本发明属于医药
技术领域：
。具体地，本发明特别涉及一种环烃基取代的甲磺酰基苯甲酰胺衍生物及其制备方法和作为钠离子通道(特别是Nav1.7)抑制剂的应用，以及由其制备的药物组合物和药用组合物。
背景技术：
：最近，英国的Cox等在Nature上首次报道了编码电压门控Nav1.7通道的SCN9A基因突变导致遗传个体无痛症的出人意料研究结果。该遗传突变的个体先天失去痛觉，但机体的其它功能完全正常，此外最近的研究表明，表达在DRG神经元的电压门控Nav1.7通道参与痛信号的产生并发挥控制痛觉信号传入的闸门功能。该研究提示Nav1.7通道可能会成为选择性治疗疼痛并无副作用的药物靶点。Nav1.7(PN1，SCN9A)VGSC对河豚毒素的阻断敏感，其主要表达于末梢交感神经元和感觉神经元。SCN9A基因已由多种物种(包括人类、大鼠及兔)复制，并且显示人与大鼠基因之间的氨基酸有约90％的一致性。越来越多的身体证据表明Nav1.7在多种疼痛状态(包括急性、慢性、炎性和/或神经性疼痛)中扮演重要的角色，在人类中，Nav1.7蛋白质积累于神经瘤，特别是引起疼痛的神经瘤。Nav1.7功能增加的突变(不论是遗传性或偶发性)已被认为涉及原发性红斑性肢痛(一种特征为四肢的灼痛和发炎的疾病)，和突发性极度疼痛症。有关非选择性钠通道阻断剂利多卡因和美西律可缓和遗传性红斑性肢痛的症状，以及卡马西平可有效地减低PEPD的侵袭的次数和严重度的报道结果与上述观察相一致。Nav1.7在疼痛中扮演的角色的其他证据可见于SCN9A基因的功能丧失的突变的显型。后续的研究已显示会导致SCN9A基因的功能丧失与CIP显型的许多不同的突变。由于Nav1.7特异地在DRG感觉神经元表达而不在心肌细胞和中枢神经系统等其它组织表达，因此研发其特异阻断剂用于治疗慢性痛，不仅可能提高疗效，且副作用也会大大减少，并且Nav1.7离子通道的选择性抑制剂几乎可用于各种疼痛的治疗。此外，该蛋白家族的成员之一的Nav1.5和Nav1.2也是重要的一类离子型通道，NaV1.5主要在心肌细胞中表达(Raymond,C.K.等,op.cit.)，包括心房、心室、窦房结、房室结和心脏浦肯野纤维。心脏动作电位的迅速升支和通过心脏组织的迅速脉冲传导由于NaV1.5的开启。NaV1.5功能的异常可导致多种心律失常的形成。人体NaV1.5的突变导致多种心律不齐综合征，包括，例如，长QT3(LQT3)、Brugada综合征(BS)、遗传性心脏传导缺陷、突发性猝死综合征(SUNDS)和婴儿猝死综合征(SIDS)(Liu,H.等,Am.J.Pharmacogenomics(2003),3(3):173-9)。已经将钠通道阻断剂治疗广泛用于治疗心律失常。因此抑制Nav1.5通道会产生心脏毒性。此外NaV1.2在大脑中高度表达(Raymond,C.K.等,J.Biol.Chem.(2004),279(44):46234-41)并且对正常的大脑功能是重要的。因此抑制Nav1.2通道会对大脑产生抑制毒性。因此，鉴于目前可用药剂有限的效力和不可接受的副作用，迫切需要开发更加安全有效的镇痛药，使其具有较高功效和较少副作用。而Nav1.7离子通道是开发无成瘾性镇痛药物的重要靶标，开发具有Nav1.7离子通道高度选择性且具有良好药代动力学特征的抑制剂十分必要。技术实现要素：本发明的目的是提供一种Nav1.7离子通道选择性抑制剂及其在医药上应用。本发明第一方面，提供一种式(I)所示的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药：式中，R1为氟或氯；R2为环丙基或环己烯基；n为0或1；Z为N或CR7；R3、R4、R5、R6、R7各自独立地为氢、卤素、卤代C1-20烷基、C1-20烷氧基、卤代C1-20烷氧基。在另一优选例中，R1为氟；R2为环丙基。在另一优选例中，Z为CR7，R7的定义如前所述。在另一优选例中，n为1。在另一优选例中，R3、R4、R5、R6、R7各自独立地为氢、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基。在另一优选例中，R6为氢。在另一优选例中，Z为CR7；R3、R4、R5、R6、R7各自独立地为氢、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；且R3、R4、R5、R6、R7中的三个为氢。在另一优选例中，Z为CR7；R3、R4、R5、R7各自独立地为氢、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；R6为氢，且R3、R4、R5、R7中的两个为氢。在另一优选例中，Z为CR7；R3、R5和R6为氢；且R4和R7各自独立地为氟、氯、三氟甲基、或三氟甲氧基。在另一优选例中，Z为CR7；R3、R5和R6为氢；且R4为各自独立地为氟、氯、三氟甲基、或三氟甲氧基，且R7为氯。在另一优选例中，Z为N。在另一优选例中，Z为N；R3、R4、R5、R6各自独立地为氢、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基；且R3、R4、R5、R6中的两个为氢。在另一优选例中，Z为N；R3、R6为氢；R4、R5各自独立地为氢、氟、氯、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、三氟甲氧基、三氟乙氧基、三氟甲基。在另一优选例中，所述化合物为本申请实施例所制备的化合物：本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述组合物包括本发明第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药；以及药学可接受的载体。