。任何本文提供的药物组合物可具有不可检测水平的或不具有存在于动物产品(例如动物血清、动物血浆或动物血液产品)中的蛋白、脂质、糖、核酸和污染物(例如任何本文所述的污染物)。任何本文提供的药物组合物可以包括在仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生的本文提供的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。任何本文提供的药物组合物可以包括在仅使用无蛋白培养基和/或化学限定的培养基的细胞培养中产生的本文提供的rhAGA蛋白。任何本文提供的药物组合物可以包括仅使用选自下组的培养基的细胞培养中产生并使用整合和连续过程(例如，本文或WO14/137903中描述的任何整合和连续过程)分离的本文提供的rhAGA蛋白：无蛋白、无血清和化学限定培养基。任何本文提供的药物组合物可以具有改进的安全性概貌(例如，减少的污染风险(例如，任何本文描述的或本领域已知的示例性污染物)，如与包含通过包括使用含有动物产品(例如，动物血清、动物血浆或动物血液因子或蛋白)的培养基的方法产生的rhAGA蛋白(例如，任何本文提供的rhAGA蛋白)的药物组合物相比)。可以任何本领域已知的方式配制药物组合物。本文提供的药物组合物是具有优势的，这是由于其具有减少的污染风险或水平(例如，减少的病毒污染风险或水平)和/或在组合物中存在的糖型具有减少异质性。配制药物组合物以与其目标施用途径兼容(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)。组合物可包含药学上可接受的载剂，例如无菌稀释剂(例如，无菌水或盐水)、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂、抗细菌或抗真菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂如乙二胺四乙酸，缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和等渗剂如糖(例如，右旋糖)、多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)或盐(例如，氯化钠)或其任何组合。脂质体悬液也可用作药学上可接受的载剂(参见例如，美国专利号4,522,811)。可配制组合物的制剂并封装在安瓿、一次性注射器或多次剂量小瓶中。酌情(如在可注射的配制物中)，可通过例如使用包衣如卵磷脂或表面活性剂维持合适的流动性。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的吸收可通过包括延迟吸收的作用剂延长(例如，单硬脂酸铝和明胶)。可替换地，可通过移植物和微封装递送系统实现受控的释放，其可包含生物可降解、生物兼容的聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；AlzaCorporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。可配制包含任一种或多种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的组合物用于以剂量单位的形式(即包含预先确定的量的活性蛋白的物理上分离的单位以便于施用和均匀剂量)肠胃外(例如，静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹膜内)施用。组合物的毒性和治疗效力可通过细胞培养或实验动物(例如，猴)中的标准药学流程确定。本领域的技术人员可例如确定LD50(对于群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)：治疗指数是LD50:ED50的比率。优选展示高治疗指数的作用剂。当作用剂展示不理想的副作用时，应进行护理以最小化潜在的损伤(即，减少不想要的副作用)。毒性和治疗效力可通过其他标准药学流程确定。从细胞培养试验和动物研究获得的数据可用于配制合适剂量的任何给定重组糖蛋白(例如，任何本文所述的重组糖蛋白)用于在受试者(例如，人)中使用。治疗上有效量的一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(例如，任何本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)会是在受试者中治疗法布里病的量(例如，在受试者(例如，鉴别为具有增加的形成法布里病的风险的人受试者)中减少法布里病进展的风险或预防进展)、减少受试者(例如，人)中法布里病的一种或多种症状的严重性、频率和/或持续时间(例如，与具有相同疾病但未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)的量、减少具有法布里病的受试者(例如，人)中具有末端α-半乳糖基残基的糖鞘脂如globotriaoscylceramide的积累水平(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂或相同受试者在治疗前相比)的量。任何本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的疗效和剂量可由医护专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过对受试者(例如，人)中一种或多种法布里病症状的观察确定。一些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时机(例如，疾病或病症的严重性、之前的治疗、受试者的整体健康状况和/或年龄和其他疾病的存在)。任何本文所述的药物组合物可进一步包含一种或多种(例如，两种、三种、四种或五种)其他治疗剂。