1.含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6,其特征在于:所述先导RNA为先导RNA1,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述先导RNA对应的双链DNA序列插入到重组真核表达载体AAV-U6的BbsI酶切位点之间;其中,所述重组真核表达载体AAV-U6是在真核表达载体AAV的NotI酶切位点之间插入U6-BbsI-CMV-mcherry片段得到的,U6-BbsI-CMV-mcherry片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
2.根据权利要求1所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6,其特征在于:所述重组真核表达载体AAV-U6的构建方法,包括以下步骤:
1)PCR扩增U6启动子:以PX335质粒为模板设计引物对,同时下游引物的末端带有与CAG Enhancer序列互补的一段同源臂,其中,引物对为:
U6-F-NotI:
U6-R-BbsI:
进行PCR扩增,纯化得到NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段,其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示;
2)PCR扩增mcherry表达盒:以pmCherry为模板设计引物对,mCherry核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,其中,上游引物带有与NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT序列末端相同的一段同源臂,下游引物带有NotI酶切位点;使用的引物序列如下:
CMV-CAG-F-BbsI:
CMV-terminator-R-NotI:
PCR扩增纯化得到CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段,其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示;
3)融合PCR扩增U6-BbsI-CMV-mcherry;
以NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段和CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段作为模板进行融合PCR;其中,引物对为:
U6-F-NotI:
CMV-terminator-R-NotI:
PCR扩增纯化得到U6-BbsI-CMV-mcherry片段,其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示;
4)酶切:NotI酶切载体pAAV和片段U6-BbsI-CMV-mcherry,酶切后纯化线性化的载体和片段;
5)连接:用T4连接酶连接线性化的载体和片段,并转化大肠杆菌感受态Stbl3,挑取克隆并提质粒测序,鉴定正确即得到重组真核表达载体AAV-U6。
3.根据权利要求2所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6,其特征在于:所述步骤1)中,PCR反应体系如下:
PCR的条件如下:
;
所述步骤2)中,PCR反应体系如下:
CMV-CAG-F-BbsI:
CMV-terminator-R-NotI:
PCR的条件如下:
;
所述步骤3)中,PCR反应体系如下:
PCR的条件如下:
4.一种权利要求1所述含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。