3-取代-1-茚酮衍生物化合物及其制备方法和药物用途与流程

本发明属于药物化学和医药技术领域，涉及一种新型肿瘤坏死因子(tnf-α)抑制剂，具体涉及小分子3-芳基-1-茚酮衍生物tnf-α抑制剂及其药用用途。

背景技术：

研究公开了溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)是一种肠道慢性非特异性炎症，表现为急性和反复发作性血性粘液性腹泻，可以持续数周至数月。据统计，溃疡性结肠炎的全球发病率约为6.3-24.3人/10万人/年，近几年出现大幅上升。uc的发病机制至今尚未清楚，研究表明其与遗传、免疫、感染和精神活动等因素相关。uc的反复发作可引起dna损伤和粘膜细胞的微卫星不稳定性，进而导致结肠癌的发生，已有研究证实，uc患者发生结肠癌的风险显著高于正常人群。目前治疗溃疡性结肠炎的方法和药物有：①柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂是主要治疗药物，如艾迪莎、美沙拉嗪等；②皮质类固醇常用药为强的松或地塞米松，但目前并不认为长期激素维持可防止复发；在急性发作期亦可用氢化考的松或地塞米松静脉滴注，以及每晚用氢化考的松加于生理盐水中作保留灌肠，在急性发作期应用激素治疗的价值是确定的，但在慢性期是否应持续使用激素则尚有分歧，由于其中存在有一定副作用，故多数意见不主张长期使用；③免疫抑制剂在溃疡性结肠炎中的价值尚属可疑；据rosenberg等报道硫唑嘌呤在疾病恶化时并无控制疾病的作用，而在慢性病例中它却有助于减少皮质类固醇的使用；④中药治疗腹泻型溃疡性结肠炎可用中医中药治疗，效果尚理想；虽然上述药物的应用在一定程度上改善了uc患者的复发率，然而至今仍缺乏能够治愈uc的药物。因此，寻找在uc发病机制和病情进展中的关键分子和靶标，并在此基础上开发治疗uc的新方法和药物成为迫切需要解决的重大医学问题。

近十年来，依赖于基因技术的崛起，已经出现了靶向针对特定uc炎症介质的药物，亦逐步应用于临床。经美国食品及药物管理局(fda)批准的新型抗tnf-α(肿瘤坏死因子)制剂，如infliximab(英夫利西单抗)、adalimumab(阿达木单抗)、golimuuab(戈利木单抗)等陆续上市，使患者的病情得到有效控制，生活质量得到明显改善。tnf-α抑制剂类药物目前已经成为一线的治疗药物，且在标准治疗无效和反应不足的中重度溃疡性结肠炎患者，取得了非常好的疗效，而且不易反弹复发；研究显示，此类tnf-α抑制剂于跨模型tnf-α(tmtnf-α)前体和可溶性tnf-α(stnf-α,由tmtnf-α转化而来)结合，阻断了tnf-α分子与1型和2 型tnf-α受体(tnfr1和tnfr2)以及可溶性tnf-α(stnfr)的相互作用，中和了tnf-α介导的促炎细胞信号转导，抑制了炎性基因的表达；此外，tnf-α抑制剂类药物还显示出可以诱导合成tnf-α免疫细胞的凋亡，继而可减少合成tnf-α免疫细胞以及其他细胞对下游各种促炎细胞因子的合成；tnf-α抑制剂类药物的成功使用，对uc治疗方法的未来发展提供了新的更好的途径。但是，目前tnf-α抑制剂类药物主要为单抗，此类药物：①具有免疫原性，有诱导免疫反应的风险，并不适用于敏感体质患者；②需注射使用、价格昂贵，长期使用容易在体内形成抗体而失效，因此，开发口服的小分子的tnf-α抑制剂彻底治疗溃疡性结肠炎的药物将具有广阔的前景。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新型肿瘤坏死因子(tnf-α)抑制剂，具体涉及3-取代-1-茚酮衍生物及其作为先导化合物用于小分子治疗溃疡性结肠炎的药物。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型肿瘤坏死因子(tnf-α)抑制剂，具体涉及3-取代-1-茚酮衍生物及其制备方法和在用于制备小分子治疗溃疡性结肠炎药物中的用途，所述的3-取代-1-茚酮衍生物其对lps诱导的巨噬细胞产生tnf-α具有抑制作用。

本发明基于之前的研究：isopaucifloralf是从植物金雀根中分离得到的小分子白藜芦醇倍半体茚酮天然产物，经药理实验发现部分具有比白藜芦醇更好的抗炎活性，但仍存在活性相对较弱，代谢不稳定等缺陷，本发明针对其存在的缺陷，对其结构进行优化制得3-取代-1-茚酮衍生物，其活性更好，更加稳定。