其他可包括在任何本文所述的药物组合物中的治疗剂的非限制性实例包括：抗惊厥药(anticonvulsant)(例如，苯妥英钠(phenytoin)、卡马西平(carbamazepine)、苯巴比妥(phenobarbital)、甲基苯巴比妥(methylphenobarbital)、barbexaclone、苯二氮卓(benzodiazepine)、氯巴占(clobozan)、氯硝西泮(clonazepam)、氯氮卓(clorazepate)、地西泮(diazepam)、咪达唑仑(midazolam)、劳拉西泮(lorazepam)、硝西泮(nitrazepam)、替马西泮(temazepam)、硝甲西泮(nimetazepam)、非氨酯(felbamate)、卡马西平(carbamazepine)、奥卡西平(oxcarbazepine)、eslicarbazepineacetate、氨己烯酸(vigabatrin)、progabide、噻加宾(tiagabine)、托吡酯(topiramate)、加巴喷丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、乙苯妥英(ethotoin)、苯妥英钠(phenytoin)、美芬妥英(mephenytoin)、磷苯妥英(fosphenytoin)、甲乙双酮(paramethadione)、三甲双酮(trimethadione)、美沙酮(ethadione)、beclamide、扑米酮(primidone)、布立西坦(brivaracetam)、左乙拉西坦(levetiracetam)、塞曲西坦(seletracetam)、乙琥胺(ethosuximide)、phensuximide、mesuximide、乙酰唑胺(acetazolamide)、sultiame、醋甲唑胺(methazolamide)、唑尼沙胺(zonisamide)、拉莫三嗪(lamotrigine)、pheneturide、phenacemide、valpromide和valnoctamide)，和止吐剂(例如，甲氧氯普胺(metoclopramide)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、阿立必利(alizapride)、多拉司琼(dolasetron)、格拉司琼(granisetron)、昂丹司琼(ondansetron)、托烷司琼(tropisetron)、帕诺斯琼(palonosetron)、米氮平(mirtazapine)、多潘立酮(domperidone)、奥氮平(olanzapine)、氟哌利多(droperidol)、氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、阿瑞吡坦(aprepitant)和casopitant)。示例性的剂量包括毫克或微克量的任何本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白每千克的受试者体重(例如，约50μg/kg至约3mg/kg；约100μg/kg至约2.5mg/kg；约100μg/kg至约2.0mg/kg；约500μg/kg至约1.5mg/kg；约500μg/kg至约1.5mg/kg；或约800μg/kg至约1.2mg/kg)。示例性的剂量还可包括微克或毫克量的一种或多种任何一种或多种本文所述的其他治疗剂每千克的受试者体重(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg，对于每种施用的其他治疗剂)。由于这些剂量覆盖了很宽的范围，本领域的普通技术人员将理解包括本文所述的重组α-半乳糖苷酶-A蛋白和其他治疗剂的治疗剂在效力上有所不同，且有效的量可通过本领域已知的方法确定。通常，相对低的剂量最先施用，且主治的护理专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况中)或研究者(当仍致力于开发阶段时)可随后并逐渐增加剂量直至获得合适的响应。此外，应该理解的是用于任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括采用的特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、整体健康状况、性别和饮食、施用时间、施用途径、排泄率和重组糖蛋白(例如，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)或其他治疗剂的体内半衰期。药物组合物可包括在同时具有施用说明的容器、包装或分配器中。例如，本文提供的一种或多种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白可作为冻干粉末或饼包装在无菌小瓶中用于稍后重构和施用。包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的冻干粉末或饼可包括一种或多种稳定剂(例如，甘露糖醇、磷酸二氢钠一水合物和磷酸氢二钠七水合物的一种或多种)。包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的冻干粉末或饼的实例包括：37mg的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、222mg甘露糖醇、20.4mg磷酸二氢钠一水合物和59.2mg磷酸氢二钠七水合物。使用或施用重组人α-半乳糖苷酶蛋白前，冻干的粉末或饼通过将7.2mL用于注射的无菌水，USP注射入小瓶中重构以获得5.0mg的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白每mL的溶液。