技术领域本发明属于生物医药领域，具体涉及一种聚乙二醇(PEG)修饰的Exendin类似物及其制备方法及其在药物制备中的应用。
背景技术：
胰高血糖素肽-1(以下称为GLP-1)的功能主要是诱导体内各种生物学效应，包括刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，促进饱腹感，抑制胃肠的蠕动，增加葡萄糖的摄取并减轻体重。有报道称GLP-1能有效预防II型糖尿病的发展引起的胰腺细胞病变，在非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中，GLP-1能够促进新生细胞的生长，恢复胰岛素的分泌。GLP-1具有促进胰岛素的分泌却不降低血糖方面的显著地特性。此外，GLP-1的注射不会引起任何毒副作用。因此GLP-1在治疗II型糖尿病方面是非常有用的。然而，GLP-1的广泛应用却存在一个瓶颈问题，即GLP-1体内半衰期短。详细的说，GLP-1是一种内源性二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的底物，DPP-IV通过移除GLP-1N-末端组氨酸-丙氨酸的二肽部分(氨基酸7和8)使GLP-1失活，使得GLP-1生物周期短。目前有许多方法可以减少GLP-1的降解或者延长GLP-1在血浆中的寿命，同时保持其生物活性，这些方法包括使用DPP-IV抑制剂(，使用GLP-1受体和GLP-1衍生物反应的配体，如Exendin。Exendin是JohnEng(美国专利号：5.424.286)从南美产毒蜥的唾液分泌物中分离和鉴定出的天然产物，它属于多肽类分子，能够降低血液葡萄糖含量。Exendin-4与GLP-1(7-36)-NH2具有高度同源性，其序列如下：H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2在体内试验中，发现Exendin-4的半衰期大大高于GLP-1，为2到4小时，每天腹部注射2到3次，Exendin-4在血液中即可达到足够的含量。此外，由于Exendin-4能够调节胃肠蠕动，减少摄取食物并且抑制血液中胰高血糖素(美国专利号：6858576,6956026，6872700)。Exendin-4于2005年4月获美国FDA批准，用于改善使用二曱双胍和磺酰脲类药物作用不理想的II型糖尿病患者的血糖控制。临床结果显示，Exendin-4用于糖尿病治疗效果明显，且副反应较小，但是每天两次的皮下给药给病人带来很多不便。由于Exendin-4在II型糖尿病治疗机理方面具有明显优势，开发其长效类似物是很多国外制药公司研发热点之一。聚乙二醇(PEG)，基本结构为HO-(-CH2CH2O-)n-H，具有很强的亲水性，通过PEG修饰的多肽或蛋白类药物具有溶解性好，免疫原性低，血液中保留时间长的有点。另外PEG与药用的多肽分子适当结合，可以增加其分子量，保护其免受肾小球滤过，避免被蛋白酶水解。当PEG分子量为1000或更高时，PEG呈现低非常低的毒性。当其分子量在1000到6000之间时，PEG能够分布全身并通过肾脏代谢。当PEG分子量在1000到100000范围内时，PEG可以正确的偶联到多肽上。当PEG具有约40000分子量时，它可以在血液，肝脏中分布并在肝脏中进行代谢。虽然PEG具有这些优点，但是PEG的共价修饰可能会影像蛋白质构想从而改变蛋白的生物功能。例如，如果PEG与氨基酸残基的随机结合，那么可能会导致多种PEG-蛋白复合物，则需要复杂工序分离纯化混合物中所需要的化合物；另外，PEG通过共价键与蛋白质上的赖氨酸残基偶联，如果此赖氨酸的残基负责蛋白质的活性，那么PEG偶联的蛋白质就不能表现出原有的生物功能，甚至活性降低乃至丧失。目前已经有多种尝试将PEG修饰Exendin-4多肽，从而开发出长效稳定的糖尿病治疗药物。目前常用的Exendin-4多肽的PEG修饰多为利用Exendin-4序列中的赖氨酸实现修饰。例如美国专利NO.6924264中阐述，使用分子量从5000到12000道尔顿的PEG的分子通过与赖氨酸的ε-氨基通过共价键结合而形成的Exendin-4类似物与未经修饰的Exendin-4相比，具有更长的半衰期，同时保留了原有的生物活性。但是，由于序列中的赖氨酸在Exendi-4与其受体结合时，需要发挥一定作用，通过此类方法定点或随机的修饰Exendin-4分子在与其受体结合时，由于PEG的存在导致Exendin-4与受体结合力减弱，进而明显的降低Exendin-4的生物活性。另外，采用随机标记法，所得到的产物复合物在分离纯化上则受到很大挑战，增加了生产制备成本。以上两点严重限制了Exendin-4在临床上的进一步应用。
技术实现要素：