具体的，本发明提供了如下式(1)所示的3-取代-1-茚酮衍生物：

式中，r1为包含但不限于苯基，取代苯基，萘基，氧杂环芳香取代基，硫杂环芳香取代基等，其中取代苯基为包含但不限于对位氟，氯，溴，甲基，三氟甲基，三氟甲氧基，二氟甲氧基，甲硫基，苯氧基等；其中取代苯基为包含但不限于间位氢，氟等；其中取代苯基为包含但不限于邻位溴，甲基等；其中硫杂环芳香取代基为包含但不限于2-噻吩取代基，3-噻吩取代基，3-苯并噻吩取代基等。

本发明按下述合成路线制得3-取代-1-茚酮衍生物化合物6a～q；

制得的衍生物化合物经体外实验证实，对lps刺激的巨噬细胞raw264.7产生的肿瘤坏死因子(tnf-α)有特异性的抑制作用；进一步，该衍生物可用于制备小分子治疗溃疡性结肠炎药物，以及用作小分子的tnf-α抑制剂，治疗人体内由于tnf-α升高介导的免疫炎症性疾病，包括：溃疡性结肠炎、克隆氏病(crohn'sdisease)、类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病等。

本发明还提供了所述的化合物体外抑制脂多糖诱导的raw264.7细胞产生肿瘤坏死因子(tnf-α)的活性测试的方法。

附图说明

图1：化合物6a-6q(50um)对lps刺激的巨噬细胞tnf-α抑制作用

图2：化合物6b在不同浓度下对lps刺激的巨噬细胞tnf-α抑制作用

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝不是对本发明的任何限制。

实施例1：3-取代-1-茚酮衍生物的合成

步骤一：取两颈瓶，n2保护，抽真空，先加入甲基对甲基砜，-78℃用无水thf搅拌溶解，缓慢加入lda(1.2eq)反应1h后，加入1(1.5eq)，搅拌过夜，tlc检测(pe:ea＝2:1)原料是否反应完全；反应完成后，减压浓缩，ea萃取，饱和nh4cl，水，饱和nacl溶液洗涤，有机层无水naso4干燥，浓缩，硅胶柱纯化(pe:ea＝2:1—1:1)，得白色粉末状目标化合物2；

步骤二：取两颈瓶，n2保护，抽真空，加入2和醛3(1.2eq)，用无水甲苯搅拌溶解，加入哌啶(0.2eq)和乙酸(0.2eq)，回流搅拌6h-8h，tlc检测(pe:ea＝3:1)原料是否反应完全；反应完成后，减压浓缩，ea萃取，饱和nh4cl，水，饱和nacl溶液洗涤，有机层无水naso4干燥，浓缩，硅胶柱纯化(pe:ea＝3:1—2:1)，得淡黄色油状目标化合物4；取两口瓶化合物n2保护，抽真空，加入4用无水甲苯搅拌溶解，加入alcl3(1.1eq)于35℃反应，搅拌12h-24h，tlc检测(pe:ea＝3:1)原料是否反应完全；反应完成后，减压浓缩，ea萃取，饱和nh4cl，水，饱和nacl溶液洗涤，有机层无水naso4干燥，浓缩得到5，不分离直接投下一步反应；取两颈瓶，n2保护，抽真空，加入5，用thf搅拌溶解，加入饱和氯化铵溶液，zn粉(1.2eq)室温搅拌1h，tlc检测(pe:ea＝5:1)原料是否反应完全。反应完成后，减压浓缩，ea萃取，饱和nh4cl，水，饱和nacl溶液洗涤，有机层无水naso4干燥，浓缩，硅胶柱纯化(pe:ea＝8:1—5:1)，得白色粉末状目标化合物6a～q；

白色粉末，产率95％。¹h-nmr(400hz,cdcl3)δ7.58(d,j＝8.0hz,2h),7.31(d,j＝8.0hz,2h),7.00(d,j＝4.0hz,2h),6.66(t,j＝4.0hz,1h),4.52(d,j＝12hz,1h),4.23(d,j＝12hz,1h),3.81(s,6h),2.40(s,3h)；¹³c-nmr(150hz,cdcl3)δ190.44,160.32,141.62,139.45,137.27,129.42,105.90,65.72,55.03,20.84.hrms(esi)calcdforc17h18o4s(m+h):319.0999；found:319.1002.

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白色固体(98％yield)；¹h-nmr(400hz,cdcl3)δ7.20(dd,j＝2.0hz,j＝4.0hz,1h),6.87(d,j＝2.8hz,1h),6.83(d,j＝2.0hz,1h),6.80(dd,j＝1.6hz,j＝4.2hz,1h),6.65(d,j＝2.0hz,1h),4.69(dd,j＝2.4hz,j＝8.0hz,1h),3.85(s,3h),3.72(s,3h),3.17(dd,j＝8.0hz,j＝19.2hz1h),2.65(dd,j＝2.4hz,j＝19.2hz1h)；¹³c-nmr(150hz,cdcl3)δ205.66,161.06.157.21,143.49,138.52,126.07,124.94,119.64,105.51,95.37,55.16,54.99,46.18,35.97.hrms(esi)calcdforc15h14o3s(m+h):275.0736；found:275.0734.

