本发明申请是pct专利申请pct/jp2009/067585，申请日为2009年10月2日、发明名称为“新的甜菊醇糖苷”的发明专利申请的分案申请，母案进入中国的申请号为200980139481.1。本发明涉及一种新的甜菊醇糖苷，一种含有莱鲍迪苷a和所述新的甜菊醇糖苷的甜味剂，所述新的甜菊醇糖苷包含于含有高含量的莱鲍迪苷a的各种甜菊(steviarebaudianabertoni)中，一种生产食品、医药品、非医药品和化妆品的方法，验证甜菊品种和所述新的甜菊醇糖苷的分析方法。
背景技术：
：：甜叶菊是原产地为南美巴拉圭的菊科多年生植物，学名是甜菊(steviarebaudianabertoni)。甜叶菊含有甜度是蔗糖的300倍或更高的甜味成分，因此，为提取该甜味成分作为天然甜味剂使用而对其进行栽培。甜叶菊的甜味成分已知的有甜菊苷(c38h60o18)、莱鲍迪苷a(c44h70o23)、莱鲍迪苷c、d和e、杜尔可苷a等。通常栽培的甜菊品种中，上述甜味成分中甜菊苷(以下称st)为主要成分，莱鲍迪苷a(以下称ra)的含量为大约40％重量，莱鲍迪苷c的含量比这稍少。但根据品种的不同，也有例如以莱鲍迪苷c为主要成分的各种品种。由于st具有蔗糖300倍的甜度，因此其在食品工业中作为天然甜味剂被广泛地使用。其甜味与蔗糖较类似，但已知相比于ra在嘴中残留有苦味这样的令人不快的味道。与此相比，ra具有良好的甜味性质，具有的甜度是st的1.3-1.5倍，因此通常优选含有高含量ra而非st的甜叶菊甜味剂。本发明人通过对常规品种反复选择性杂交进行植物培植，仅得到st含量比ra少很多的甜叶菊品种，研发了来自这些品种的甜味剂(例如参见专利文献1)。但是，在苦味、涩味和平滑感等用舌头感知的味道中，平滑感非常微妙。这种微妙的平滑感并不仅取决于st与ra的比例。当把葡萄糖加入甜叶菊所含的各种甜味成分的化学结构中时，平滑感有所改善，并且已经开发了改善平滑感和浓味的方法，其是通过向甜菊的甜味成分结构上加入葡萄糖(专利文献2和3)。因此，即使含量小，分析甜叶菊中含有的未知成分也是非常重要的，特别是为了掌握那些结构上加入葡萄糖而非st的成分，并且尤其重要的是，通过味道－品质对照考查对在结构上引入葡萄糖的成分进行仔细的检测。同时，由于味道品质受到原料植物本身所含甜味成分的影响，为了研发优良的甜叶菊品种并利用它们，重要的是要彻底地掌握这些甜味成分。从现在开始，原料植物品种改良可能将变得非常流行，但通过坚持不懈地精确确定已研发植物中所含的甜味成分将可能详细地掌握品种改良的结果。另一方面，本发明人研发了一种通过使用基因确定新研发的植物体的品种的方法(专利文献4和5)，但实际上没有根据从这些原料植物中提取和制备的甜味剂和利用它们制得的产品精确确定原料植物的方法。[专利文献1]日本特开jp2002-262822号公报[专利文献2]日本特开(patentpublication)jp1957-18779号公报[专利文献3]日本特开jp1997-107913号公报[专利文献4]日本特开jp2003-009878号公报[专利文献5]专利合作条约国际专利公报pctwo06/093229技术实现要素：解决的技术问题已经分析和标准化了甜叶菊甜味剂的五种成分(st、ra、莱鲍迪苷a、杜尔可苷a和甜菊醇双糖苷(biaside))，但对于其它未知成分却一无所知。此外，因为没有确定的分析方法，所以即使对已知的甜味成分也无法确认它们的存在。但是，随着意识到这些成分对精美味道的影响的重要性，最近已经设定了对7种甜菊醇糖苷成分的jecfa标准，确认了甜叶菊中含有的甜味剂并澄清了未知的成分。本发明的目的是定义甜叶菊品种中所含少量甜味剂的结构并确认它们对甜叶菊甜味剂的味道的影响。