在以约1mg/kg的剂量静脉内施用至受试者前，该重构溶液可进一步用0.9％氯化钠注射剂USP稀释至500mL最终体积。还包括试剂盒，其含有冻干的重组人α-半乳糖苷酶饼或粉末的小瓶(如本段所述)、用于重构饼或粉末(如本段所述)的说明和用于以约1.0mg/kg的剂量每两周静脉内施用重构溶液至受试者的说明。包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的冻干粉末或饼的另一实例包括：5.5mg的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、33.0mg甘露醇、3.0m磷酸二氢钠一水合物和8.8mg磷酸氢二钠七水合物。使用或施用重组人α-半乳糖苷酶蛋白前，冻干的粉末或饼通过将1.1mL用于注射的无菌水，USP注射入小瓶中重构以获得5.0mg的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白每mL的溶液。在以约1mg/kg的剂量静脉内施用至受试者前，该重构溶液可进一步用0.9％氯化钠注射剂USP稀释至500mL最终体积。还包括试剂盒，其含有冻干的重组人α-半乳糖苷酶饼或粉末(如本段所述)的小瓶、用于重构饼或粉末(如本段所述)的说明和用于以约1.0mg/kg的剂量每两周静脉内施用重构溶液至受试者的说明。本文还提供包含至少一个剂量的任何本文所述的药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含用于施用药物组合物(例如，任何本文所述的药物组合物)至哺乳动物(例如，人)的物品(例如注射器，例如预填充注射器)。试剂盒的一些实例包含一个或多个剂量(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、20、30或40个剂量)(例如，静脉内、皮下或腹膜内给药)的任何本文所述的药物组合物。在一些实例中，所述试剂盒进一步包含用于施用药物组合物(或药物组合物的剂量)至哺乳动物(例如，具有法布里病的人)的说明。在一些实施方案中，试剂盒包含含有至少一种本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的组合物，和包含至少一种其他治疗剂(例如，一种或多种其他本文所述的治疗剂的任何组合)的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于实施任何本文所述方法的说明。法布里病法布里病是由称为神经酰胺三己糖酶的α-半乳糖苷酶-A缺陷表征的X-连锁隐性溶酶体贮积症，其导致经由具有末端α-半乳糖基残基的糖鞘脂如globotriaoscylceramide(GL-3)的积累产生的血管和其他疾病表现。法布里病的非限制性实例包括无汗症、手指疼痛、左心室肥厚、肾表现和缺血性中风。症状的严重性显著不同(参见Grewal等人，J.Neurol.241:153-156,1994)。识别了具有局限在心脏的表现的变体，且其发生率可能比之前认为的更普遍(参见Nakao,N.Eng.J.Med.333:288-293,1995)。罕见变体的识别可延迟至生命相当晚的时期，尽管在临床警惕下在幼年进行诊断是可能的Ko等人，Arch.Pathol.Lab.Med.120:86-89,1996；Mendez等人，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.8:252-257,1997；Shelley等人，PediatricDerm.12:215-219,1995)。法布里病诊断的平均年龄是29岁。治疗法布里病、哺乳动物细胞溶酶体中增加的α-半乳糖苷酶水平和受试者中减少的Globotriaosylceramide水平的方法本文还提供了在受试者(例如，人)中治疗法布里病的方法，其包括对受试者施用包含治疗上有效量的至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的组合物或本文所述药物组合物。本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白通过增加受试者哺乳动物细胞内溶酶体中α-半乳糖苷酶-A的浓度介导法布里病的治疗。受试者中法布里病的成功治疗可通过健康专业人员确定(例如，护士、医生或医生助理)。例如，成功的治疗可导致受试者中法布里病的一种或多种症状(例如，无汗症、手指疼痛、左心室肥大、肾表现、缺血性中风和受试者的血清中globotriaosylceramide水平的增加)的数目、严重性和/或频率的减少(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)。此外，成功的治疗可随时间通过观察受试者血清或组织(例如，肾)中globotriaosylceramide水平的减少确定(例如，与接受不同治疗、接受安慰剂或未接受治疗的具有法布里病的受试者相比，或与治疗前的相同受试者相比)。其他用于确定受试者中法布里病成功治疗的方法描述于本文中且为本领域已知。还提供了增加哺乳动物细胞(例如，体外细胞或哺乳动物如人中的细胞)溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的方法，其包括使细胞与至少一种本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一种本文所述的药物组合物以足以增加细胞的溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白的水平的量接触。所述哺乳动物细胞可以是表达甘露糖-6-磷酸受体的细胞。哺乳动物细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶-A的水平可使用采用与人α-半乳糖苷酶蛋白-A特异性结合的抗体的免疫荧光显微术确定。