一种酚酞分子印迹聚合物材料的制备方法及材料和应用与流程

本发明涉及一种选择性分离净化双酚A及其结构类似物的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料的制备及应用，属于生物及食品分析和新材料领域。

背景技术：

双酚A被公认为是一种内分泌干扰物(endocrine disrupting chemical，EDC)，其对人类的生殖和发育、神经系统、心血管系统、新陈代谢以及免疫系统的危害已经得到广泛证实。鉴于这种情况，美国环境保护局(USEPA)和欧洲食品安全局(EFSA)已经规定了双酚A每日最大摄入剂量的参考值，加拿大卫生部也做了相关工作。欧盟已经对用于食品生产的塑料制品双酚A迁移量做了严格限制。为了应对这些限制和规定，许多制造商开始使用一些双酚A的结构类似物作为替代原料。这些结构类似物有双酚F、双酚S、双酚B、双酚E、双酚AF、双酚AP以及双酚Z等。目前，已经有一些关于双酚A结构类似物具有内分泌干扰效应的报道。有报道称双酚S、双酚B、双酚F具有与双酚A类似的急性毒性，基因毒性以及雌激素效应。有研究表明双酚B和双酚AF能影响孕甾烷X受体的活性，该细胞核受体能直接影响外源性物质的代谢。在最近的一个有关雄性成年鼠的研究中，双酚AF通过影响成鼠睾丸功能进而导致其体内睾酮浓度的降低。因此这些双酚A结构类似物也会对人类健康构成一定潜在威胁。随着这些双酚A结构类似物工业使用量的逐年增加，其在自然界中的排放量也会随之增加，进而加大了人体暴露的风险。因此建立准确可靠的分离分析方法，实现对双酚A及其结构类似物在生物样品和食品样品中存在情况的彻底认知在日常暴露和人体健康评估方面有着极其重要的意义。

由于生物和食品样品成分的复杂性，实现对其所含双酚类污染物的准确分析需要依托一定的分离净化手段。基于分子印迹技术的固相萃取材料就可以实现对复杂基质中目标物质的选择性分离和净化，这就为对复杂生物样品及食品样品的准确分析提供了可靠的基础。分子印迹技术(molecular imprinting technique)是制备对目标化合物具有特定识别能力材料的新技术。根据材料制备和识别过程中模板分子与功能单体间相互作用力的不同，可以将其分为共价法、非共价法和半共价法。其中非共价法的应用最为广泛。

由于具有成本低、易于制备，机械强度和化学稳定性好以及可以重复使用的优点，聚合物被广泛应用于分子印迹材料的制备。但是在制备分子印迹聚合物时需要使用大量的模板分子，并且通常使用目标分析物为模板。 由于索氏提取通常无法实现对模板分子的完全去除，在使用所制备材料的过程中会出现模板泄露的问题，给目标物的分析定量造成严重的干扰。与此同时，如果分析物为有毒污染物，大量使用其做为模板分子会对环境造成严重污染。

鉴于这种情况，采用替代模板制备分子印迹聚合物逐渐受到研究人员的关注。研究人员通常选用的替代模板为与目标物质分子结构相似的同系物。比如有研究人员以双酚S为模板制备了选择性识别双酚F、双酚E、双酚A、双酚B和双酚AF的分子印迹聚合物材料。该研究虽然获得了良好的效果，但由于使用了双酚S为模板分子，自身产生的模板泄露问题使材料无法应用于双酚S的分析。同时双酚S也具有与双酚A类似的急性毒性，基因毒性以及雌激素效应，不宜大量使用。因此选用目标物质同系物以外的低毒或者无毒的物质作为替代模板分子在分子印迹材料制备领域有着重大意义。

酚酞是一种弱有机酸，对人体没有毒害作用，常被用来做为酸碱指示剂。此外由于其具有刺激肠壁，引起肠的蠕动而促进排便的功效，在医药领域被用来制造治疗习惯性顽固便秘的药物。酚酞分子结构中具有两个羟苯基，与双酚类物质结构具有一定的相似性，两个羟苯基之间的键角也与双酚类物质接近，因此可以作为制备对双酚类物质具有选择性识别能力分子印迹材料的理想替代模板。到目前为止没有将酚酞作为替代模板，用于制备对双酚类物质具有选择性识别能力分子印迹聚合物材料的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种对人尿液样品、牛血清样品和啤酒样品中双酚类污染物具有高选择性和良好净化能力的无毒替代模板分子印迹聚合物材料的制备和应用方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