本发明所要解决的一个技术问题是克服目前对Exendin-4进行修饰例如PEG化修饰时专一性差的缺点，提供一种对Exendin-4多肽及其衍生物进行定点聚乙二醇(PEG)化修饰后的产物，并仍然能保持Exendin-4生物学活性同时延长其半衰期。为此，本申请发明人通过深入的研究，明确Exendin-4与其细胞中受体的结合作用，对exindin-4多肽1-39位的氨基酸位点进行了结构化改造，包括但不限于常规的氨基酸的替代，氨基酸位点直接的置换及化学的修饰等，并在其氨基酸序列的末端增加一个半胱氨酸，经改造后的多肽命名为CysEX4，所获得的Exendin类似物基本保留Exendin-4的天然生物活性。并依此为理论根据设计了新的PEG修饰方法，由于在Exendin类似物的C末端定点引入半胱氨酸从而可进行定点PEG修饰，此Exendin类似物-PEG复合物不会影响Exendin类似物与其受体的结合能力，继而在保留Exendin-4的天然生物活性的同时延长了Exendin-4或其类似物在体内的存留时间。此Exendin类似物-PEG具有良好的药代动力学和药理效应，和天然Exendin-4相比，这种复合物在治疗糖尿病中减少了注射剂量和注射次数。一方面，本发明提供了聚乙二醇修饰的exendin-4衍生物，其结构式为：mPEG-L-S-CysEX4(I)其中，mPEG为直链或具有支链结构的聚乙二醇，其结构式表示为RO(CH2CH2O)n-CH2CH2-，n为25-2500的整数，R是氢、直链或支链的C1-C20烷基、环烷基、烯基或芳基；L表示连接基团，选自如下的基团结构：-S-、碘代乙酰基、吡啶基二硫酚等S为硫原子；CysEX4表示exendin-4类似物，所述的CysEX4具有如下所示的序列：His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Glu-Glu-Ala-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Ile-Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys；其中：第2位的Xaa是Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile或Lys；第10位的Xaa是Leu，Ala，Ser，Ile，Thr,Glu，或Lys；第12位的Xaa是Lys，Leu，Thr，Ser，Gly，或Ile；第13位的Xaa是Gln，Thr，Ala，Val，Leu，Ile或Lys；第14位的Xaa是Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，Ile或Lys；第19位的Xaa是Val，Ala,Ser,Leu,Ile或Lys；第20位的Xaa是Arg,Thr,Tyr,Ser,Leu,Ile或Lys；第21位的Xaa是Leu,Thr,Ala,Asp,Glu,His或Lys；第24位的Xaa是Glu,Leu,Thr,Ala,Ser,Lys或Ile；第27位的Xaa是Lys,Ala,Ser,Leu,Thr,Ile或Arg；第28位的Xaa是Asn,Thr,Ala,Ser,Leu,Ile或Lys；第30位的Xaa是Gly,Thr,Ala,Ser,Leu,Ile或Arg；第31位的Xaa是Pro,Val,Ser,Ala,Leu,Ile或Lys；第32位的Xaa是Ser,Thr,Glu,Ser,Asp,Lys或Ile；第33位的Xaa是Ser,Thr,Ala,Met,Leu,Ile或Lys；第34位的Xaa是Gly,Thr,Met,Ser,Ile,Leu或Lys；第35位的Xaa是Ala,Thr,Ala,Glu,Leu,Ile或Phe；第36位的Xaa是Pro,Ala,Thr,Ser,Leu,或Ile；第37位的Xaa是Pro,Thr,Ser,Ala,His,Lys或Ile；第38位的Xaa是Pro,Thr,Val,Ser,Leu,Lys或Ile；L-S-CysEX4表示所述的exendin-4类似物通过第40位Cys巯基上的硫原子与L相连接。优选的，CysEX4多肽选自如下序列的多肽：SeqIDNo.1:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.2:His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Thr-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.3:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Ile-Arg-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Leu-Pro-Lys-Ser-Cys；SeqIDNo.4:His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ile-Gln-Ala-