本发明第三方面提供了如本发明第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药，或本发明第二方面所述药物组合物在制备治疗疾病或病症的药物中的应用。在另一优选例中，所述疾病或病症选自疼痛、抑郁症、心血管疾病、呼吸系统疾病、精神疾病或其组合。在另一优选例中，所述疾病或病症选自与HIV相关的疼痛、HIV治疗诱导的神经病变、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、急性疼痛、热敏感、结节病、肠易激综合征、g罗恩病、与多发性硬化(MS)有关的疼痛、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、糖尿病性神经病变、周围神经病变、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、突发性张力障碍、肌无力综合征、肌强直、恶性高热、囊性纤维化、假性醛固酮增多症、横纹肌溶解症、甲状腺功能减退、双相抑郁症、焦虑症、精神分裂症、钠通道毒素相关病症、家族性红斑性肢痛症、原发性红斑性肢痛症，家族性直肠疼痛、癌症、癫痫、局部和全身强直性发作、不宁腿综合征、心律失常、纤维肌痛、在由中风或神经损伤导致的缺血性疾病状态下的神经保护、快速性心律失常、心房颤动和心室颤动。在另一优选例中，所述疼痛选自神经性疼痛、炎性疼痛、内脏疼痛、癌症疼痛、化疗疼痛、创伤疼痛、手术疼痛、手术后疼痛、生产疼痛、分娩疼痛、牙痛、慢性疼痛、持续性疼痛、外周介导的疼痛、中枢介导的疼痛、慢性头痛、偏头痛、窦性头痛、紧张性头痛、幻肢痛、周围神经损伤、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、急性疼痛、家族性红斑性肢痛症、原发性红斑性肢痛症、家族性直肠疼痛或纤维肌痛或其组合。本发明第四方面提供了一种治疗哺乳动物疾病或病症的方法，所述方法包括给需要的对象(如哺乳动物)施用治疗有效量的本发明第一方面所述的化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体或前药，或本发明第二方面所述的药物组合物。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为大鼠冷痛觉测试基线图。图2为化合物Z-2的使用单因素方差分析附加Dunnett多重比较检验结果图。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了本发明的环烃基取代(特别是环丙基取代)的甲磺酰基苯甲酰胺衍生物不仅对Nav1.7具有较高的抑制活性，同时对Nav1.5和Nav1.2的抑制活性明显较弱，具有明显的选择抑制活性。同时在疼痛模型测试中还显示出明显的镇痛效果，在药代动力学研究中具有明显的药代吸收效果和良好的生物利用度，并且具有明显的代谢稳定性。因此本发明的系列化合物可开发成用于广泛疼痛的治疗的药物。在此基础上，发明人完成了本发明。术语定义如本文所用，“C1-20烷基”指包含1至20个碳原子的直链和支链的饱和的脂族烃基，如下定义类似；更优选为C1-10烷基，非限制性的例子包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等；更优选为C1-6烷基，最优选为C1-3烷基。如本文所用，“部分不饱和”是指含有一个或多个不饱和键但不具有完全共轭的π电子系统。如本文所用，“C1-20烷氧基”指-O-(C1-20烷基)，其中烷基的定义如上所述。优选C1-10烷氧基，更优选C1-6烷氧基，最优选C1-3烷氧基。非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基等。如本文所用，“卤素”指氟、氯、溴或碘。如本文所用，“卤代”指基团中一个或多个(如1、2、3、4或5个)氢被卤素所取代。例如，“卤代C1-20烷基”指烷基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)卤素取代，其中烷基的定义如上所述。优选为卤代C1-10烷基，更优选为卤代C1-6烷基，最优选为卤代C1-3烷基。卤代C1-20烷基的例子包括(但不限于)一氯乙基、二氯甲基、1,2－二氯乙基、一溴乙基、一氟乙基、一氟甲基、二氟甲基、三氟甲基等。又例如，“卤代C1-20烷氧基”指烷氧基被一个或多个(如1、2、3、4或5个)卤素取代，其中烷氧基的定义如上所述。优选为卤代C1-10烷氧基，更优选为卤代C1-6烷氧基，最优选为卤代C1-3烷氧基。包括(但不限于)三氟甲氧基、三氟乙氧基、一氟甲氧基、一氟乙氧基、二氟甲氧基、二氟乙氧基等。如本文所用，“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1～5个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。制备方法本发明提供了式(I)化合物的制备方法，本发明中的化合物可以通过多种合成操作容易地制备，这些操作是所属领域技术人员熟练掌握的。这些化合物的示例性制备方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。本发明式(I)化合物可以参照下述合成路线进行制备，在具体操作过程中，可以根据需要对方法中的步骤进行扩展或合并。