技术领域本发明涉及微生物技术领域，特别是指一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其制备的微生物菌剂在防治烟草白粉病中的应用。
背景技术：
烟草(Nicotianatabacum)属于茄科，一年生草本植物。目前，全国烟草种植面积达100万hm2-120万hm2，烟叶产量160万-220万吨，位居世界首位。烟草白粉病(Erysiphecichoracearum)是一种常见病害，俗称“上灰”、“下霜”，由植株下向上发展，发病株率常达100％，发病叶率一般10％-20％,严重得可达60％以上。其主要症状表现为：感病初产生白色粉状小点，点扩为白斑，布满整个叶片，病叶由绿变为褐，后枯死，着生白粉层，即病原菌的分生孢子梗、分生孢子。我国烟草白粉病危害严重的省份主要有云南、贵州等，每年造成的直接经济损失超过1亿元。一些化学药剂如三唑酮、己唑醇等具有一定的防治烟草白粉病的效果，但随着化学农药的残留和环境污染等问题日趋突出，研发和应用对人、动植物及环境没有危害的微生物菌剂受到广泛关注。利用拮抗微生物防治农作物病害具有低毒或无毒、低残留或零残留、低污染等优点，不易产生抗药性，且对病原微生物有拮抗作用、抑菌广谱性，这样进行的筛选、制备方法已经出现，但是目前对烟草白粉病的生物防治的研究还很少，尤其是对一些药用植物的研究还有待进一步开发。本发明旨在筛选出一种能高效拮抗烟草白粉病的微生物菌株，并制成微生物菌剂，通过生物防芽孢治的方法降低烟草白粉病的危害。目前解淀粉芽孢杆菌的研究不断增多，其代谢产物丰富，产生多种表面活性物质，如专利CN101935633A(申请日2010.07.06)公开了一种产生物表面活性剂的解淀粉芽孢杆菌在油泥洗脱中的应用，实现回收沉积于污泥中的原油与减少油泥危害；另外如专利CN104630086A(申请日2014.11.20)中公开了解淀粉芽孢杆菌RL263对稻瘟病有高效的防治作用，专利CN103937727A(申请日2014.05.06)公开了一种抗烟草普通花叶病毒的解淀粉芽孢杆菌Z5，专利CN104711209A(申请日2015.02.09)公开了一种用于防治烟草青枯病的解淀粉芽孢杆菌B001，这些专利均表现其主要研究是应用于抑制真菌和细菌活性等方面，而且对烟草黑胫病菌、烟草赤星病菌、烟草立枯病菌的有抑制、防治的解淀粉芽孢杆菌都有见专利申请公开。但尚未发现对烟草白粉病病菌有抑制、防治的解淀粉芽孢杆菌，本发明开发的一种微生物菌剂，能对烟草白粉病达到有效的防治作用。
技术实现要素：
本发明的目的是减少化学农药来防治烟草白粉病造成的环境污染、人畜病害，提供一种从药用植物马比木(Nothapodytespittosporoides)中分离获得的解淀粉芽孢杆菌菌株，以及利用该菌株制备的微生物菌剂，用于对烟草白粉病的防治。本发明的技术方案是：本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌株，是2014年由贵州大学贵州省生化工程中心从药用植物马比木(Nothapodytespittosporoides)中分离获得的，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2015年9月21日，保藏编号为CCTCCNO:M2015528。本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株具有下述性质：菌落形态特征：革兰氏阳性菌，在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，边缘不规则，在LB培养基上不产色素，生长温度为28～30℃。见附图1-1、1-2。生理生化特征：过氧化氢酶反应阳性；水解淀粉；乙酰甲基甲醇阳性；硝酸盐还原阳性；D-葡萄糖阳性；甘露醇阳性。分子生物学特征：采用细菌通用引物27F和1492R对细菌16sRNA基因序列进行PCR扩增，将PCR扩增产物由立菲生物技术有限公司完成测序，并提交序列于NCBI获得Genbank登录号为KU761585。本发明所述解淀粉芽孢杆菌菌D1的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1-5‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2～4min，无菌水冲洗2～3次；0.1-0.5％升汞表面消毒1～3min，后用无菌水冲洗3～4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4～6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于22-30℃恒温培养1～3天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，22-30℃下培养2～4d，观察没有污染后，贴好标签放于0～5℃的冰箱中保存，即得D1菌株。