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Tyr-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Thr-Gly-Leu-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-His-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.5:His-Ile-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Lys-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Thr-Asn-Gly-Arg-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Pro-Pro-Val-Ser-Cys；SeqIDNo.6:His-Lys-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Ala-Ser-Lys-Gln-Tyr-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ile-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.7:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Glu-Ser-Lys-Thr-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Lys-Ser-Gly-Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Phe-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.8:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Met-Gly-Ala-Leu-Thr-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.9:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Lys-Thr-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ser-Ile-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.10:His-Leu-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Thr-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Ala-Asn-Gly-Gly-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ile-Ser-Cys；SeqIDNo.11:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Ser-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Lys-Tyr-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Thr-Ile-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；SeqIDNo.12:His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Glu-Ser-Leu-Val-Tyr-Glu-Glu-Glu-Ala-Ala-Lys-His-Phe-Ile-Thr-Trp-Leu-Ser-Ala-Gly-Leu-Ile-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；CysEX4可以通过化学合成获得。CysEX4多肽的化学合同可通过本领域公知的标准多肽固相合成技术合成，可以采用叔丁氧羰基(Boc)和芴甲氧羰基(Fmoc)两种N端保护策略。例如采用Fmoc策略时，可按照树脂固相合成的方法依次连接相应氨基酸，期间依次脱去Fmoc-保护基团，然后切肽，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，即可制得CysEX4多肽。CysEX4多肽也可通过基因工程重组表达的方式获得。