路线1步骤1：在碱体系的存在下，通过式(I-b)化合物中所具有的亲核性质的反应基团(如OH等)与式(I-a)化合物发生取代反应(例如亲和取代反应等)生成式(I-c)化合物，合适的碱体系包括存在于DMSO的叔丁醇钾、存在于DMF中的氢化钠、存在于DMF的碳酸钾等，式(I-a)中的Lev为离去基团，包括(但不限于)三氟甲磺酸酯；氯、溴、碘；磺酸酯基，如甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、对溴苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯等；酰氧基，如乙酰氧基、三氟乙酰氧基等。X为氯、溴或碘。步骤2：式(I-c)化合物通过基团X与环烃基硼酸酯或者硼酸在一定温度下，使用合适的催化剂及适当的溶剂进行反应，生成化合物I。使用Suzuki方法，所用的钯催化剂可以是但不限于PdCl2(dppf)、醋酸钯，所用的碱可以是但不限于碳酸钾或碳酸铯。所用的配体可以是但不限于三环己基膦。路线2式(I-a)化合物可通过Suzuki反应得到式(I-d)化合物，随后与式(I-b)化合物发生取代反应生成式I化合物，各步骤的反应条件及基团定义同路线1。上述制备方法中，式(I-b)化合物可市购或通过本领域技术人员已知的方法制备。式(I-a)化合物可通过以下两种示例方法合成，方法1以式(I-a-1-1)化合物为起始原料，依次通过取代、缩合、溴代、取代、水解和酰化反应得到式(I-a-1)化合物，其中各步骤均为本领域技术人员所熟知的常规反应。方法2以式(I-a-2-1)化合物为起始原料，依次通过取代、缩合反应得到式(I-a-2)化合物，其中各步骤均为本领域技术人员所熟知的常规反应。以上各步骤中的反应均是本领域技术人员已知的常规反应。如无特殊说明，合成路线中所使用的试剂和原料化合物均可市购得到，或本领域技术人员根据所设计的不同化合物结构参考已知方法制备得到。与现有技术相比，本发明的主要优点在于：本发明系列化合物对Nav1.7的抑制活性高，同时对Nav1.5和Nav1.2的抑制活性较弱，对Nav1.5和Nav1.2均具有选择抑制活性。本发明系列化合物是具有统计学意义的抑制冷刺激痛觉超敏的效果。本发明系列化合物不仅具有明显的药代吸收效果和良好的生物利用度，并且具有明显的代谢稳定性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，本文所用的术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或同等的方法及材料皆可应用于本发明中。如本文所用，DMB为2,4-二甲氧基苄基，THF为四氢呋喃，EA为乙酸乙酯，PE为石油醚，Ac2O为乙酸酐，NBS为N-溴代琥珀酰亚胺，DCM为二氯甲烷，AIBN为偶氮二异丁腈，Pd(dppf)Cl2为1,1'-双(二苯基磷)二茂铁]二氯化钯，TFA为三氟乙酸，TBSCl为叔丁基二甲基氯硅烷，NCS为N-氯代丁二酰亚胺，DHP为二氢吡喃，LiAlH4为氢化铝锂，PMB为对甲氧基苄基，LiHMDS为二(三甲基硅基)氨基锂，Pd2(dba)3为三(二亚苄基丙酮)二钯，RuPhos为2-二环己基磷-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯,DMAP为4-二甲氨基吡啶，THP为四氢吡喃，n-BuLi为正丁基锂，TMsOTf为三氟甲磺酸三甲基硅酯，TEBAC为三乙基苄基氯化铵，HATU为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，DMF为二甲基甲酰胺，DMSO为二甲基亚砜，DIEA为N,N-二异丙基乙胺，BINAP为(2R,3S)-2,2'-双二苯膦基-1,1'-联萘。如本文所用，室温是指约为20-25℃。化合物1-a的制备方法：步骤a:向化合物1-a-1(41.7g,0.271mol)部分溶解在二氯甲烷(500ml)的溶液中加入液溴(103.8g,0.65mol)，处于氮气保护状态下分批次加入铁粉(46.2g,0.82mol)，加热到40℃，搅拌24小时，冷却至室温，10％的保险粉水溶液(200ml*3)洗涤，分液，水相用EA(100ml*3)萃取，饱和食盐水(50ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得到一黑色固体(45g)，加入乙酸乙酯打浆得到化合物1-a-2(45g,产率：71％)呈白色固体；ESI-MS:233.0(M+H)+。步骤b:向装有化合物1-a-2(26g,0.112mmol)，甲磺酰胺(16.34g,0.172mol),EDCI(32.93g,0.172mol)，DMAP(21g,0.172mol)的反应瓶中加入二氯甲烷(270ml)，N2保护，室温过夜，水(100ml)淬灭，HCl(1M)调pH＝1～2，DCM(3*150ml)，饱和食盐水(100ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，滤液旋干得到白色固体化合物1-a-3(22.5g,产率65％)。ESI-MS:310.7(M+H)+。步骤c:在氮气保护下，向化合物1-a-3(22.5g,0.073mol)，NBS(16.8g,0.094mol)的混合物中加入二氯乙烷(250ml)，升温至80℃，反应液逐渐澄清，将溶解AIBN(238mg,1.45*10-3mmol)的二氯乙烷溶液滴加到上述反应液中，过夜反应。冷却至室温，保险粉水溶液(10％，100ml)淬灭，分液，水相乙酸乙酯(3*150ml)萃取，中氨水(150ml)和甲醇(100ml)的混合溶液中加入上述反应液，允许反应液升至室温，搅拌10分钟，乙酸乙酯(100ml*3)萃取，合并有机相，饱和食盐水(50ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到27g粗品，乙酸乙酯打浆得到化合物1-a-4(5.2g，收率：18％)。