另外，其它目的是根据甜叶菊甜味剂和使用它的产品，提供精确确定甜叶菊植物(其作为原料)的方法。本发明人已经研究了甜叶菊品种中所含的新甜菊醇糖苷，其主要成分是ra，并且发现了对味道品质有微妙影响的所述新甜菊醇糖苷的10种成分。此后，他们通过发现品种间这些成分的含量体积存在差异，并且某些成分仅在特定的以ra为其主要成分的甜菊品种中存在，以及随后通过确认可能使用该发现作为来源于这类植物的甜味剂的标记完成了本发明。发明效果本发明的甜菊醇糖苷具有比st或ra加入了更多葡萄糖的结构，由此提供了具有极好的浓厚味道的甜菊甜味剂。此外，可通过确认提取物或晶体中甜菊醇糖苷x来推测原料植物的来源，并通过分析最终产物能够判断原料植物是否与例如专利等等权利相对立。附图说明图1显示了提取物ra-c的hplc分析图表。图2显示了晶体ra-a的hplc分析图表。图3显示了晶体ra-b的hplc分析图表。图4显示了晶体ra-c的hplc分析图表。图5显示了提取物ra-a的hplc分析图表。图6显示了提取物ra-b的hplc分析图表。图7显示了提取物ra-c的hplc分析图表。图8显示了提取物st的hplc分析图表。图9显示了晶体st-st的hplc分析图表。图10显示了晶体st-ra的hplc分析图表。具体实施方式在本发明中提及的以ra为其主要成分的甜叶菊品种是一种含有ra比st多的品种，并且表述于专利申请jp2001-200944和jp2007-506004中；从干燥叶片中获得的提取物的ra含量比st多并且也含有莱鲍迪苷d(r-d)，甜菊醇糖苷iii、v、vi、vii和x，这使得可通过含有结构上加入了比st和/或ra更多葡萄糖的成分而获得具有浓厚味道的优异的甜味剂。此外，可能通过重结晶有效地获得含有痕量st和甜菊醇糖苷x的高纯ra甜味剂。本发明的第一实施方式是式i-x的甜菊醇糖苷：其中r1和r2是氢原子或下表中定义的糖链；式中代号为如下糖：glc：d-吡喃葡萄糖基(glucopyranosyl)rha：l-吡喃鼠李糖基(rhamnopyranosyl)xyl：吡喃木糖基(xylopyranosyl)本发明的第二个实施方式是含有甜菊醇糖苷x(莱鲍迪苷o)的提取物，其是用水或含水溶剂提取菊科植物甜菊的植物体、或其干燥叶片而获得，其主要成分是莱鲍迪苷a。本发明的第三个实施方式是通过重结晶上述实施方式的提取物，获得含有甜菊醇糖苷x(莱鲍迪苷o)的高纯莱鲍迪苷a的方法。本发明的第四个实施方式是一种生产食品的方法，其中以食品量的1％或小于1％的量将上述第二实施方式的提取物加入食品中。本发明的第五个实施方式是一种生产食品的方法，其中以与食品量的1％或小于1％的量将上述第三实施方式所得的高纯莱鲍迪苷a加入食品中。在从主要成分是st的原料品种获得的提取物中，不含有甜菊醇糖苷x，但从主要成分是ra的原料品种获得的提取物含有糖苷x。这可通过主要成分是st还是ra来判断原料品种。也即是，如果在主要成分是ra的提取物(该提取物是通过结晶从主要成分是st的原料品种获得的提取物来除去st而制得的)中或将其重结晶而得的高纯度产品中不含有糖苷x，从而可确认原料品种。本发明的第六个实施方式是通过甜菊醇糖苷x确认甜叶菊品种的方法。本发明的第七个实施方式是利用高效液相色谱(以下称hplc)分析甜菊糖苷i-x的方法。为了完成这些目标，本发明人大量研究了主要成分是ra的品种以及申请jp2001-200944和jp2007-506004的品种中包含的甜味成分，并发现了新的甜味成分和鉴定了它们的化学结构。此外，本发明人确认了这些成分可用作甜味剂，完成了分析方法以及通过这些品种确认品种的方法。通过用水或含水溶剂提取实施例1所示的主要成分是ra的品种(以下称为品种a)以及申请jp2001-200944的干燥叶片(以下称为品种b)和2007-506004的干燥叶片(以下称为品种c)来实现对新成分的确认。