根据设计好的CysEX4多肽序列，可以确定该多肽序列的基因序列，然后用本领域公知的方法将含编码CysEX4多肽序列的核酸克隆到各种表达载体中去，在原核或真核细胞中重组表达，经纯化后即可得到CysEX4多肽，所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)的叙述。重组表达时，原核表达载体可包括例如质粒如pRSET、pET和pBAD等，其中可采用的启动子有例如lac、trc、trp、recA或araBAD等。用于在酵母中表达的真核表达载体如pAO，pPIC，pYES，pMET等，其中可使用诸如AOX1，GAP，GAL1，AUG1等的启动子。用于在哺乳动物细胞中表达的载体如pSVL，pCMV，pRc/RSV，pcDNA3，pBPV等，其中可使用诸如CMV，SV40，EF-1，UbC，RSV，ADV，BPV和β肌动蛋白等的启动子。在一个优选的实施方案中，所述Exendin类似物在大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞体系中进行表达，并且使用经过密码子优化的编码序列。CysEX4多肽由于氨基酸序列中只存在一个游离的Cys，因此，带有巯基反应基团的聚乙二醇反应试剂可以和CysEX4多肽中的巯基基团特异性的结合,获得聚乙二醇定点单修饰的产物。所述的聚乙二醇反应试剂包括甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，甲氧基聚乙二醇乙烯磺酸，甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺，甲氧基聚乙二醇邻氮苯基二硫化物、甲氧基聚乙二醇吡啶基二硫酚等各种类型，但其类型并不限于此。优选的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。所述的聚乙二醇分子量范围为1-100kDa，优选范围为2-60KDa，更优选的范围为20-40KDa。聚乙二醇可以是线性的、分枝的、分叉的或者由多个臂组成，不同的聚乙二醇可以具有不同的聚合链长度和聚合结构。合适的分支PEG可按照美国专利No.5,932,462中所述进行制备，该专利的全部公开内容通过参考并入本文。所述分叉PEG是指在靠近聚合物链一端的地方具有分支的PEG，分叉PEG的主链可以是直链或支链的。本发明中的聚乙二醇是所属领域中已知的，其可通过多种途径得到，包括例如通过商业途径获得，如NektarInc.,CarboMerInc.，TheDowChemicalCompany等等，或者根据本领域中已知的方法自行制备。本发明还提供了一种制备聚乙二醇修饰CysEX4多肽的方法，其包括如下步骤：(1)在反应溶剂中，带有巯基反应基团的聚乙二醇分子与CysEX4多肽中的游离Cys反应；(2)任选地从反应混合物中分离聚乙二醇单修饰的CysEX4多肽产物。在一个实施方案中，在步骤(1)的PEG与CysEX4多肽偶联反应中，进一步可使用还原剂，还原剂包括NaCNBH3或三乙胺，但并不限于此。反应过程中，所用反应溶剂没有特别的限制，通常是本领域中经常使用的缓冲液，所选择的缓冲液要与聚乙二醇的反应条件相匹配。优选的缓冲液可选择乙酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液或有机溶剂(优选DMSO)等，优选磷酸盐缓冲液。所述的聚乙二醇反应试剂包括甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺，甲氧基聚乙二醇乙烯磺酸，甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺，甲氧基聚乙二醇邻氮苯基二硫化物、甲氧基聚乙二醇吡啶基二硫酚等各种类型，但其类型并不限于此。优选的聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。所述的聚乙二醇分子分子量范围为1-100kDa，优选范围为2-60KDa，更优选的范围为20-40KDa。聚乙二醇为直链状或者分支状，优选的PEG结构中含有两个或更多的支链，最好的PEG具有三个支链。反应过程中，CysEX4多肽和聚乙二醇及其衍生物反应的摩尔比范围为1:1-4，优选为1:1-2。摩尔比的选择取决于各种因素，包括PEG及其衍生物的分子结构、分子量、PH、反应温度和反应时间等。例如，每摩尔的CysEX4多肽需要使用1到2摩尔的甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。在本发明中，未反应的物质可以通过典型的透析方法来去除，例如在适当的缓冲液中透析，如可以使用乙酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，硼酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。