ESI-MS：389.9(M+H)+。步骤d:在N2保护，向化合物1-a-4(5.2g，1.34*10-2mol)醋酸钾(2.62g，2.68*10-2mol)的混合物中加入DMF(25ml)，加热到80℃，搅拌过夜。冷却至室温，乙酸乙酯(200ml)稀释，水(10ml*7)洗涤，饱和食盐水(10ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到化合物1-a-5(3.0g，收率：61％)，为一白色固体。ESI-MS：363.0(M+Na)+。步骤e:在N2保护下，向化合物1-a-5(3.68g,10mmol)和环丙基硼酸(1.28g，15mmol)的甲苯(40ml)悬浊液加入磷酸钾(9.5g，45mmol)的水(10ml)悬浊液，搅拌约3～4分钟，然后三环己基膦氟硼酸盐(3.68g，10mmol)和醋酸钯(225mg，1mmol)依次加入上述反应液中，加热至110℃，搅拌过夜，降至室温，水(50ml)淬灭反应液，乙酸乙酯(100ml)稀释，硅藻土过滤，分液，盐酸(1mol/L)酸化至pH＝2，乙酸乙酯(4*50ml)萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到油状物，制备HPLC纯化得到化合物1-a(430mg，收率14％)。ESI-MS：288.1(M+Na)+，1HNMR(400MHz,DMSO)δ:12.15(s,1H),7.28(d,J＝11.6Hz,1H)，7.22(d,J＝6.8Hz,1H)，5.5(s,1H)，4.27(s,2H)，3.36(s,3H)，1.84(m,1H),0.9(m,2H),0.67(m,2H)。化合物2-a的制备方法：步骤a:在氮气保护下，0～5℃，向装有NaH(6.4g,0.167mol)的反应瓶中加入四氢呋喃(165ml)溶液；在0～5℃，向上述浑浊液中滴加异丙醇(12.8ml，0.167mol)，滴加时间约1小时，加毕后，反应液允许升温至室温，搅拌1小时。化合物2-a-1(15.57g,0.105mol)的四氢呋喃(50ml)溶液加入上述浑浊液中，加热至60℃，搅拌过夜，在30℃，饱和氯化铵(50ml)和水(60ml)淬灭，分液，乙酸乙酯(3x50ml)萃取，饱和食盐水(20ml)洗涤，硫酸钠干燥，浓缩得到黑色液体化合物2-a-2(20.0g，收率71％)；ESI-MS:172.0(M+H)+。步骤b:向化合物2-a-2(6g，0.035mol)的乙酸乙酯(30ml)溶液中加入醋酸钠(3.2g，0.039mol)，在搅拌状态下，7℃以下，向上述浑浊液中滴加液溴(10.6g，0.042mol)，允许升室温，搅拌过夜。在5℃以下，将氢氧化钠(4.6g)和硫代硫酸钠(2g)的水溶液(20ml)滴加至反应液中(滴加时pH小于8)，分液，水相用乙酸乙酯(2x40ml)萃取，合并有机相，饱和食盐水(30ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得油状物，柱层析(硅胶：300-400目，洗脱剂：石油醚)纯化得到化合物2-a-3(5.1g，收率：58％)，为液体。ESI-MS:249.8(M+H)+。步骤c:向联硼酸频那醇酯(6.7g，2.65x10-3mol)，醋酸钾(7g，7.13x10-2mol)和PdCl2(dppf).DCM(831mg，1.02x10-3mol)的混合物加入化合物2-a-3(5.1g，2.04x10-3mol)的DMF(60ml)溶液，反应液氮气置换3次，加热到65℃，搅拌过夜，乙酸乙酯稀释(400ml)，水洗(6x30ml)，饱和食盐水(50ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得一化合物2-a-4(6.0g，粗品，收率：100％)，为一浆状物。ESI-MS:298.0(M+H)+。步骤d:在15℃，向化合物2-a-4(6.0g，0.02mol)的反应瓶中加入水(19ml)，醋酸(38ml)，过氧乙酸(1.8g，0.0236mol)，允许升至室温，氮气保护下搅拌过夜。将余下的醋酸用油泵旋掉，剩余物用乙酸乙酯(250ml)稀释，水(2x30ml)洗，饱和食盐水(20ml)洗涤，过滤，硫酸钠干燥，浓缩得一黑色油状物，柱层析(硅胶：200-300目；洗脱剂-石油醚：乙酸乙酯＝15：1)纯化得到化合物2-a(5.1g，收率：58％)，为一液体。ESI-MS:188.0(M+H)+。化合物3-a的制备方法：化合物4-a的制备方法：步骤a:向冷的的浓硫酸(120ml)中加入化合物4-a-1(23.4g，0.148mol)，待底物溶解后，保持温度在5℃以下，分批加入N-碘代丁二酰亚胺(33g，0.148mol)，加毕后维持该温度，搅拌5小时。反应液倒入剧烈搅拌的冰水(20ml)中，过滤，滤饼采用乙醇：水(1：1)打浆，过滤，得化合物4-a-2(8.0g，收率：20％)，为一粉色固体。ESI-MS:285.0(M+H)+。步骤b:二碳酸二叔丁酯(21g，0.0962mol)，4-二甲氨基吡啶(1g，8x10-3mol)依次加入得化合物4-a-2(7.2g，2.54x10-2mol)的叔丁醇(40ml)溶液中，氮气保护下，加热到60℃，搅拌过夜。乙酸乙酯稀释(300ml)，稀盐酸洗(1M，30ml)，饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，饱和食盐水(20ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤，浓缩得得化合物4-a-3(8.0g，收率：93％)，为一棕色固体。