哺乳动物细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白的水平可通过下述确定：从哺乳动物细胞分离溶酶体，并判断分离的溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白的水平，例如通过使用与α-半乳糖苷酶-A蛋白特异性结合的抗体，或通过使用来自分离的溶酶体的裂解物实施α-半乳糖苷酶蛋白-A活性试验。α-半乳糖苷酶-A蛋白试验的一个实例是使用邻硝基苯α-D-半乳糖苷作为底物的试验。在该试验中，邻硝基苯α-D-半乳糖苷转化成产物邻硝基苯酚和D-半乳糖。另一用于检测α-半乳糖苷酶-A蛋白活性的试验的实例使用生荧光底物α-D-半乳糖吡喃糖苷(Shi等人，Anal.Bioanal.Chem.394:1903-1909,2009)。受试者(例如，人)细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的增加可间接通过观察受试者经历的法布里病症状数目的减少(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)、受试者中观察到的法布里病新症状发作率的减少(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)、受试者中一种或多种法布里病症状严重性的减少(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)或受试者中一种或多种法布里病症状的恶化的减少(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)来进行检测。可替换地或此外，细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白水平的增加可例如通过观察受试者血清globotriaosylceramide水平的减少来检测(例如，与具有相同疾病但例如未接受治疗、接受不同治疗或接受安慰剂的对照受试者或治疗前的相同受试者相比)。用本文所述的重组蛋白治疗后哺乳动物细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶-A蛋白水平可与未治疗的哺乳动物细胞(例如，相同类型的细胞)溶酶体中α-半乳糖苷酶-A的水平进行比较。还提供了在受试者(例如，人)血清或组织(例如，肾)中减少globotriaosylceramide水平的方法，其包括施用至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一种本文所述的药物组合物至受试者。受试者血清中globotriaosylceramide的水平可例如使用质谱(Kim等人，KoreanJ.Intern.Med.25:415-421,2010)或抗体三明治试验(例如，描述于美国专利申请号2012/0178105的试验)确定。施用至少一种本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物后，受试者血清或组织中globotriaosylceramide的水平可与具有法布里病但未接受治疗或接受不同治疗的受试者血清或组织中globotriaosylceramide的水平或施用本文提供的至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物前受试者中globotriaosylceramide的水平进行比较。在一些实施方案中，受试者(例如，人)之前已诊断或疑似具有法布里病。在一些实施方案中，哺乳动物已鉴别为具有增加的形成法布里病的风险(例如，增加的形成法布里病的遗传风险)。所述哺乳动物可以是雌性或雄性，且可以是成年或幼年(例如，婴儿或幼童)。在一些情况中，受试者是人。当哺乳动物在幼年时，其可能在1日龄至18岁(包括端值)(例如，1日龄至17岁、1日龄至16岁、1日龄至15岁、1日龄至14岁、1日龄至13岁、1日龄至12岁、1日龄至11岁、1日龄至10岁、1日龄至9岁、1日龄至8岁、1日龄至7岁、1日龄至6岁、1日龄至5岁、1日龄至4岁、1日龄至3岁、1日龄至2岁、1日龄至1岁、1日龄至6月龄、6月龄至4岁、1月龄至5岁、3岁至13岁或13岁至18岁)。当哺乳动物是成年时，哺乳动物可以是例如18-20岁大(包括端值)，或至少或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或至少或约100岁大。受试者可通过医护专业人员经由观察受试者中一种或多种症状(例如，任何一种或多种本文所述的或本领域已知的法布里病症状)诊断为具有法布里病。在一些实例中，受试者可能已经接受针对法布里病的治疗。在其他实例中，针对法布里病的之前的治疗并不成功。本文所述的重组蛋白或药物组合物可通过静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、淋巴内、肌内、眼部或鞘内施用来进行施用。此外，重组蛋白和药物组合物可使用任何本领域已知和/或本文所述的技术配制(例如，配制用于皮下、静脉内、动脉内、淋巴内、肌内、外周肌肉或鞘内施用和/或在脂质体或纳米颗粒中配制)。本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物可通过医护人员(例如，医生、医生助理、护士、护士助理或实验室技术人员)或兽医专业人员施用。可替换地或此外，重组蛋白或药物组合物可由人自施用，例如患者自身。施用可在例如医院、诊所或基层医疗机构(例如，疗养院)或其组合发生。