在本发明中，反应体系可以使用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析、反向高效液相色谱或其组合进行分离和提纯。PEG修饰Exendin-4衍生物作为药物活性成分，可以制备成各种口服或注射剂量类型。制备为注射剂型是，所述的药物组合物包含治疗有效量的聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物、能够维持制剂在水溶液状态下pH值为3.0-7.0的缓冲液和其他药学上可接受的稳定性辅料。缓冲液可任选自磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、巴比妥钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，浓度为5-100mmol/L，优选10-30mmol/L，最优选20mmol/L；缓冲液的pH范围在3.0-7.0，优选4.0-6.0。稳定性的辅料可选用甲硫氨酸、葡萄糖、蔗糖、甘露醇或甘氨酸的一种或几种，辅料浓度(重量/溶液体积，w/v)为1％-6％，优选为2％-4％。根据需要，还可将上述的药物制剂制备为冻干粉针，冻干前的液体制剂基本上为等张和或等渗的，因此冻干后加入适量的注射用水能够还原形成等张或等渗溶液。口服的试剂包括片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂和胶囊剂。这些固体形式通常配制至少需要一种辅料成分，如，如淀粉，碳酸钙，蔗糖，乳糖，或明胶。除了辅料成分之外，还有润滑剂，例如使用硬脂酸镁或滑石。液体形式的口服剂，包括悬浮液，体内使用的液体，乳剂，和糖浆剂。这些剂型可包括湿润剂，甜味剂，风味剂和/或防腐剂，亦或简单的稀释剂，如液体或液体石蜡。注射的制剂包括无菌水溶液，非水溶剂，悬浮剂，乳剂，冻干剂，和栓剂。非水溶剂或悬浮液，包括丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄榄油，以及可注射的酯，如油酸乙酯。以exendin-4序列为基础所衍生的作为GLP-1受体结合的CysEX4多肽衍生物均可以通过本发明中所述方法定点修饰PEG分子。经过PEG分子修饰的CysEX4多肽衍生物在保持原有Exendin-4生物活性的基础上，具备了更长的体内半衰期。此外，限制修饰位置和PEG及其衍生物的数量可以减少各种因素引起的副作用。本发明的另一方面还提供了所述的聚乙二醇修饰的Exendin-4衍生物用于治疗GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的应用。这些聚乙二醇修饰的Exendin-4或Exendin-4衍生物的应用包括：利用聚乙二醇修饰的CysEX4多肽其衍生物对GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的影像学诊断以及疗效监测；利用聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物对GLP-1/GLP-1受体通路相关疾病的治疗。聚乙二醇修饰的CysEX4多肽及其衍生物，通过引起胰岛素的过量分泌在疾病的预防和治疗中起作用，例如糖尿病和肥胖，并导致降低血浆葡萄糖含量，抑制胃肠蠕动，促进饱腹感，或抑制食物的摄取，如过敏性结肠综合征。发明人还意外发现，聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物，能够通过GLP-1受体而激活cAMP和磷脂酸肌醇-3激酶，从而治疗心肌缺血性损伤。另外，GLP-1能够活化抗氧化酶而减轻心肌缺血所引起的纤维化，并促进左心室的功能恢复。发明人意外发现，接受聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物注射治疗的动物组在心肌梗死后血管新生情况得到显著改善，心肌缺血组仅发生较弱的间质纤维化，心肌细胞未见明显肥大；而未经修饰的Exendin-4和生理盐水注射组未能表现出明显的血管新生能力提高或明显的对间质纤维化情况的改善，心肌细胞肥大现象较为明显。这显示聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物可应用治疗治疗心肌缺血性损伤，这一发现在现有技术文献中从未报道。因而，本发明的另一个实施方案中，还涉及聚乙二醇修饰的CysEX4多肽或其衍生物在制备治疗心肌缺血性损伤的药物中的应用。本发明所述的PEG修饰Exendin-4衍生物剂量取决于各种因素，包括体重，年龄，性别，身体状况，饮食，给药时间，给药途径，代谢率和疾病的严重程度。一般来说，一到两个星期时间内通过不同的给药途径观察药物被完全吸收的有效剂量，在每日有效剂量范围内，本发明的复合物可能一次给药，或每日多次给药。