本发明涉及一种化合物及其制备方法和应用，具体涉及一种具有抗肿瘤作用性的化合物及其制备方法和应用。
背景技术：
当前临床上癌症的治疗往往出现“癌死人亡”的悲剧，尤其是肝癌、结肠癌等多类恶性癌变目前尚未特效药物，究其原因是目前化疗是癌症的主要方式之一，一线化疗药物在杀伤癌细胞的同时往往对正常机体造成严重的毒副作用，例如：肾毒性、肝毒性、神经毒性等等。对于获得高效、低毒、选择性强的抗癌药物是药学工作者孜孜以求的目标，可喜的是国内外最新研究发现细胞毒选择性强的化合物具有良好的成药性，符合当代精准医学的发展趋势(cancercell,2015,28,240–252；int.j.mol.sci.2015,16(7),16401-16413)。
本发明以具有抗肿瘤、抗肝病生物活性的白桦脂酸(ba)及天然药物川芎嗪(tmp)为起始原料，进行化学拼合合成本发明化合物。对该类化合物的活性评价主要围绕抗肿瘤(尤其肝癌、肠癌等)方面展开，分别测试了类似物对5种癌症细胞系(hepg-2、ht-29、hela、bgc-823、a549)及非癌细胞系(人肝正常细胞l02)的细胞毒活性。
技术实现要素：
本发明的第一个目的在于提供具有式1结构的化合物及其制备方法。
本发明的第二个目的在于提供式1化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的药物组合物。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
具有式1结构的化合物或其药学上可接受的盐，
进一步，所述化合物可加入制剂领域常规辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂等常规剂型。
本发明所述化合物的制备方法包括如下步骤：
步骤1，将白桦脂酸溶解于有机溶剂中，与2-氯代甲基-3,5,6-三甲基吡嗪在碱性条件下生成中间体化合物川芎嗪-白桦脂酸酯(中间体化合物tba)；
步骤2，中间体化合物tba在催化剂的作用下与肌氨酸发生反应生成化合物lqc-c。
进一步，上述反应在-20℃至250℃下进行；所述有机溶剂是含有1-20个碳原子的醚、醇、烷烃、芳香烃、酮、卤代烷、酰胺、腈、酯或者它们各种比例的混合物；所用碱为三乙胺或碳酸钾；所述催化剂为1-羟基苯并三唑(hobt)、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(edci)、1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)或4-二甲氨基吡啶(dmap)。
进一步，上述制备方法中，原料与氯代川芎嗪的摩尔比为1:0.1～1:10；原料与碱的摩尔比为1:0.1～1:10；中间体与肌氨酸的摩尔比为1:0.1～1:10；中间体与催化剂的摩尔比为1:0.1～1:10。
本发明反应路线为：
反应条件和试剂:(a)acoh,30％h2o2,reflux,90℃,6h；(b)ac2o,reflux,105℃,2h；(c)thf:meoh:h2o＝3:1:1,naoh,1h；(d),thf,tscl,tea,dmap,12h.；(e)dmf,dryk2co3,60℃,12h.(f)boc-sarcosine,edci,dmap,dcm,25℃,12h；(g)hcl(g)inea,0℃,1h.