在一些实施方案中，对哺乳动物施用1mg-400mg剂量的任何本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或任何本文所述的药物组合物(例如，1mg-300mg、1mg-250mg、1mg-200mg、1mg-150mg、1mg-100mg、1mg-80mg、1mg-70mg、1mg-60mg、1mg-50mg、1mg-40mg、1mg-30mg、1mg-20mg、1mg-10mg、20mg-120mg、30mg-90mg或40mg-80mg)。在一些实例中，对受试者施用约0.1mg/kg至约4.0mg/kg剂量的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(例如，约0.1mg/kg至约3.5mg/kg、约0.1mg/kg至约3.0mg/kg、约0.1mg/kg至约2.5mg/kg、约0.1mg/kg至约2.0mg/kg、约0.1mg/kg至约1.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1.5mg/kg或约0.7mg/kg至约1.3mg/kg)。在一些实施方案中，对受试者进一步施用其他治疗剂(例如，本文所述的任何其他治疗剂)。所述其他治疗剂可以与重组蛋白或药物组合物的施用在基本上相同的时间施用至受试者和/或在一个或多个其他时间点施用至受试者。在一些实施方案中，将其他治疗剂与至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白共同配制(例如，使用任何本文所述的制剂和组合物的实例)。在一些实施方案中，以第一剂量形式配制其他治疗剂，且以第二剂量形式配制至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白。在其他治疗剂以第一剂量形式配制且至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白以第二剂量形式配制的情况下，第一剂量形式和第二剂量形式可配制用于例如相同的施用途径(例如，口服、皮下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、淋巴内或腹膜内施用)或用于不同的施用途径(例如，第一剂量形式可配制用于口服施用且第二剂形可配制成用于皮下、静脉内、动脉内或肌内施用)。这种治疗方案的组合明确考虑在本发明中。如上文所述，施用的至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(和任选的其他治疗剂)的量将取决于施用是局部(例如，肌内)还是全身。在一些实施方案中，对受试者(例如人)施用多于一个剂量的至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一种药物组合物。在一些实施方案中，对受试者(例如，人)施用多于一个剂量的(例如，两个或多个剂量)的任何本文所述的组合物。在一些实施方案中，以至少一个月一次(例如，至少一个月两次、至少一个月三次、至少一个月四次、至少一周一次、至少一周两次、一周三次、每日一次或每日两次)对受试者施用至少一种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或至少一种药物组合物的剂量。例如，可以至少每两个月一个剂量的频率(例如，至少每个月一个剂量、至少每周一个剂量、至少每两周一个剂量或至少每日一个剂量)对受试者施用两个或多个剂量的任何药物组合物或一种或多种重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白。重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物可长期施用至受试者。长期治疗包括任何形式的持续延续的时间段的重复施用，如持续一个或多个月、1个月至1年、1年或多年、多于5年、多于10年、多于15年、多于20年、多于25年、多于30年、多于35年、多于40年、对于45年或更长的重复施用。可替换地或此外，可施用长期治疗。长期治疗可涉及规律施用，例如每日一次或多次、每周一次或多次或每月一次或多次。例如，长期治疗可包括约每两周(例如，约每10-18天)施用(例如，静脉内施用)。适当的剂量可以是最低的有效产生预期治疗效果的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的量。这种有效剂量将一般取决于本文所述的因素。酌情，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物的每日有效剂量可作为在全天中以适当的时间间隔分开施用的2、3、4、5或6或更多个亚剂量进行施用，任选地，以单位剂型施用。可配制重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物用于持续释放(例如，配制在生物可降解聚合物或纳米颗粒中)，且在一些情况中，可直接施用入受试者的肌肉组织、皮下组织或腹膜腔中(分别为肌内、腹膜内或皮下储存施用)。可替换地或此外，持续释放的制剂可系统施用(例如，口服、静脉内、动脉内、腹膜内、淋巴内或皮下施用)。在一些实例中，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白或药物组合物可配制用于口服、腺内、外周腺体、皮下、导管内、肌内、外周肌肉、腹膜内、肌内、动脉内、经皮、淋巴内或静脉内施用。实施例本发明进一步描述于下列实施例中，其并不限制权利要求所述的本发明的保护范围。实施例1.用于产生糖蛋白的重组细胞系的产生实施了实验以建立用于糖蛋白重组产生的细胞系。在这些实验中，初始的血清依赖性CHO细胞系(DXB11)按如下顺序处理：在包含5％胎牛血清的组织培养基中生长3天、在包含2.5％胎牛血清的组织培养基中生长3天并在不包含胎牛血清的组织培养基中生长8天。在此培养结束时，稀释获得的CHO细胞培养物并分装以生成无血清的亚群或集合(pool)的悬浮培养物。