选择性分离净化双酚类污染物的无毒替代模板分子印迹聚合物材料，可按以下步骤制备获得：

将模板分子酚酞(PP)、功能单体、交联剂和引发剂溶解于致孔剂中，进行本体聚合反应，对产物进行索氏提取，干燥后即得到无毒替代模板酚酞分子印迹聚合物材料。

具体步骤为：

(1)将模板分子PP、功能单体、交联剂和引发剂溶解于致孔剂中，形成预聚合溶液；

(2)将预聚合溶液超声脱气，通氮气除氧后密封，冷藏放置模板分子与功能单体充分作用后进行本体聚合反应；

(3)将步骤(2)产物粉碎、研磨、筛分并沉降；

(4)产物以甲醇和冰乙酸混合液为溶剂，索氏提取，产物干燥即得到无毒替代模板酚酞分子印迹聚合物材料。

所述功能单体为4-乙烯基吡啶即4-VP，交联剂为二甲基丙烯酸乙二醇酯即EGDMA，所述引发剂为偶氮二异丁腈即AIBN，所述致孔剂为乙腈；PP：4-VP：EGDMA：AIBN摩尔比为1～2:2～8:10～40:0.00025～0.001；其中EGDMA与乙腈的体积比为1～2:1～4；

步骤(2)中所述超声脱气操作在冰浴中进行，时间为5-15min；所述通氮气时间为5-15min；所述冷藏放置的温度为0-10℃，时间为1-4h；所述本体聚合反应在水浴条件下进行，反应温度为50-70℃，反应时间为12-48h；

步骤(3)中所述筛分操作中，筛分保留粒度为45-63μm；所述沉降操作以丙酮为溶剂，用量为10-40mL；

步骤(4)中所述甲醇和冰乙酸混合液中，甲醇与冰乙酸的体积比为9:1-9，索氏提取使用的温度为80-120℃，提取时间为12-48；所述干燥操作为真空干燥，干燥温度为50-70℃，干燥时间为6-24h。

按照本发明提供的制备方法制备的酚酞分子印迹聚合物材料可以作为吸附剂，应用在选择性分离生物样品或食品样品中的双酚A及其结构类似物双酚B、双酚E、双酚AF、双酚S、双酚AP和双酚Z中的一种或两种以上中。

上述应用中酚酞分子印迹聚合物材料作为固相萃取柱的填料使用；所属生物样品为人尿液样品和牛血清样品，食品样品为啤酒。

所述无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物作为固相萃取柱的填料。

所述无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物用于分离纯化人尿液样品、牛血清样品和啤酒样品中的双酚类污染物。

本发明的优点是：制备的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料使用的模板酚酞无毒、环保，在使用过程中不会对目标物质的分析造成干扰。与此同时，其对双酚A及其结构类似物双酚B、双酚E、双酚AF、双酚S、双酚AP和双酚Z具有很强的类选择性。本发明的分子印迹聚合物材料对复杂基质中双酚类物质具有超高特异选择性，能够有效的减小基质干扰，能够快速、灵敏、准确、高效地对人尿液样品、牛血清样品和啤酒样品进行分析。

附图说明

图1是本发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料(a，PP-MIP)和非印迹聚合物材料(b，NIP)及分别与之对应(c，PP-MIP；d，NIP)的材料微观孔结构的扫描电镜照片。

图2是本发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物(PP-MIP)及与之对应的非印迹聚合物(NIP)对双酚A(BPA)的等温吸附曲线。

图3是本发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物(PP-MIP)及与之对应的非印迹聚合物(NIP)等温吸附数据的斯卡查德模型分析结果。

图4是本发明的PP-MIP对BPA、双酚B(BPB)、双酚E(BPE)、双 酚AF(BPAF)、双酚S(BPS)、双酚AP(BPAP)、双酚Z(BPZ)、17β-雌二醇(E2)和己烯雌酚(DES)的印迹因子评价结果。

具体实施方式

该无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料对BPA及其六种结构类似物具有很强的特异选择性和净化能力。该材料可用于复杂基质中双酚类污染物的分离纯化。

实施例1

选择性分离净化双酚类污染物的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料及与之相对应的非印记材料的制备：

(1)将0.318g(1mmol)模板分子酚酞(PP)、0.42mL(4mmol)功能单体4-乙烯基吡啶(4-VP)、3.8mL(20mmol)交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和40mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶解于5.6mL的致孔剂乙腈中，形成预聚合溶液；