更具体地，本发明解淀粉芽孢杆菌菌株D1的分离培养方法是：(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1‰的吐温-80无菌水将材料洗2～3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2～4min，无菌水冲洗2～3次；0.1％升汞表面消毒1～3min，后用无菌水冲洗3～4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4～6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于28℃恒温培养1～3天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，28℃下培养2～4d，观察没有污染后，贴好标签放于4℃的冰箱中保存，即得D1菌株。本发明还提供了由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)D1菌株和PD培养基培养获得的一种微生物菌剂。具体地，所述的一种微生物菌剂制备方法，包括以下步骤：步骤1：将活化的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，20-32℃、100-200r/min摇床培养18-30h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，26-36℃、100～150r/min发酵培养24-60h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，26-36℃、100-200r/min发酵培养24-60h，即得微生物菌剂。进一步地，本发明的菌剂经下列步骤得到：步骤1：将活化的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，28℃、120r/min摇床培养24h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，32℃、120r/min发酵培养48h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，32℃、150r/min发酵培养48h，即得微生物菌剂。本发明的再一目的是提供该解淀粉芽孢杆菌菌株D1及其微生物菌剂在防治烟草白粉病中的应用。本发明的有益效果：(1)本发明从药用植物马比木的根中分离筛选出对一种解淀粉芽孢杆菌菌株D1，与供试其他菌株相比，对烟草白粉病具有显著抑制的作用，为防治烟草白粉病提供了一种新的微生物菌株。(2)本发明提供了解淀粉芽孢杆菌菌株D1的微生物菌剂及其发酵方法；接种菌株的发酵液具有明显区别，见附图2-1、2-1；制成的微生物菌剂可应用于植物细菌和真菌病害的防治，“云烟87”的田间实验表明，菌株D1制成的菌剂对烟草白粉病具有明显的抑制作用，抑菌谱广，抑菌活性强，为微生物杀菌剂的开发增添了新的途径。(3)具有一定的促生作用：与供试其他菌株相比，喷施该菌剂能有效抑制烟草白粉病的发生，烟苗的株高、鲜重、干重都有显著优势，从而提高烟草的产量。(4)零毒零污染：本发明的微生物菌剂由解淀粉芽孢杆菌、PD培养基组成，制备容易，无毒、无害、防治效果好，利于绿色有机中药材的种植。附图说明图1-1为D1菌株革兰氏染色特征图(10×100倍放大)；图1-2为D1菌株菌落形态特征图(直径9cm培养皿)；图2-1为未接种D1菌株发酵液图；图2-2为接种D1菌株PD发酵液图；图3为施用编号D1-1的微生物菌剂5次处理结束后的烟草图；图4为施用清水的对照处理烟草图。具体实施方式为了更具体地说明本发明的技术方案，本发明还作出了如下部分试验，旨在进一步说明本发明，而不是对本发明的限定。试验例：解淀粉芽孢杆菌D1菌剂的田间应用在贵州省贵州大学农业生物工程研究院实验大棚，将本发明微生物菌剂以及其他微生物菌剂对“云烟87”进行田间试验，将所述微生物菌剂喷施于烟草叶片上，以清水为空白对照，化学药物喷施作为对照组，单株小区，9次重复，每7天喷一次药，共喷5次，统计烟草白粉病的发病情况。试验组1-3：施用实施例4-6制备的微生物菌剂，编号D1-1、D1-2、D1-3；试验组3-4：施用从马比木获取的菌株H1、H2制备成的菌剂，编号为H1、H2；对照组1：施用2％抗霉菌素水剂200倍液；对照组2：施用可喷15％粉锈宁1000倍液；空白对照组：施用同等量的清水。编号为CK；调查方法：单株小区，记录每个处理烟叶总数、各级病叶数，并根据病叶分级计算病情指数和相对防效。