扩大和评估生长后，分装无血清的集合以生成单细胞克隆培养物。检验每个单细胞克隆在无血清培养基中的细胞生长，且随后检测编码在仓鼠β-肌动蛋白启动子控制下的红色荧光蛋白(RFP)的表达载体通过电穿孔的转染效率，其中在转染后第2天通过流式细胞术分析RFP的表达。用编码在仓鼠β-肌动蛋白启动子控制下的感兴趣的基因和编码在SV40启动子控制下的DHFR基因的表达载体稳定转染后，评估满足倍增时间(<35小时)和转染效率(>30％RFP阳性，具有>75％培养活力)标准的克隆的重组蛋白表达。转染后，使用氨甲喋呤(MTX)选择稳定转染的集合且选择后，通过将细胞接种于未补料的批次培养物并分析澄清的培养基收获物的重组蛋白水平评估集合的重组蛋白生产率。基于稳定转染的集合的MTX选择生存和重组蛋白产生水平，鉴别了领先的无血清亲代克隆。将领先的亲代克隆进行亚克隆并进一步在无蛋白、无动物衍生成分(ADC)和化学限定的培养基(来自Invitrogen的CDDG44培养基)中培养，并将亚克隆做成库。从单细胞亚克隆步骤至初始冷冻细胞库经历了在无ADC的培养基中约27个细胞世代。对单细胞克隆进行下列检验：转染效率(通过用上文所述的编码RFP的载体电穿孔)、细胞生长特性(在来自Invitrogen的CDDG44培养基中)和产生重组蛋白的稳定转化。稳定转染的集合(使用来自Invitrogen的CDCHO培养基)的评估包括MTX选择的评估、峰细胞密度、生长特性和体积生产率(VPR)的评估。如上文所述检验重组蛋白生产率。全部上述培养步骤后，鉴别具有稳定转染集合的最佳转染效率和最佳MTX选择、峰细胞密度、细胞生长特性和体积生产率(VPR)的单克隆亲代细胞系。增殖该亲代细胞系并等分冷冻用于未来的实验中使用。实施例2.重组人α-半乳糖苷酶-A的产生产生(和分泌)重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的细胞的小瓶融化于在摇瓶中的化学限定和无动物衍生成分(ADC)的细胞培养基中。增殖混合物直至获得足够接种灌注生物反应器的细胞量。允许培养物生长直至获得目标高活细胞密度，在该点起始细胞密度控制。在灌注生物反应器中，在接种后一天起始连续灌注，随后在目标高细胞密度增量斜升至固定灌注率。使用整合连续捕获层析系统将澄清的收获流体(包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)直接装载至捕获柱上。捕获的洗脱物(包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)随后进一步通过阴离子交换层析树脂(ANX)纯化以去除DNA、宿主蛋白和其他杂质。ANX洗脱物(包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)进一步通过固定的金属亲和层析树脂纯化。金属亲和层析洗脱物(包含重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白)浓缩至目标重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白浓度，随后使用切向流过滤膜缓冲交换入药物物质缓冲液。随后对重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白药物物质进行分析表征(如实施例中所述)。在用于动物PK/PD研究(实施例5)的制备中，重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白药物物质随后通过添加甘露糖配制并随后通过0.22cm2绝对过滤器过滤。实施例3.重组人α-半乳糖苷酶-A的物理表征对实施例2中产生和纯化的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白使用多种生物物理技术进行了物理表征，并与和比较。每种研究的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白的结构和功能特征在下文中与用于确定每种结构和功能特征的方法一起进行了讨论。分子大小和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的分子大小使用尺寸排阻层析、MALDI-TOFMS和凝胶电泳进行了评估。SEC尺寸排阻层析(SEC)分析用使用TSK-GelG3000SWXL柱(Tosoh,7.8mmx30cm)的Agilent1200HPLC实施。注射50μL的样品并以0.5mL/分钟的流速实施柱层析。洗脱的蛋白在280nm检测。MALDI-TOFMS首先通过在0.1％含水甲酸中稀释样品(1:5)实施MALDI-TOFMS。在0.1％含水甲酸中将BSA稀释至2mg/mL。稀释的样品一式三份与含水0.1％TFA、50％乙腈中的饱和芥子酸以1μL/1μL的比率点样在不锈钢MALDI靶上。从不同的位点的每个点并用变化的激光密度生成十个谱，随后平均化。仪器设置列于表1。将谱校准至BSA的单和双电荷m/z峰。在200的峰分辨率，使用缺省的平滑处理以常规方式对原始数据进行平滑处理。平均化来自三次测量的峰值，并确定标准偏差。表1.FabrazymeMALDI-MS分析的仪器参数SDS-PAGE将10μg的每种样品装载至具有二硫苏糖醇(DTT)的样品装载缓冲剂中的4-20％Tris甘氨酸凝胶上(Invitrogen)。将150的电压应用至凝胶1小时25分钟。完成时，用考马斯R-250染色溶液对凝胶进行染色30分钟。使用脱色溶液去除过度染色30分钟。结果尺寸排阻色谱(SEC)分析显示相比洗脱更早且具有尾部肩(图6)。这些结果表明是异质性的且相比可具有较高的分子量。图7A-7B中的MALDI-TOFMS谱显示在和中观察到的主要种类的m/z比率是可比较的。还包含中未观察到的重组人α-半乳糖苷酶-A的较低分子量种类。