此后，将提取溶液直接浓缩，或者必要时，用离子交换树脂或阳离子交换树脂、或活性炭除去离子杂质。可将所述甜味成分吸收于吸收树脂中，随后用亲水性溶剂洗脱，必要时浓缩并干燥洗脱液，用离子交换树脂或阳离子交换树脂、或活性炭再次处理洗脱液，并可对由此得到的提取物或通过常规技术中合适的纯化方法例如脱色而得到提取物进行确认。利用实施例5的高效液相色谱质谱(hplc-ms)设备分离并分析了由下文实施例1(1)获得的提取物ra-c的新甜醇菊糖苷，并且确定了各糖苷结构i-x：其中r1和r2分别是氢原子和上述糖链。甜菊醇糖苷i(杜尔可苷b)是分子量为788的结构的糖苷，其由图1中大约13分钟的hplc色谱保留时间(以下称r.t.)而确定。甜菊醇糖苷ii(莱鲍迪苷g)是分子量为804的结构的糖苷，其由图1中大约15分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷iii(莱鲍迪苷i)是分子量为1112的结构的糖苷，其由图1中大约28分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷iv(莱鲍迪苷h)是分子量为1128的结构的糖苷，其由图1中大约29分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷v(莱鲍迪苷l)是分子量为1112的结构的糖苷，其由图1中大约34分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷vi(莱鲍迪苷k)是分子量为1112的结构的糖苷，其由图1中大约34分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷vii(莱鲍迪苷j)是分子量为1128的结构的糖苷，其由图1中大约34分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷viii(莱鲍迪苷m)是分子量为1290的结构的糖苷，其由与莱鲍迪苷d在图1中大约34分钟的hplc的r.t.完全相同(duplicating)而确定。甜菊醇糖苷ix(莱鲍迪苷n)是分子量为1274的结构的糖苷，其由图1中大约43分钟的hplc的r.t.而确定。甜菊醇糖苷x(莱鲍迪苷o)是分子量为1436的结构的糖苷，其由图1中大约51分钟的hplc的r.t.而确定。但是，任何本领域普通技术人员可理解的是使用梯度洗脱的分析方法中上述r.t.是可变的。如上所述，提供了通过最终产品中是否存在甜菊醇糖苷x来鉴定原料品种的重要信息。同时，即使这些新甜菊醇糖苷被用作甜味剂，仍可通过hplc对它们进行确认，因此利用hplc分析可容易地彻底控制品质和味道。所得提取物和晶体可用作糖果、果冻、粉末饮料、方便面、果酱、冷冻水果、口香糖、日本甜点、健康食品、巧克力、台面(tabletop)甜味剂、油炸甜品、佳肴(delicacies)、水煮食物、发酵乳酸饮料、咖啡饮料、可可饮料、茶饮料、甜露酒、葡萄酒、果汁冻、谷物、含蔬菜纤维的食物、调味汁、酱油、豆酱、醋、调味品、蛋黄酱、调味酱、咖哩粉、汤、米制甜点、霰饼、面包、饼干、脆饼、煎饼粉、罐头水果、罐头蔬菜、肉制品、用煮沸的鱼酱制成的产品、盐制食品、腌渍品、组合调味品、高档食品、化妆品等中的甜味剂，导致卡路里降低、蔗糖减少、熔点降低、改善甜味品质和隐蔽效应，以及其它，还可添加到其它天然和人工甜味剂和溶剂中。实施例实施例1制备ra提取物(1)提取取100g来自主要成分是ra的品种a、b或c的干燥叶片，用20倍重量的水提取数次，直到不能尝到甜味。将提取物通过填充了300ml吸收树脂(diaionhp-20)的柱，并且让该提取物的甜味成分吸附于树脂中。