白色固体(97％yield)；¹h-nmr(400hz,cdcl3)δ7.85(dd,j＝2.4hz,j＝7.2hz,1h),7.69(d,j＝7.6hz,1h),7.37(ddt,j＝1.6hz,j＝2.0hz,j＝12.8hz,2h),6.90(d,j＝1.2hz,1h),6.71(m,1h),4.94(dd,j＝2.4hz,j＝8.0hz,1h),3.89(s,3h),3.68(s,3h),3.29(dd,j＝8.0hz,j＝19.2hz1h),2.67(dd,j＝2.4hz,j＝19.2hz1h)；¹³c-nmr(150hz,cdcl3)δ204.84,161.28,157.34,140.18,138.78,137.47,137.35,137.06,123.66,123.39,122.39,121.03,120.77,105.44,95.64,55.20,54.93,44.91,34.68.hrms(esi)calcdforc19h16o3s(m+h):325.0893；found:325.0896.。

实施例2

3-取代-1-茚酮衍生物体外对lps刺激的巨噬细胞raw264.7释放的肿瘤坏死因子(tnf-α)的抑制活性实验：

实验方法：采用体外培养的巨噬细胞系raw264.7细胞，待细胞生长至融合状态后分别加入lps(1ug/ml)，阳性对照药物(50um)和3-取代-1-茚酮衍生物(50um)，于37℃、5％co2条件下共同孵育24h，设立空白对照组。采用rt-pcr检测细胞液中tnf-alpha表达情况。

(1)细胞加药预处理

①提前一天种细胞于6孔板中，第二天观察细胞(约80％细胞量)，设对照组、模型组、阳性药物组及待测药物组；

②将6孔板中的旧培养基吸走，再加入含有药物及lps的培养基(加之前吹打次)加药作用6小时后，提取rna；

(2)rna提取

①弃去培养基，预冷pbs洗涤3次，每孔加入1mltrizol，轻吹收集细胞转入1.5ml进口ep管(可-80℃冻存)；

②每管加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2～3min，12000g，4℃离心15min；

③小心吸取上层相，约400～500μl转入另ep管中；

④加入500μl异丙醇，上下颠倒，轻柔混匀3～5次，室温静置10min，12000g，4℃离心10min；

⑤弃上清，1mldepc水配制的75％乙醇洗涤一次；

⑥4℃，7600g离心5min，室温干燥8～10min，加入10～15μldepc水溶解rna，58℃水浴 5～10min，于-80℃保存或置于冰上待后续实验。

(3)rna浓度测定：取1μlrna样品，用超微量紫外-可见分光光度计检测rna样品在260nm和280nm处的吸光度，按公式计算rna浓度；

(4)逆转录合成cdna：参照takara公司rna逆转录试剂盒说明书，根据检测所需体积，确定配制20μl反应液，反应体系和条件如下：

5×mix4μl

rna1μg

rnase-freeddhupto20μl

37℃，15min；85℃，5s。

(5)pcr扩增：采用sybrgreenⅱ荧光掺入法，通过检查pcr反应体系中荧光信号强度，对目的基因进行定量。在bio-rad荧光定量pcr仪上进行实时定量荧光反应，每组两复孔，反应体系如下：

2×sybrpremixextaqtm12.5μl

上游引物(10μm)1μl

下游引物(10μm)1μl

cdna模板2μl

ddh2o8.5μl

引物使用primerpremier5.0软件设计，引物经序列局部相似性查询系(blast)检测同

源性，所有引物均由invitrogen公司代为合成，配成100μm的储存液，于-20℃保存。

(6)pcr扩增反应

瞬离混匀，将八联管置入荧光定量pcr仪中，按说明书的标准程序进行两步pcr反应，放入bio-radiq5pcr仪中进行两步法real-timepcr反应。两步法标准程序如下：

step1:95℃，30s

step2:95℃，5s

step3:60℃，30sgotostep2for69reps

试验结果显示(如图1所示)，化合物6a,6b,6c,6d,6k,6l,6m等在浓度为50um时lps刺激时，对细胞产生的炎症因子有很好的抑制作用；相反，化合物6e,6j,6i,6n,6p等化合物却有一定的刺激作用，加速了炎症因子的产生；从构效关系上表明，当r1基团上芳基上连接有给电子基团时有较好的抑制作用，当r1基团上芳基上连接有吸电子基团时反而有毒副作 用；

进一步，对化合物6b进行浓度依赖的实验结果表明(如图2所示)，化合物6b能够浓度依赖的抑制tnf-α的产生，其ic50为1.26um.，表明化合物6b具有一定的tnf-α抑制的能力，可进一步用于作为先导化合物制备口服的小分子的tnf-α抑制剂，用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。