图8中的MALDI-TOFMS谱显示和FZ2G中观察到的主要种类的m/z比率是可比较的。包含FZ2GMALDI-TOFMS谱中未观察到的较低分子量的种类。和的SDS-PAGE移动性是可比较的。在而非中观察到具有较高移动性(较低表观分子量)的次要种类(图9)。糖基化概貌如在Kamoda等人，J.ChromatographyA1133:332-339,2006)中的一般性描述，使用2-邻氨基苯甲酸(AA)-衍生化和具有荧光检测的正常的液相层析确定了和FZ2G的N-连接糖基化概貌。位点特异性聚糖分析使用与液相层析系统(nanoAcquityLC,Waters)偶联的混合线性离子阱-轨道阱质谱仪(LTQ-Orbitrap,ThermoFisherScientific)实施了对和FZ2G的位点特异性糖基化分析。在这些方法中，酶促消化物通过如下制备：首先用二硫苏糖醇还原100μg的蛋白，随后用碘乙酸烷化。随后使用Biospin30柱(Bio-Rad)将样品交换入Tris-Cl,pH8.0，其后用内蛋白酶Lys-C消化18小时并用胰蛋白酶消化2小时。甲酸稀释后淬灭消化，将200ng的每种样品消化物注射至75μmx10cmC-18柱(Picofrit,NewObjectives)上。在0.1％甲酸中的2-95％步进梯度的乙腈中洗脱肽。通过FTMS以60,000的分辨率用前5位强度数据依赖CID扫描从325-1800扫描m/z范围。整合MS数据并使用RefinerMSV7.6软件(Genedata)处理用于量化，且收集CID谱用于糖型组分的确认。结果图10显示典型的AA-衍生化的N-连接寡糖色谱图，其显示每个峰中存在的N-连接寡糖的特定类型。AA-标记的聚糖概貌中观察到的聚糖种类的身份通过LCMS分析确定。显示和中不同类型的AA-衍生化的N-连接寡糖的洗脱的色谱图示于图11中。对于和对应于每种N-连接寡糖类型的在总N-连接寡糖中的百分比示于图12。在和的Asn108、Asn161和Asn184处观察到的每种聚糖种类的相对百分比分别示于图13、14和15。和FZ2G的Asn108、Asn161和Asn184处观察到的每种聚糖种类的相对百分比分别示于图16和17、18和19。和FZ2G的AA-标记的概貌示于图20。对应和FZ2G中电中性寡糖(峰1)、包含单唾液酸化岩藻糖的寡糖(峰2)和单唾液酸化的寡糖(峰3)在总N-连接寡糖中的百分比示于图21A-C。对应和FZ2G中包含双唾液酸化岩藻糖的寡糖(峰4)、双唾液酸化寡糖(峰5)和1型三触角、三唾液酸化寡糖(峰6)在总N-连接寡糖中的百分比示于图22A-C。对应和FZ2G中2型三触角、三唾液酸化寡糖(峰6’)、甘露糖-6-磷酸寡糖(峰7)和单磷酸化寡糖(峰8)在总N-连接寡糖中的百分比示于图23A-C。对应和FZ2G中四唾液酸化寡糖(峰9)、单唾液酸化或单磷酸化寡糖(峰10)和双-甘露糖-6-磷酸寡糖(峰11)在总N-连接寡糖中的百分比示于图24A-C。这些数据揭示了本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有与相比实质上不同的糖基化模式。例如，本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有：少于的百分比的总N-连接寡糖为电中性寡糖(峰1)；少于的百分比的总N-连接寡糖为包含单唾液酸化的岩藻糖的寡糖(峰2)；与大约相同或较少的百分比的总N-连接寡糖为甘露糖-6-磷酸寡糖(峰7)；大于的百分比的总N-连接寡糖为单磷酸化寡糖(峰8)；大于的百分比的总N-连接寡糖为四唾液酸化的寡糖(峰9)；大于的百分比的总N-连接寡糖为单唾液酸化和单磷酸化寡糖(峰10)；和大于的百分比的总N-连接寡糖为双-甘露糖-6-磷酸寡糖(峰11)。本文所述的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的改变的糖基化模式(例如，相比)提供了数种优势，例如下列一种或多种优势：重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白对肝的非特异性靶向减少(通过将所述重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白施用至受试者例如人受试者后与表达在肝细胞表面上的脱唾液酸糖蛋白受体减少的结合)、增加的通过在其表面表达甘露糖-6-磷酸受体蛋白的哺乳动物细胞(例如，人细胞)进行的重组人α-半乳糖苷酶蛋白的内吞率、增加的与甘露糖-6-磷酸受体蛋白亲和力和增加的血清半衰期，如与相比。甘露糖-6-磷酸和N-乙酰神经氨酸比蛋白的比率实施另外一组实验以确定本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)和中的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比率和N-乙酰神经氨酸比蛋白的摩尔比率。数据显示相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有与大约相同的甘露糖-6-磷酸比蛋白的摩尔比率和升高的N-乙酰神经氨酸比蛋白的摩尔比率(图25A-B)。等电点使用成像的毛细管等电聚焦(icIEF)评估每个检验的蛋白的电荷。和的电泳图示于图31。对本文提供的重组α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)和确定了电泳图中低、中和高pI范围的相对百分比，并示于图32A-C。反相色谱法在另一组实验中，使用反相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析了和将样品注射至YMCOctyl柱(Waters,2.0x100mm)并使用线性TFA/乙腈梯度以0.25mL/分钟的流速洗脱。在215nm检测洗脱的蛋白。