本发明涉及微生物活性物开发利用领域，具体涉及一株芽孢杆菌菌株的活性，以及发酵制备生物活性组分的工艺方法，及其产物在新药开发方面的应用。
背景技术：
一株芽孢杆菌hz16显示了针对军团菌属独特的高选择抑制活性。不同于一般芽孢杆菌产生广谱抗生素的特点，该株菌对军团菌属以外的革兰氏阳性及阴性菌的抑制活性太弱或未检出。广谱抗生素的缺点是在作用于一种微生物的同时还可能杀死其它有益或无害的微生物，并在形成耐药性时产生普遍的耐药性，为今后其它疾病的治疗带来困难。
芽孢杆菌属是芽孢杆菌目芽孢杆菌科最大的一属，也是产生医用抗生素的三个主要来源之一。外界环境对微生物次生代谢产物的产生有很大的影响，不同的发酵培养条件可以产生不同结构，不同生物活性的化合物。为了得到更有价值的活性物，必须对菌株和发酵条件进行摸索和研究。
技术实现要素：
本发明首次证明了该株芽孢杆菌代谢产物的抑制军团菌活性，并对其产生较强活性的发酵条件进行研究。利用生物质资源的可再生、易获得、成本低、无污染等特点，开展生物制药的研发。为实现上述目的，本发明拟采用如下方案：
本发明一方面涉及一株能够产抗军团菌活性物的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.12406。本发明另一方面还涉及使用上述芽孢杆菌制备抗军团菌活性物的应用，优选的，所述的抗军团菌活性物能够用于制备治疗肺炎药物。
本发明另一方面涉及从芽孢杆菌hz16制备抗军团菌活性物的方法，所述的制备方法包括以下步骤：
将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到培养基上，发酵后获得固体培养菌落，接种到摇瓶培养基发酵获得发酵液，将发酵获得的产物冷冻干燥除掉水分，用有机溶剂提取获得粗提物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基ph值为4-8或者为4、5、6、7、8。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的培养基为lb、复合培养基、pda、查氏、m2、m250％sw、高氏等。
培养基配方：
复合培养基(g/l)：氯化钙0.5，磷酸二氢钾(kh2po4)0.1，氯化钾(kcl)0.05，硫酸镁(mgso4)0.1，葡萄糖20.0，蛋白胨15。
pda培养基(g/l)：土豆200，葡萄糖200，1.1％琼脂。
查氏培养基(g/l):蔗糖30，nano33，k2hpo41，feso40.01，kcl0.5，mgso4·7h200.5。
m2培养基：麦芽提取物10，葡萄糖4，酵母提取物4。
m250％sw培养基：麦芽提取物10，葡萄糖4，酵母提取物4，柠檬酸铁0.05，nacl9.725，mgcl2·6h2o4.4，na2so41.72，cacl20.9，磷酸氢钠0.01，sio20.0075。
高氏培养基(g/l)：淀粉20，kno31，k2hpo40.5，mgso4·7h200.5，nacl0.5，feso4·7h200.01。
lb培养基(g/l)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，nacl10。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的发酵温度为25、28、30、32摄氏度。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的发酵时间为1～5天。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的摇瓶培养静置、转速100、180、230r/min。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的有机溶剂使用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇。
本发明首次证明了该株菌的代谢产物的抑制军团菌活性，以该活性作为评估标准对该菌株产生较强活性的发酵条件进行研究。旨在提供一种利用芽孢杆菌生产抑制军团菌活性物的新方式，为进一步寻找和开发有效的肺炎治疗药物提供科学依据。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行详细说明。但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
微生物信息
芽孢杆菌hz16是由实验室中污染的军团菌平板上分离纯化得来，显示出特有的针对军团菌属的高选择活性，对所有被检测军团菌(l.pneumophilaphil.ljr32；l.pneumophilacorby；l.gormanii；l.dumoffii；l.micdadei；l.israelensis；l.jordanis；l.hackeliae；l.longbeachae)均显示出抑制活性，而军团菌属以外的其他革兰氏阳性菌(listeriamonocytogenes；bacillusmegaterium；streptococcuspneumoniae；staphylococcusaureus；mycobacteriumavium)及阴性菌(klebsiellaaerogenes；escherichiacolihb101；yersiniapseudotuberculosisypiii；pseudomonasaeruginosapao1；ralstoniaeutrophajmp134；burkholderiacepacialc21-3b；erwiniacarotovora；agrobacteriumtumefaciens；xanthomonascampestris；acinetobactersp.)的抑制活性太弱或未检出。
芽孢杆菌hz16保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.12406，保藏日期为2016年4月28日，分类命名为芽孢杆菌bacillussp.。
实施例1：
芽孢杆菌hz16中抑制军团菌活性物的制备方法按照如下步骤制备：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的lb固体培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌种接种到装有150毫升ph为5的lb培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，180r/min的条件下培养1天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、通过使用kirby-bauer(k-b)纸片扩散法验证实施例1中得到的生物活性肽具有高选择性的抑制军团菌的生物活性。