本发明还提供式1化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，所述肿瘤为肝癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌和胃癌细胞系。
本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含以治疗有效量存在的式1化合物或其药学可接受的盐与至少一种药学可接受的赋形剂的混合物。
进一步，所述组合物还包含至少一种常规抗癌药。
更进一步，所述抗癌药选自环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、奥沙利铂、顺铂或健择。
本发明还提供治疗癌症的方法，包括给予患者给药有效量的式1化合物或其药学上可接受的盐。
为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的赋形剂，例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂等，填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等，崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等，润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等，助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等，粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等，甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等，矫味剂包括：甜味剂及各种香精，防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等。
本发明所述“药学可接受的”表示化合物或组合物必须在化学上和/或毒理学上与制剂中包含的其他成分相容。
所述“治疗有效量”表示本发明化合物治疗或预防特定疾病或症状；减弱、改善或消除特定疾病的一种或多种症状；或预防或延迟特定疾病或症状的发作的量。
本发明化合物具有明显抑制肿瘤细胞系(hepg-2、ht-29、hela、bgc-823、a549)生长的活性但对人肝正常细胞(l02)系毒性较小。其中，化合物lqc-c的对人结肠癌细胞系ht-29、人宫颈癌细胞系hela以及人肺癌细胞系a549抗增殖活性优于阳性药顺铂；但对人肝正常细胞l02的细胞毒性明显低于阳性药顺铂。
实验例1mtt法观察本发明化合物lqc-c对癌细胞及非癌细胞系的增殖影响
1.仪器与材料
thermo3111型co2培养箱；hfsafe生物安全柜；multiskango酶标仪；京立牌ld5-2b型台式低速离心机；olympusix71倒置荧光显微镜改良型rpmi-1640培养基、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶溶液、噻唑蓝、磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)；amresco二甲基亚砜(dmso)；
人肝癌细胞系hepg-2；人结肠癌细胞系ht-29；人宫颈癌细胞系hela；人胃癌细胞系bgc-823；人肺癌细胞系a549；人肝正常细胞l02；
实验药物：本发明化合物lqc-c(按实施例1-4制备)；原料药川芎嗪(tmp)、白桦脂酸(ba)；阳性药物注射用顺铂(dpp)(301001cf；齐鲁制药有限公司)。
2.方法
2.1不同细胞株的培养
hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549和l02细胞培养在含10％胎牛血清的1640培养液中，放置于37℃、5％的co2培养箱中温育。细胞均呈贴壁状态生长，在倒置显微镜下观察生长状况，待细胞数量适量时传代培养。
2.2对肿瘤细和正常细胞的增殖抑制作用
取对数生长期的hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549和l02细胞，以3×103/孔的数量接种于96孔培养板中，在含5％co2的湿化培养箱中37℃培养24h；每孔分别加入100μl待测化合物，使最终浓度分别为40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25μm。设置细胞对照组及空白对照组，药物组每浓度重复4孔，细胞对照组和空白对照组重复3孔。培养箱中继续培养72h后，每孔加20μlmtt孵育4h，弃去上清，再加100μldmso，振荡10min，酶标仪490nm波长测得吸光度值，记录结果，并计算化合物的ic50值，细胞抑制率(％)＝[1－(a给药－a空白)/(a正 常－a空白)]×100％。
3.结果
3.1本发明化合物lqc-c对5种肿瘤细胞系(hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549)和人肝正常细胞l02的ic50值如表1所示。
由表1可以看出，化合物lqc-c对各种癌细胞均表现出较好的抑制肿瘤细胞增殖活性，并且其抗肿瘤活性优于原料；其中，化合物lqc-c的对人结肠癌细胞系ht-29和人宫颈癌细胞系hela和人肺癌细胞系a549抗增殖活性优于阳性药顺铂；但对人肝正常细胞l02的细胞毒性明显低于阳性药顺铂。
表1lqc-c对不同肿瘤细胞株和正常细胞的ic50值
4.结论
本发明化合物表现出抑制肿瘤细胞系(hepg2、ht-29、hela、bgc-823、a549)增殖的活性。
具体实施方式
实施例1化合物2-氯代甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(化合物5)的制备