使用Agilent1200HPLC实施分析。数据显示在比早的时间点从RP-HPLC柱洗脱(图35)。实施例4.重组人α-半乳糖苷酶-A的功能性表征阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体-结合活性实施一组Biacore实验以检验本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白、和与阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)结合的能力。和的Biacore传感图示于图26。来自和的这些传感图的结合曲线示于图27。总结本文提供的重组α-半乳糖苷酶-A蛋白和的CIMPR-结合活性的图示于图28。这些数据的比较显示，相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有增加的CIMPR-结合活性。本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)、和与甘露糖-6-磷酸受体结合的能力还使用亲和柱层析进行了检验。用甘露糖-6-磷酸步进洗脱甘露糖-6-磷酸受体柱且每个洗脱级分中洗脱自柱的总装载的重组蛋白的百分比示于图29和30。数据表明相比和本文提供的重组α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有较低相对百分比的未结合和较高百分比的高亲和种类。Km和Vmax还确定了本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)和的Km和Vmax。数据显示，相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有减少或大约相同的Km(图33)且相比其具有大约相同或略减少的Vmax(图34)。综上，本文提供的数据显示，相比本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)具有改变的糖基化模式和改进的甘露糖-6-磷酸受体-结合活性。实施例5.动物研究实施了两种动物模型研究以评估本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白对GL-3清除和药代动力学参数的影响。实施了第一研究以探究在法布里小鼠中以0.1mg/kg和1mg/kg单次静脉内(IV)施用后重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(相比)对组织GL-3清除的影响。在该研究中，将90只法布里小鼠(46M/44F)分成5组(参见下文表2)。对组1中的动物(n＝10，6M/4F)施用媒剂的单次IV施用。对组2和组3中的动物(n＝20每组，10M/10F)分别以0.1mg/kg和1.0mg/kg施用的单次IV施用。对组4和组5中的动物(n＝20每组，10M/10F)分别以0.1mg/kg和1.0mg/kg施用本文提供的人重组α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的单次IV施用。组6中的野生型动物(n＝1M)未做处理且作为用于GL-3校准的对照。给药后3天(组2-5，n＝10，5M/5F每组)和给药后14天(组1和组2-5，n＝10,5M/5F每组)将动物安乐死。在下列组织上实施GL-3分析：心脏和肾(组1、3和5)及脾和肝(组1、2和4)。表2.GL-3清除研究设计下文表3提供了在该实施例中描述的动物研究中施用至法布里小鼠的本文提供的重组α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的一些功能和结构特征的总结。数据显示，单次剂量的或单次剂量的本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)静脉内施用后，在法布里病小鼠模型中的肝、脾、心脏和肾中GL-3的积累实现了相似的减少(分别参见图36、37、38和39)。综上，数据显示单次剂量静脉内施用或单次剂量静脉内施用本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)后，法布里病小鼠模型中GL-3的清除不存在统计学显著差异。表3.动物研究中使用的FZ2G的物理和结构特征的亚集实施了第二个研究以表征和比较单次1mg/kg(IV)施用后，法布里小鼠中和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的药代动力学参数。在该研究中，将20只法布里小鼠(12M/8F)分成2组(参见下文表4)。对组1和组2中的动物(n＝10每组，6M/4F)分别以1.0mg/kg施用和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的单次IV施用。在给药后2、15、30、60、120、240和480分钟收集血液样品用于在干血点上进行酶分析。使用Phoenix(PharsightCorporation,MountainView,CA)实施药代动力学分析。表4.药代动力学研究设计数据显示在分析的时间点，和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的药代动力学相似(图40)。由于样品作为干血点收集，未在每个时间点计算酶活性和浓度。总之，数据显示，在分析的时间点施用和本文提供的重组人α-半乳糖苷酶-A蛋白(FZ2G)的单次静脉内施用后酶之间的酶活性相似。其他实施方案应该理解的是，本发明结合其详细的说明书进行了描述，前述说明书意在阐述而并非限制本发明的保护范围，其通过附加的权利要求进行限定。其他方法、优势和修饰在下列权利要求的保护范围内。