ESI-MS:362.8(M+H)+。步骤c:向化合物2-a(3.4g，1.8x10-2mol)，化合物4-a-3(6.18g，1.82x10-2mol)，碳酸钾(5.0g，3.64x10-2mol)中加入二甲亚砜(30ml)，氮气保护下室温搅拌过夜，乙酸乙酯稀释(300ml)，水(3x30ml)洗涤，饱和食盐水(20ml)洗涤，硫酸钠干燥，过滤浓缩得到化合物4-a-4(8.91g，收率：89.8％)，为一棕色固体。ESI-MS:508.0(M+H)+。步骤d:向化合物4-a-4(150mg，2.95x10-4mol)，环丙基硼酸(76mg，8.86x10-4mol)，磷酸钾(250mg，1.18x10-3mol)，四三苯基膦钯(30mg，2.95x10-5mol)中加入1,4-二氧六环(1.5ml)，氮气置换三次，加热到150℃，微波反应45分钟。LCMS显示有部分副产物为产品中的氯也被环丙级取代。乙酸乙酯稀释，硅藻土过滤，浓缩得1.7g黄色油状物，Pre-HPLC纯化，浓缩得到化合物4-a-5(0.06g，收率：50％)，为一白色浆状物。ESI-MS:421.9(M+H)+。步骤e:在0℃，向化合物4-a-5(0.5g，1.85x10-3mol)的二氯甲烷(15ml)溶液中，加入三氟乙酸(0.5ml)，允许升至室温，氮气条件下搅拌24小时。浓缩反应液得到白色固体，溶于乙酸乙酯，经纯化得到化合物4-a(0.32g，收率：73％)。ESI-MS:365.9(M+H)+，1HNMR(400MHz，DMSO)δ:13.12(s，1H),8.04(d,J＝2.4Hz，1H)，7.90(s，J＝2.8Hz，1H)，7.45(d,J＝8Hz，1H)，6.73(d,J＝11.6Hz，1H)，5.28(quint,J＝6Hz，1H)，2.10(m,1H),1.37(s,3H)，1.33(s,3H)，0.95(m,2H)，0.71(m,2H)。化合物5-a的制备方法：化合物5-a以化合物4-a-1为起始原料，参照化合物4-a的方法进行制备，不同的是将步骤c中化合物2-a换成化合物3-a。实施例14-((3-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-5-环丙基-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-1)的制备步骤1：向化合物1-a(150mg，0.522mmol)和三乙胺(106mg，1.044mmol)的5ml二氯甲烷溶液中在零摄氏度加入甲基磺酰氯(60mg，0.522mmol)，室温搅拌2小时。反应结束，反应液倒入冰水中，二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得浅黄色油状粗品化合物1-b(147mg)。直接用于下一步反应。步骤2：化合物1-b(117mg，0.32mmol)，3-氯-4-(三氟甲基)苯酚(68mg，0.32mmol)，碳酸钾(89mg，0.64mmol)加入5ml乙腈溶液中，60摄氏度搅拌2小时。反应结束，冷却至室温，反应液减压浓缩，加入10ml水，调节pH为7，二氯甲烷萃取(2×10ml)，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品。经制备液相分离纯化后得白色固体化合物Z-1(60.3mg)，产率：39.2％，MSm/z(ESI):481.9[M+H]+。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ12.23(br.s.,1H),7.54(dd,J＝9.2,1.2Hz,1H),7.49(d,J＝3.2Hz,1H),7.43(d,J＝10.8Hz,1H),7.29(d,J＝6.8Hz,1H),7.19(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),5.37(s,2H),3.37(s,3H),2.00-2.06(m,1H),0.92-1.00(m,2H),0.73-0.79(m,2H)。实施例2-3化合物Z-2和Z-3以化合物1-a为起始原料，参照实施例1的方法进行制备，不同的是将步骤2中的3-氯-4-(三氟甲基)苯酚分别换成3,4-二氯苯酚，3,5-二氯苯酚。实施例44-(5-氯-6-异丙基吡啶-3-基氧基)-5-环丙基-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-4)的制备化合物4-a(100mg，0.273mmol)，化合物6-a(52mg，0.546mmol)，HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)(104mg，0.273mmol),DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(71mg，0.546mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(4mg，0.027mmol)加入5ml二氯甲烷溶液中，室温搅拌3小时。反应结束，反应液水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品。