用水对树脂进行充分地洗涤，并用900ml甲醇洗脱甜味成分。将洗脱液通过填充了200ml离子交换树脂(diaionwa-30)的柱，向洗脱液中加入10g活性炭并搅拌。过滤该混合物，浓缩滤液并干燥残留物，分别得到13.0gra-a提取物，其主要成分是淡黄色莱鲍迪苷a(st35.4％，ra41.7％和rc9.8％)，11.5gra-b提取物(st19.5％，ra58.1％和rc8.8％)以及12gra-c提取物(st5.4％，ra72.3％和rc8.1％)。(2)ra重结晶在加热的情况下，将各自5g的上述ra-b提取物和ra-c提取物溶解于10倍重量的90％甲醇中，并将其在4℃静置6天。分离所得晶体，用冷甲醇洗涤并减压干燥，分别得到3.9g白ra-b晶体(st0.2％，ra95.0％和rc0.2％)和4.5gra-c晶体(st0.2％,ra95.6％和rc0.1％)。实施例2制备st提取物出于比较的目的，对主要成分是st的品种进行了相同的工序，得到11.3gst提取物(st51.9％，ra23.7％和rc7.4％)。实施例3ra-a母液、st母液在加热的情况下，将各自10g的上述ra-a提取物和st提取物溶解于10倍重量的90％甲醇中，并将其在4℃静置6天。分离所得晶体，用冷的98％甲醇洗涤并减压干燥，分别得到2.1gra-st晶体(其是甜菊苷的白色晶体)，和3.8gst-st晶体。分别浓缩并干燥主要成分是ra的8.8gra-a母液(st15.7％，ra43.8％和rc6.9％)和6.1gst母液(st20.0％，ra37.1％和rc11.2％)，得到母液的粉末，其主要成分分别是浅黄色的ra。实施例4ra-a晶体、st-ra晶体在加热的情况下，将实施例3各自的母液粉末溶解于10倍重量的90％甲醇中，并在4℃静置6天。分离所得晶体，用冷的98％甲醇洗涤并减压干燥，分别得到2.2g白色ra-a晶体(st1.6％，ra90.4％和rc1.4％)和1.2gst-ra晶体(st1.6％，ra96.9％和rc1.4％)。实施例5甜菊醇糖苷的结构确定如下所述，使用hplc进行分析。使用shimazulc-10advphplc，tskgelamide-80(4.6x250mmtosoh)柱分离各个提取物所包含的甜菊醇糖苷。使用乙腈-水作为溶剂和梯度洗脱剂，其中乙腈:水的比例在60分钟内由82:18变至66:34。流速为0.65ml/分钟，柱温为40℃，紫外吸收210nm处进行检测。使用装配了电喷雾离子化(esi)质谱计的waters'alliancehplc系统2695和waters'quattromicro(三重四极质谱)进行分子量的测定。对于hplc，使用tskgelamide-80(2.0x250mmtosoh)柱，乙腈-水作为溶剂和梯度洗脱剂，其中乙腈:水的比例在60分钟内由82:18变至66:34。流速为0.2ml/分钟，柱温为40℃。氮气用作去溶剂化气体，氩气用作碰撞气体。关于毛细管电压，在负离子模式甜菊醇糖苷分析中为15.0kv，在正离子模式abee-寡糖分析中为13.5kv。ms/ms分析时，10v至80v的电压作为锥电压和碰撞电压。源温度和去溶剂化温度分别为100℃和400℃，锥气体和去溶剂化气体的流量分别为501/小时和9001/小时。关于各个提取物和晶体的hplc分析结果图示在图1-10中。图2-10所示的各个色谱峰的分析结果显示在下表1-9中。