将步骤五中得到的待检测粗提物溶解于dmso中，制成50μg/ml的溶液。在无菌环境下将20μl待测样品的溶液滴加在灭菌后的纸片上。使用dmso作为空白对照，红霉素纯品作为阳性对照。dmso空白无抑制效果，红霉素抑制圈20mm。在bcye琼脂培养基(酵母粉10.0g/l，aces缓冲液10.0g/l，活性炭2.0g/l，α-酮戊二酸1.0g/l，琼脂15.0g/l，ph6.85)上加1ml菌液，用无菌的涂布棒涂布均匀，贴上加好样品溶液的纸片后在37℃，5％co2培养箱培养48h，进行观察发现20mm的抑制圈。
实施例2：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的lb培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的m250％sw培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其48小时抑制圈大小22mm。
实施例3：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的高氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的高氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其48小时抑制圈大小18mm。
实施例4：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的高氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的高氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其48小时抑制圈大小25mm。
实施例5：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的查氏培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的查氏培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其48小时抑制圈大小17mm。
实施例6：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的lb培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有150毫升ph为8的lb培养基的300毫升锥形瓶中；
步骤三、将接种好的摇瓶放置在生物培养箱中，在28摄氏度，200r/min的条件下培养4天基发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其48小时抑制圈大小24mm。
实施例7：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为8的m2培养基上，在28摄氏度下培养4天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，200r/min的条件下培养6天基发酵获得发酵液；
步骤四、每24小时取样一次，利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试。24小时发酵产物抑制圈大小20mm；48小时产物抑制圈大小23mm；72小时产物抑制圈大小20mm；96小时产物抑制圈大小21mm；117小时产物抑制圈大小18mm；137小时产物抑制圈大小15mm。
实施例8：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为6的lb培养基上，在28摄氏度下培养2天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为6的lb培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，200r/min的条件下培养5天基发酵获得发酵液；
步骤四、每24小时取样一次，利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试。24小时发酵产物抑制圈大小16mm；48小时产物抑制圈大小17mm；72小时产物抑制圈大小16mm；96小时产物抑制圈大小21mm；117小时产物抑制圈大小19mm；137小时产物抑制圈大小13mm。
实施例9：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的m2培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，100r/min、200r/min、300r/min的转速下培养1天发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其24小时100r/min发酵产物抑制圈大小18mm；200r/min抑制圈大小24mm；300r/min抑制圈大小20mm。
实施例10：
步骤一、在无菌条件下将纯化得到的芽孢杆菌hz16接种到ph为5的m2培养基上，在28摄氏度下培养1天培养获得白色的固体菌落；
步骤二、将固体菌丝接种到装有7升ph为8的m2培养基的发酵罐中；
步骤三、在28摄氏度，100r/min、200r/min、300r/min的转速下培养5天发酵获得发酵液；
步骤四、利用冷冻干燥技术除掉水分，对获得的固体干重进行比较；
步骤五、用有机溶剂乙酸乙酯提取获得粗提物，浓缩备用；
步骤六、将粗提物用dmso溶解制成50μg/ml的溶液进行如实施例1中步骤六相同的抑制军团菌活性测试，其16小时100r/min发酵产物抑制圈大小20mm；200r/min抑制圈大小23mm；300r/min抑制圈大小21mm。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。