经TLC纯化后得黄色固体化合物Z-4(21mg)，MSm/z(ESI):443.1[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.09(s,1H),8.04(d,J＝2.8Hz,1H),7.87(d,J＝2.4Hz,1H),7.28(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝11.6HZ,1H),5.31-5.25(m,1H),3.35(s,3H),2.15-2.10(m,1H),1.34(d,J＝6.4Hz,6H),0.98-0.93(m,2H),0.83-0.79(m,2H).实施例5化合物Z-5以化合物6-a为起始原料，参照实施例4的方法进行制备，不同的是将步骤中的化合物4-a换成化合物5-a。实施例65-环己烯基-4-((3,4-二氯苯氧基)乙基)-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-7)的制备以化合物6-b(471mg)为原料参考实施例6步骤2的合成方法，不同的是将步骤中4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯换成2-环己基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环。得到黄色化合物z-7(36.8mg)，产率42％，MSm/z(ESI):472.0[M+H]+。1HNMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.47(d,J＝7.2Hz,1H),7.25-7.34(m,2H),7.01(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),5.60(br.s.,1H),5.07(s,2H),3.04(s,3H),2.17-2.24(m,2H),2.04-2.12(m,2H),1.64-1.74(m,2H),1.49-1.64(m,2H)。实施例74-((5-氯-6-异丙基吡啶-3-基氧基)甲基)-5-环丙基-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-8)的制备步骤1：向化合物2-a(86mg，0.46mmol)的8ml乙腈溶液中加入化合物1-a-4(178mg，0.46mmol)，碳酸钾(128mg，0.92mmol)，80℃搅拌4小时。反应结束，冷却至室温，过滤，滤饼加入盐酸(3N，5ml)，乙酸乙酯萃取，有机相减压浓缩得黄色固体化合物8-b(130mg)。MSm/z(ESI):495.0[M+H]+。直接用于下一步反应。步骤2：向化合物8-b(117mg，0.32mmol)的甲苯和水中加入环丙基硼酸(68mg，0.32mmol)，三环己基膦(89mg，0.64mmol)，碳酸钾(89mg，0.64mmol)，醋酸钯(89mg，0.64mmol)，氩气保护，100℃搅拌1小时。反应结束，冷却至室温，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和碳酸氢钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得粗品。经制备液相分离纯化后得白色固体化合物Z-8(18mg)，产率：18％，MSm/z(ESI):457.1[M+H]+。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.97(d,J＝2.5Hz,1H),7.81(d,J＝2.5Hz,1H),7.31(d,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝11.5Hz,1H),5.27(s,2H),5.23-5.18(m,1H),2.83(s,3H),2.01-1.96(m,1H),1.30(d,J＝6.0Hz,6H),0.94-0.91(m,2H),0.62-0.60(m,2H).实施例84-((3-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)甲基)-5-环丙基-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-9)的制备步骤1：化合物3-氯-4-(三氟甲基)苯酚(200mg，1.017mmol)，化合物1-a-4(395mg，1.017mmol)，碳酸钾(218mg，2.035mmol)加入10ml乙腈溶液中，80摄氏度搅拌过夜。反应结束，冷却至室温，倒入水中，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得黄色固体化合物9-b(0.647g)。MSm/z(ESI):503.9[M-H]-。直接用于下一步反应。步骤2：化合物9-b(300mg，0.594mmol)，环丙基硼酸(103mg，1.189mmol)，Pd(dppf)Cl2(44mg，0.059mmol)，碳酸铯(388mg，1.189mmol)加入10ml二氧六环溶液中，氩气保护，80℃搅拌过夜。反应结束，冷却至室温，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，经Combi-flash柱层析纯化得到粗品，加适量甲醇超声洗，过滤得白色固体化合物z-9(37mg)。产率：12％，MSm/z(ESI):464.0[M-H]-。