(2)将预聚合溶液置于冰浴中，超声脱气10min，此后向预聚合溶液中通氮气10min除氧后密封，于5℃下冷藏放置2h；

(3)将密封冷藏后的预聚合溶液放入60℃水浴中，进行本体聚合反应24h，生成白色的块状聚合物；

(4)将白色块状聚合物粉碎、研磨、筛分并沉降，所用筛子的筛网为200-250目，得到粒度在45-63μm的白色粉末状聚合物；

(5)以甲醇和冰乙酸混合液为溶剂，体积比为9:1，在150℃的温度下索氏抽提24h以除去粉末聚合物材料中的模板分子酚酞；

(6)索氏抽提结束后，将聚合物置于真空干燥箱中于60℃干燥12h，即得到无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料。

制备与印迹材料相对应的非印迹材料的条件为：采用与上述操作步骤(1)中相似的制备条件，将0.42mL(4mmol)功能单体4-乙烯基吡啶(4-VP)、3.8mL(20mmol)交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)和40mg引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶解于5.6mL的致孔剂乙腈中，形成预聚合溶液；采用与上述操作步骤(2)中相同的操作方法，将预聚合溶液置于冰浴中，超声脱气10min，此后向预聚合溶液中通氮气10min除氧后密封，于5℃下冷藏放置2h；采用与上述操作步骤(3)中相同的反应条件，将密封冷藏后的预聚合溶液放入60℃水浴中，进行本体聚合反应24h，生成白色的块状聚合物；采用上述操作步骤(4)处理非印迹材料，所用筛子的筛网为200-250目，得到粒度在45-63μm的白色粉末状聚合物；不采用上述操作步骤(5)处理非印迹材料；采用上述操作步骤(6)的方法干燥得到非印迹材料。

实施例2

对材料进行静态吸附评价：

准确实施例1制备的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料及与 之对应的非印迹聚合物材料各40mg，分别分散到装在10mL密封性良好玻璃样品瓶的2mL一系列浓度(0.02mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L)的BPA乙腈溶液中。将样品瓶在25℃的恒温水浴中以150转/分的速度连续震荡24h之后分别将固液混合物用0.22μm滤膜过滤。利用高效液相色谱分别分析滤液中剩余BPA的浓度。将分析结果绘制成等温吸附曲线，结果见图2。很容易发现印迹材料对BPA的吸附能力明显高于非印迹材料。再将印迹材料及非印迹材料的等温吸附数据用斯卡查德模型进行分析，结果如图3所示。对于印迹材料的吸附数据进行分析后得到两条不同的直线，证明该发明材料存在高亲和与低亲和两种不同的吸附位点，如图3所示。利用通过斯卡查德分析得到两条直线的斜率和截距，计算出高亲和与低亲和吸附位点对BPA的最大吸附量分别为4.661μmol g^-1和65.64μmol g^-1。

该发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料对BPA具有很好的选择性和较高的吸附容量。

实施例3

评价所发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料对BPA、BPB、BPE、BPAF、BPS、BPAP、BPZ、E2、DES的印迹因子：

将实施例1制备的印迹材料及非印迹材料以甲醇为分散溶剂，分别装入不锈钢色谱柱(100mm×4.6mm i.d.)，得到印记柱和非印迹柱。通过液相色谱获得上述物质在印迹柱和非印迹柱上的保留时间，进而获得印迹因子的评价结果。具体步骤如下：分别配置上述分析物的浓度为20ppm的乙腈溶液，色谱以乙腈为流动相，流动相流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为220nm，每次手动进样各20μL上述乙腈溶液中的一种到印迹柱及非印迹柱，通过色谱评价分别获得分析物在印迹柱和非印迹柱上的保留时间(t_R)，利用丙酮代替上述色谱步骤中的双酚类污染物乙腈溶液，得到印迹柱及非印迹柱的死时间t₀通过容量因子计算公式k＝(t_R-t₀)/t₀计算分析物在印迹柱(k_PP-MIP)和非印迹柱(k_NIP)上的容量因子。利用印迹因子计算公式IF＝k_PP-MIP/k_NIP计算酚酞分子印迹聚合物对上述9种分析物的印迹因子，结果如图4所示。

通过评价发现，所发明印迹材料对七种双酚类污染物(BPA、BPB、BPE、BPAF、BPS、BPAP、BPZ)的印迹因子显著高于其对E2和DES的印迹因子。上述结果表明所发明的无毒替代模板(酚酞)分子印迹聚合物材料对七种双酚类污染物具有良好的类选择性。