取川芎嗪21.76g(160mmol)(化合物1)溶于50ml冰乙酸，加入18ml(160mmol)30％过氧化氢于90℃反应4h，之后补充18ml(160mmol)30％过氧化氢继续反应2h，tlc监测至反应完全，冷却至室温，以50％氢氧化钠调ph至10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，回收溶剂，得到白色川芎嗪单氮氧(化合物2)。在化合物2中加入15.1ml(160mmol)乙酸酐，于105℃加热回流2.5h，tlc监测至反应完 全后，减压蒸除过量的醋酐，得到黑色浆状川芎嗪乙酰化物(化合物3)。将次此黑色浆状物置于100ml(thf:meoh:h2o＝3:1:1)的溶液，分批加入19.2g(480mmol)氢氧化钠，搅拌反应2h，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得到羟基川芎嗪粗品，以正己烷重结晶，得18.5g黄色针状结晶(化合物4)。最后将此黄色结晶溶于150ml无水四氢呋喃中，然后加入30.3g(0.159mol)tscl、24.64g(0.244mol)tea、1.5g(0.122mol)dmap，搅拌过夜，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，回收溶剂，得到淡黄色氯代川芎嗪粗品，硅胶柱分离[v(石油醚):v(乙酸乙酯)＝10:1]得无色透明的氯代川芎嗪(化合物5)，收率80％。
备实施例2化合物tba的制备
称取12g(26.28mmol)白桦脂酸，7.25g(52.56mmol)无水碳酸钾于100ml单口瓶中，加入50mldmf，搅拌半小时后加入5.4g(31.5mmol)氯代川芎嗪(化合物5)，氮气保护下，于60℃反应12h，tlc检测至反应完全，加入一定量的水终止反应，随后用二氯甲烷萃取，收集有机层，适量无水硫酸钠除水，减压蒸干，硅胶柱分离[v(石油醚):v(丙酮)＝10:1]得白色固体tba，熔点:184.6–185.4℃,收率90％。1h-nmr(cdcl3)(ppm):0.78,0.80,0.82,0.96,0.98,1.69(s,each,3h,6×-ch3),2.51(s,3h,-ch3),2.53(s,3h,-ch3),2.57(s,3h,-ch3),3.02(m,1h),3.19(m,1h),4.61,4.74(each,brs,1h,＝ch2),5.20,5.23(each,d,j＝12.5hz,1h,-ch2),1.00–2.50(25h,methyl-andmethylene-oftriterpenoidstructure).13c-nmr(cdcl3)(ppm):14.7,15.4,15.9,16.1,18.3,19.4,20.9,25.5,27.4,28.0,29.7,30.6,32.1,34.4,36.9,37.2,38.1,38.7,38.9,40.7,42.4,46.9,49.5,50.6,55.4,56.7,79.0,109.6,150.5,175.5(-coo-)；pyrazinering:20.4(-ch3),21.4(-ch3),21.6(-ch3),64.3(-ch2),145.4,148.7,148.9,150.9.hrms(esi)m/z:591.45212[m+h]+,理论计算c38h58n2o3590.44474.
实施例3化合物lqc-c的制备
依次称取200mg(0.338mmol)tba、83.25mg(0.44mmol)boc-l-肌氨酸、97.20mg(0.50mmol)edci和4.12mg(0.0038mmol)dmap置于50ml单口瓶中，加入5ml的无水二氯甲烷使其溶解，室温下搅拌过夜tlc[v(二氯甲 烷):v(甲醇)＝20:1]检测反应进程，反应液用二氯甲烷萃取，收集有机层，适量无水硫酸钠除水，减压蒸干，硅胶柱分离[v(二氯甲烷):v(甲醇)＝40:1]得白色固体；将其溶于含3mhcl的乙酸乙酯中，冰盐浴搅拌1h；减压蒸干反应液，适量乙酸乙酯复溶，用饱和的碳酸氢钠溶液调ph至中性，收集有机层，适量无水硫酸钠除水，减压蒸干，硅胶柱分离[v(二氯甲烷):v(甲醇)＝40:1]得白色固体lqc-c，熔点:172.6–173.4℃，收率:76.90％。1h-nmr(cdcl3)(ppm):0.77,0.84,0.93(s,each,3h,3×-ch3,methylofba),0.82(brs,6h,2×-ch3,methylofba),1.00-2.50(31h,methyl-andmethylene-ofba),2.40,2.50,2.53(s,each,3h,3×-ch3,methyloftmp),2.96-3.01(m,1h,-cchch2-),3.52(brs,2h,-ch2nh-),4.48-4.51(m,1h,-ococh-),4.56,4.59(brs,each,1h,＝ch2),5.17,5.20(d,each,1h,j＝15hz,-och2-).13c-nmr(cdcl3)(ppm):14.79,16.00,16.28,16.64,18.27,19.47,20.63,23.85,25.56,28.22,29.75,30.66,32.15,34.35,34.55,37.04,37.21,38.01,38.18,38.47,40.79,42.53,46.97,49.59,50.58,50.73,55.55,56.79(-ch-nh2),83.23(-ococh-),109.81(-ch＝c-),151.10(-ch＝c-),168.63(-coch-),175.66(-coo-),pyrazinering:21.02(-ch3),21.51(-ch3),21.80(-ch3),64.48(-ch2),145.46,148.89,148.98,150.60.hrms(esi)m/z:[m+h]+662.48975，理论计算：c41h63n3o4661.48186.
实施例4
取lqc-c10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成抗肿瘤药注射剂。
实施例5
取lqc-c10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成抗肿瘤药片剂。
实施例6
取lqc-c10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成抗肿瘤药胶囊剂。
实施例7
取lqc-c10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成抗肿瘤药乳剂。
实施例8
取lqc-c10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成抗肿瘤药颗粒剂。
实施例9
取lqc-c10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制成抗肿瘤药缓释控释剂。
实施例10
取lqc-c10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成抗肿瘤药口服液。
实施例11
取lqc-c10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成抗肿瘤药脂质体剂型。