[表1]—晶体ra-a[表2]—晶体ra-b[表3]—晶体ra-c[表4]—提取物ra-a[表5]—提取物ra-b[表6]—提取物ra-c[表7]—提取物st[表8]—晶体st-st[表9]—晶体st-ra上述表格中使用的缩写如下：pkno:峰号t:时间(分钟)a:峰面积h:峰高conc:浓度(％)n:糖苷的名称tot:总计stevmono:甜菊醇单糖苷stevbio:甜菊醇双糖苷rebuso:甜茶苷rebau:莱鲍迪苷stev:甜菊苷dulco:杜尔可苷根据210nm处紫外吸收光谱的总面积计算浓度，并且为了测量所含的体积有必要校正分子量。谱图中的i-x表示新颖的甜菊醇糖苷i-x。实施例6味道品质的评价由10名熟悉甜叶菊感觉测试的人员对各种提取物的0.05％水溶液和晶体的0.03％水溶液进行评估。在下表10中显示了平均的评估结果：评价5:优异，4:良好，3:普通，2:坏，1:最差[表10]感觉测试品1)2)3)4)5)6)ra-a提取物4.13.84.14.93.43.8ra-a晶体5.04.94.93.24.94.9ra-b提取物4.23.84.14.93.53.7ra-b晶体5.05.04.93.54.94.9ra-c提取物4.24.04.54.83.53.8ra-c晶体5.05.05.03.85.05.0st提取物1.21.31.24.02.02.0st-ra晶体4.84.64.63.04.84.31)甜味品质2)口中残留味道3)涩味4)精美的味道5)清爽的感觉6)流出的甜味相比于三种ra晶体，含有甜菊醇糖苷ii-x(莱鲍迪苷g至o)的三种ra提取物具有优异的精美味道，但ra晶体在其它评估方面表现优异。除了精美的味道评估项外，st提取物劣于st-ra晶体。由该结果验证了新的甜菊醇糖苷ii-x影响精美的味道。实施例7品种鉴定根据各个提取物和/或晶体的hplc分析，从含有ra作为主要成分的品种(以下称品种ra)获得的提取物包含更多的莱鲍迪苷d，以及相比于从含有st作为主要成分的品种(以下称品种st)获得的提取物其还包括甜菊醇糖苷x(莱鲍迪苷o)。还发现甜菊醇糖苷x还包括在由ra品种提取物纯化而得的ra晶体中(虽然是痕量)。另一方面，从st品种获得的提取物中不含有甜菊醇糖苷x。自然地，未在从st品种获得的st-ra晶体中发现甜菊醇糖苷x。由此可确认如果确认存在甜菊醇糖苷x，则该提取物或晶体得自ra品种。实施例8甜菊醇糖苷的分析方法根据实施例5所述的hplc条件，可确认各个甜菊醇糖苷i-x。原则上，可通过hplc分析图表的r.t.确认甜菊醇糖苷的存在，但各个甜菊醇糖苷i-x可在制备性分离各个糖苷后通过分子量测定而被确认。实施例9台面糖1)通过混合1gra-a晶体和99g粉末糖而制得台面糖。2)通过混合1gra-b晶体和99g赤藓醇而制得台面糖。3)通过混合1gra-c晶体和99g高果糖含量玉米糖浆而制得台面糖。实施例10糖果将0.3gra-c提取物、100g帕拉金糖醇和适当体积的香料制成糖果。实施例11牛奶果冻由15g糖、0.08gra-b提取物、250g牛奶、5g明胶和适当体积的牛奶香料制成牛奶果冻。实施例12运动饮料由0.075％的ra-b晶体、0.11％的乳酸钙、0.045％的柠檬酸、0.03％的柠檬酸三钠、0.015％的氯化镁、0.0055％的谷氨酸和99.72％的水制成运动饮料。实施例13碳酸饮料碳酸饮料通过如下步骤制备：加入0.012％的ra-b晶体、8.4％的果糖、0.6％的柠檬酸、0.12％的精氨酸、0.1％的肌醇、0.0025％的咖啡因、0.0034％的泛酸钙、0.003％的烟酰胺、0.002％的维生素b6、0.00009％的维生素b2、0.000002％的维生素b12、适当体积的香料和水以调节到总成分为100％，然后引入二氧化碳气体。产业实用性通过hplc分析本发明提供的新甜菊醇糖苷，可制造甜味剂和具有一定甜度、品质和精美味道的其它食品。另外本发明还可以推测原料的品种，并且有助于判断来源指示的正确性、甜菊品种的栽培区域、或者是否侵权。当前第1页12当前第1页12