附图说明图1：高效液相色谱法分析修饰后的Exendin-4衍生物纯度。图2：体外细胞水平上比较不同修饰方法的Exendin-4衍生物与受体的结合。与未经修饰的Exendin-4相比，经过修饰的Exendin-4衍生物与受体的结合力未受较大影响。图3：不同Exendin-4衍生物的药代动力学分析。与未经修饰的Exendin-4相比较，经过修饰的Exendin-4衍生物在血液内半衰期得到明显延长。未经过修饰的Exendin-4半衰期为6.8小时，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物半衰期为41.2小时。图4：不同Exendin-4衍生物的药效动力学分析。与未经过修饰的Eendin-4相比较，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物注射小鼠体内血糖浓度明显下降并恢复缓慢。图5：心肌梗死小鼠模型经过Exendin-4治疗后的生存曲线。与未经过修饰的Exendin-4相比，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物明显延长了心肌梗死小鼠的存活时间。图6：免疫荧光染色分析心肌梗死病变部位的血管分布。与未经治疗和经过未修饰Exendin-4治疗的组织相比，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物治疗组的心肌梗死病变部分新生血管更加丰富，表现了较好的恢复。图7：马松染色验证心肌梗死小鼠模型中经过不同Exendin-4衍生物对心肌病变部位的治疗作用。与未经治疗和经未修饰的Exendin-4相比，经过PEG修饰Exendin-4衍生物治疗的心肌病变部位中胶原明显减少。图8：H&E染色分析远端心肌缺血的横截面积。与未经治疗和经过未修饰Exendin-4相比，PEG修饰的Exendin-4衍生物对远端心肌缺血区表现出了很好的治疗效果。具体实施方式：下列实施例更详细地说明本发明，但是并不是要将本发明限定为实施例。实施例1.制备直链聚乙二醇修饰的Ex4-Cys(C40-PEG-Ex4-Cys)利用标准的多肽固相合成技术合成具有如下序列的多肽(Ex4-Cys)：His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys；(SeqIDNo.1)带有马来氨酸基团的3，5，10，20和50kDa聚乙二醇(Nektar,mPEG-pro-pionaldehyde,mPEG-ALD,2kDa,0.95mg/mlin50mM的醋酸钠，pH5.5)中加入分别0.5mLExendin-4(1毫克/毫升在50mM醋酸钠，pH值5.5)，然后加入20mMNaC-NBH3作为还原剂。mPEG-ALD与Ex4-Cys的摩尔比为1:1-2。mPEG-ALD和Ex4-Cys在避光条件下，4℃，反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，得到PEG修饰的Ex4-Cys，命名为C40-PEG-Ex4-Cys。实施例2.制备支链聚乙二醇修饰的EX4-Cys(C40-tPEG-Ex4-Cys)带有马来氨酸基团的25kDa和50kDa支链聚乙二醇(Nektar,mPEG-pro-pionaldehyde,mPEG-ALD,2kDa,0.95mg/mlin50mM的醋酸钠，pH5.5)中加入分别0.5mLEx4-Cys(1毫克/毫升在50mM醋酸钠，pH值5.5)，然后加入20mMNaC-NBH3作为还原剂。mPEG-ALD与Ex4-Cys的摩尔比为1:1-2。mPEG-ALD和Ex4-Cys在避光条件下，4℃，反应2小时。用0.1％的含水三氟乙酸(TFA)终止反应，得到不同分子量的支链PEG修饰Ex4-Cys，命名为C40-tPEG-Ex4-Cys。纯化后的C40-tPEG-Ex4-Cys如图1所示，其保留时间为18.5分钟。实施例3.PEG修饰对Ex4-Cys的生理活性影像影响分析为了检测Exendin-4，不同分子量PEG修饰的Ex4-Cys与GLP-1受体反应，将密度为2.5×105的胰岛素分泌细胞INS-1接种到12孔板上，每孔105个细胞，然后培养2天，使其稳定地附着在培养板底部。细胞贴壁后，用标记有125I-Exendin-4(从氨基酸残基9和氨基酸残基39中延伸的Exendin-4衍生物)的缓冲液替换细胞培养液，加入一定量的缓冲液形成30μM的最终浓度。此后，加入一定量的天然Exendin-4和不同分子量PEG修饰的Ex4-Cys，形成0.001-1000nM的最终浓度，在室温下培养2小时使其能够与受体竞争性结合。冷PBS清洗细胞3次，去除未结合的125I-Exendin-4。最终用缓冲液裂解细胞，使用γ计数器测定细胞结合Exendin-4的水平。