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ12.26(s,1H),7.82(d,J＝9.0Hz,1H),7.52(d,J＝2.5Hz,1H),7.45(d,J＝11.5Hz,1H),7.30(d,J＝7.0Hz,1H),7.25(dd,J＝2.0,9.0Hz,1H),5.44(s,2H),3.37(s,3H),2.05-2.01(m,1H),0.98-0.94(m,2H),0.78-0.74(m,2H).实施例9-11化合物Z-10，Z-11，Z-12以化合物1-a-4为起始原料，参照实施例9的方法进行制备，不同的是将步骤1中的3-氯-4-(三氟甲基)苯酚分别换成4-氯苯酚，3-氯-4-氟苯酚，2-氯-4-(三氟甲基)苯酚。实施例124-((3-氯-4-异丙基苯氧基)甲基)-5-环丙基-2-氟-N-(甲基磺酰基)苯甲酰胺(Z-13)的制备步骤1：向对苯二酚(2g，0.018mol)和化合物2-碘丙烷(3.072g，0.018mol)的20ml乙醇回流溶液中加入氢氧化钾(1.070g，0.019mol)的10ml水溶液，回流搅拌过夜。反应结束，冷却至室温，减压浓缩，加入2N盐酸，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得粗品，经Combi-flash柱层析纯化得到黄色油状化合物13-b(1.031g)。纯度：89.84％，产率：37％，直接用于下一步反应。步骤2：向化合物13-b(330mg，2.168mmol)的5ml三氯甲烷溶液中逐滴加入乙酰氯(189mg，2.602mmol)，室温搅拌6小时。反应结束，逐滴加入适量碳酸氢钠溶液，分离有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得黄色油状粗品化合物13-c(400mg)。产率：95％，直接用于下一步反应。步骤3：向化合物13-c(300mg，1.544mmol)的10ml乙腈溶液中逐滴加入N-氯代丁二酰亚胺(309mg，2.317mmol)，室温搅拌过夜。反应结束，加入饱和食盐水洗，分离有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得黄色油状粗品化合物13-d(435mg)。直接用于下一步反应。步骤4：向化合物13-d(378mg，1.653mmol)的5ml甲醇溶液中加入氢氧化钾(92mg，1.818mmol)的1ml水溶液，室温搅拌3小时。反应结束，加入适量1M盐酸溶液，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得棕色油状粗品化合物13-e(283mg)。产率：91％，直接用于下一步反应。步骤5：化合物13-e(180mg，0.964mmol)，化合物1-a-4(375mg，0.964mmol)，碳酸钾(267mg，1.929mmol)加入5ml乙腈溶液中，80摄氏度搅拌过夜。反应结束，冷却至室温，加入适量1M盐酸溶液，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得黄色固体粗品化合物13-f(382mg)。产率：80％，MSm/z(ESI):494.0[M-H]-。直接用于下一步反应。步骤6：化合物13-f(382mg，0.772mmol)，环丙基硼酸(221mg，1.544mmol)，醋酸钯(29mg，0.077mmol)，三环己基膦(72mg，0.154mmol)，碳酸钾(355mg，1.544mmol)加入甲苯/水(5ml/0.2ml)溶液中，氩气保护，90℃搅拌过夜。反应结束，冷却至室温，硅藻土过滤，滤液减压浓缩得粗品，经Combi-flash柱层析纯化得到粗品，再经制备液相分离纯化后得白色固体化合物Z-13(33.54mg)，产率：5％，MSm/z(ESI):454.1[M-H]-。1HNMR(500MHz,DMSO-d6):δ7.31(d,J＝7.0Hz,1H),7.19(d,J＝3.0Hz,1H),7.16(d,J＝11.0Hz,1H),7.12(d,J＝9.5Hz,1H),7.09(brs,4H),6.98(dd,J＝3.0,9.0Hz,1H),5.21(s,2H),4.53-4.46(m,1H),2.87(s,3H),2.02-1.95(m,1H),1.26(d,J＝6.0Hz,6H),0.95-0.90(m,2H),0.64-0.60(m,2H).化合物Z-0的制备步骤1：将化合物Z-0-1(20.0g,155mmol)溶解在叔丁醇(150mL)中，冷却到0℃，氮气保护下加入叠氮磷酸二苯酯(47g,170mmol),三乙胺(17.3g,170mmol)。混合物回流搅拌18h后，用旋转蒸发仪旋干。残留物溶解在二氯甲烷(400mL)中，用水(200mLx2)，食盐水(200mL)洗。无水硫酸钠干燥，抽滤。滤液用旋转蒸发仪旋干，残留物用柱层析(PE:EA＝3:1)纯化后得浅黄色固体Z-0-2(15.2g,收率:49％).ESI-MS(M-55)+:145,纯度＝97％(UV214)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ：8.85(brs,1H),8.61(d,1H),7.32(s,1H),1.55(s,9H)。步骤2：在N2保护下，将Z-0-2(8.0g，0.04mol)溶解在无水THF(80ml)中，混合物冷却到-78℃，滴加LiHMDS(1M，48ml，0.048mol)的THF溶液。滴加完成后，混合物在-78℃，搅拌0.5h。将反应液慢慢升温至室温，搅拌1h，然后降温至-78℃，将5-氯-2,4-二氟苯磺酰氯(11.11g，0.048mol)的THF(50ml)溶液滴加到上述反应液。混合物在-78℃，搅拌1h后升至室温，并在室温搅拌16h。