白粉病叶片分级标准：0级：无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积5％以下；3级：病斑面积占整个叶面积6％～10％；5级：病斑面积占整个叶面积11％～20％；7级：病斑面积占整个叶面积21％～40％；9级：病斑面积占整个叶面积40％以上。病情指数＝[Σ(各级病株或叶数×该病级值)/(调查总株或叶数×最高病级值)]×100相对防效(％)＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100表1喷施不同微生物菌剂对“云烟87”白粉病病情指数(％)表2喷施不同微生物菌剂对“云烟87”白粉病相对防效(％)注：“-”无防效作用。试验结果显示，本发明获得的微生物菌剂对“云烟87”白粉病具有显著的防治效果，其防治效果见附图3、4。实施例1：D1菌株的培养方法(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用1‰的吐温-80无菌水将材料洗2次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡4min，无菌水冲洗3次；0.1％升汞表面消毒1min，后用无菌水冲洗3次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径4mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于22℃恒温培养1天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，22℃下培养2d，观察没有污染后，贴好标签放于4℃的冰箱中保存，即得D1菌株。实施例2：D1菌株的培养方法(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用3‰的吐温-80无菌水将材料洗3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡2min，无菌水冲洗2次；0.3％升汞表面消毒3min，后用无菌水冲洗4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于28℃恒温培养1天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，28℃下培养4d，观察没有污染后，贴好标签放于4℃的冰箱中保存，即得D1菌株。实施例3：D1菌株的培养方法(1)马比木植物组织的准备：取新鲜马比木的根，在自来水下冲洗干净；(2)表面消毒及无菌检测：在超净工作台上，用5‰的吐温-80无菌水将材料洗3次，再用无菌水洗至无泡沫，用无菌滤纸吸去表面水分；用75％的酒精浸泡3min，无菌水冲洗3次；0.5％升汞表面消毒3min，后用无菌水冲洗4次，收集最后一次冲洗水进行微生物检测，无菌方可，无菌滤纸吸干多余水分；将材料切或剪成直径6mm大小的组织切段；(3)内生细菌的分离纯化：将步骤(2)消毒后的组织切段接种于PDA培养基平板上，于30℃恒温培养2天，选择对内生真菌有拮抗作用的细菌菌落，挑取其划线纯化2～3次，然后以接种针挑取纯化后的菌落划线接种于PDA固体斜面培养基上，30℃下培养3d，观察没有污染后，贴好标签放于5℃的冰箱中保存，即得D1菌株。实施例4：微生物菌剂的制备步骤1：将活化的按照实施例1-3任一方法获得的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，20℃、100r/min摇床培养30h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，26℃、100r/min发酵培养60h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，30℃、100r/min发酵培养60h，即得微生物菌剂。实施例5：微生物菌剂的制备步骤1：将活化的按照实施例1-3任一方法获得的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，28℃、120r/min摇床培养24h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，32℃、120r/min发酵培养48h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，32℃、150r/min发酵培养48h，即得微生物菌剂。实施例6：微生物菌剂的制备步骤1：将活化的按照实施例1-3任一方法获得的解淀粉芽孢杆菌D1菌株接种于200mL的PD培养基中，32℃、200r/min摇床培养18h，得到一级种子液；步骤2：将步骤1得到一级种子液，接种于10L的PD培养基中，36℃、150r/min发酵培养24h，得到二级种子液；步骤3：将步骤2得到二级种子液，接种于80L的PD培养基中，36℃、200r/min发酵培养24h，即得微生物菌剂。