如图2可以看出，随着样本浓度测增高，125I-Exendin-4的竞争性结合能力越低。此外，不同异构体结合受体的强度与修饰的位置有关。天然Exendin-4的IC50为44.82nM，而经分子量为50000的PEG修饰的Exendin-4衍生物(C40-tPEG-Ex4-Cys)为112.0nM，PEG修饰Exendin-4衍生物未对其生理活性有较明显影响。实施例4.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的体内半衰期为了在动物模型中比较不同分子量PEG修饰的Ex4-Cys在体内的半衰期。在雄性SD大鼠中，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及不同分子量PEG修饰的Ex4-Cys以25nmol/kg的剂量分别经皮下注射到大鼠体内，而后在特定时间点取血，血液中Exendin-4及其衍生物的含量由ELISA试剂盒监测定量。如图3所示，未经修饰的Exendin-4在体内半衰期为6.8小时，而分子量为50000的PEG修饰的Ex4-Cys在体内半衰期最长，为41.2天。实施例5.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的降血糖效率在雄性db/db大鼠中(6-7周)，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及不同分子量PEG修饰的Ex4-Cys以25nmol/kg的剂量分别经皮下注射到大鼠体内，而后在特定时间点取血，血糖浓度经由血糖仪测定。如图4所示，C40-tPEG-Ex4-Cys降糖效果最好。与未经过修饰的Eendin-4相比较，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物注射小鼠体内血糖浓度明显下降并恢复缓慢。实施例6.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的心肌保护功能检测为了在动物模型中检测C40-tPEG-Ex4-Cys的心肌保护活性，在雄性C57/BL6小鼠(心肌梗死的小鼠模型)中，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及C40-tPEG-Ex4-Cys以50μg/kg的剂量尾静脉注射到小鼠体内，每3天注射一次，持续30天。记录心肌梗死小鼠生存曲线、分析心梗面积大小分析，免疫组织染色分析，结果如图5所示。与未经过修饰的Exendin-4相比，经过PEG修饰的Exendin-4衍生物明显延长了心肌梗死小鼠的存活时间。实施例7.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的促血管新生功能检测为了在心肌梗死模型中检测C40-tPEG-Ex4-Cys的促血管新生功能，在雄性C57/BL6小鼠(心肌梗死的小鼠模型)中，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及C40-tPEG-Ex4-Cys以50μg/kg的剂量尾静脉注射到小鼠体内，每3天注射一次，持续30天。而后取出心脏做免疫组织染色分析，结果如图6所示。接受C40-tPEG-Ex4-Cys注射治疗的动物组在心肌梗死后血管新生情况得到显著改善，而未经修饰的Exendin-4和生理盐水注射组未能表现出明显的血管新生能力提高。实施例8.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的抑制心肌纤维化功能检测为了在心肌梗死模型中检测C40-tPEG-Ex4-Cys的促血管新生功能，在雄性C57/BL6小鼠(心肌梗死的小鼠模型)中，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及C40-tPEG-Ex4-Cys以50μg/kg的剂量尾静脉注射到小鼠体内，每3天注射一次，持续30天。而后取出心脏做免疫组织染色分析，结果如图7所示。接受C40-tPEG-Ex4-Cys注射治疗的心肌缺血组仅发生较弱的间质纤维化，而未经修饰的Exendin-4和生理盐水注射组未能表现出明显的对间质纤维化情况的改善。实施例9.动物实验中C40-tPEG-Ex4-Cys的抑制远端心肌细胞肥大为了在心肌梗死模型中检测C40-tPEG-Ex4-Cys对心肌重塑过程中的心肌细胞的影响。在雄性C57/BL6小鼠(心肌梗死的小鼠模型)中，分别将生理盐水(对照组)，天然Exendin-4以及C40-tPEG-Ex4-Cys以50μg/kg的剂量尾静脉注射到小鼠体内，每3天注射一次，持续30天。而后取出心脏做免疫组织染色分析，结果如图8所示。接受C40-tPEG-Ex4-Cys注射治疗的心肌细胞未见明显肥大，而未经修饰的Exendin-4和生理盐水注射组中心肌细胞肥大现象较为明显。