向反应液中加入饱和氯化铵水溶液(250ml)中,用乙酸乙酯(3x100ml)萃取,合并有机相，用饱和食盐水(200ml)洗，干燥，40℃旋干。粗品过柱(100-200目硅胶),淋洗液为石油醚：乙酸乙酯＝(4:1)，得到Z-0-3(5.11g,产率：31.8％)为白色固体。ESI-MS(M+Na)+:434.0，纯度:95.9％(UV214)。步骤3：将化合物Z-0-4(50.8g,254mmol)溶解在THF(600mL)中，在冰浴中冷却至0℃搅拌，分批加入氢化锂铝(8.4g,220mmol)。混合物在0℃搅拌2h后，加水淬灭反应，加盐酸(6N)调节PH＝3,分离水相，有机相无水硫酸钠干燥，抽滤。滤液用旋转蒸发仪旋干，得白色固体Z-0-5(32.0g,收率:73.5％).1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.22–7.16(m,1H),6.77(d,J＝8.7Hz,1H),4.61(d,J＝3.7Hz,2H),3.82(s,3H),2.63(s,1H).步骤4：将化合物Z-0-5(32.0g,190mmol)溶解在二氯甲烷(400mL)中，然后加入氯化亚砜(50mL)。混合物在氮气保护下，加热至回流搅拌3h。混合物降至室温，加水(200mL)淬灭反应，分离有机相，水相用二氯甲烷萃取(200x2mL)。合并有机相用食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤。滤液用旋转蒸发仪旋干，得红色固体Z-0-6(33.0g,收率:92.2％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(d,J＝2.6Hz,1H),7.25(dd,J＝8.7,2.7Hz,1H),6.81(d,J＝8.8Hz,1H),4.59(s,2H),3.86(s,3H).步骤5：将化合物Z-0-6(32g,168mmol)溶解在DMSO(200mL)中，加入氰化钠(29g,606mmol)。混合物在氮气保护下，加热至80℃搅拌3h。反应混合物冷却至室温，加水分散，抽滤。滤饼用少量水洗涤。风干得桔红色固体Z-0-7(31g,收率:98.3％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.35(d,J＝2.5Hz,1H),7.28(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),6.82(d,J＝8.7Hz,1H),3.86(s,3H),3.66(s,2H).步骤6：将化合物Z-0-7(32g,177mmol)溶解在甲酸甲酯(400mL)中，加入钠(8.14g,354mmol)。混合物在氮气保护下，加热回流搅拌24h。反应混合物冷却至室温，加水淬灭反应，乙酸乙酯提取(400x2mL)，合并有机相水洗(200x2mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤。减压蒸干得黄色固体Z-0-8(10.5g,收率:28.4％)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.91(s,1H),7.71(d,J＝93.3Hz,1H),7.40–7.32(m,1H),7.29(dd,J＝12.2,2.6Hz,1H),7.08(dd,J＝8.7,3.1Hz,1H),3.82(s,3H)。步骤7：将化合物Z-0-8(10.5g,50.2mmol)溶解在乙醇(150mL)中，加入叔丁基肼(7.5g,60.3mmol)。混合物在氮气保护下，加热回流搅拌3.5h。反应混合物冷却至室温，减压蒸干得黄色固体(15g)，快速柱层析得黄色固体Z-0-9(14.0g,收率:99.9％)。步骤8：将化合物Z-0-9(13.5g,48.4mmol)溶解在二氯甲烷(300mL)中，在冰浴中冷却至0℃，加入三氟乙酸酐(30.5g,145.2mmol)，三乙胺(14.7g,145.2mmol)。混合物在氮气保护下，升至室温搅拌4h。反应混合物加入碳酸钠淬灭反应至中性，分离水相，有机相用饱和食盐水洗涤(100x2mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤。减压蒸干得棕色固体Z-0-10(12.0g,收率:66.1％)。ESI-MS(M-H):376,纯度＝89.23％(UV254).步骤9：将化合物Z-0-10(11.0g,29.3mmol)溶解在二氯甲烷(200mL)中，在冰浴中冷却至0℃，加入三溴化硼(36.7g,146.6mmol)。混合物在氮气保护下，升至室温搅拌4h。反应混合物慢慢加入冰水(100mL)，分离水相，有机相用饱和食盐水洗涤(100x2mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤。减压蒸干得棕色固体Z-0-11(6.3g,收率:68.9％)。ESI-MS(M-H):362,纯度＝80.83％(UV254).步骤10：将化合物Z-0-11(25.0g,69mmol)溶解在甲醇(100mL)中，盐酸二氧六环溶液(4M/L,100mL)。混合物在70℃搅拌18h。冷却至室温后，旋干。将氨的甲醇(50mL)溶液慢慢加入到残留物(100mL)，40℃旋干。粗品过柱(100-200目硅胶),淋洗液为二氯甲烷：甲醇(10:1)，得到灰色固体Z-0-12(8.0g,收率:38％)。ESI-MS(M-H):210.1,纯度＝90％(UV214)。步骤11：将化合物Z-0-12(4.18g,20mmol)，Z-0-3(8.20g,20mmol)，碳酸钾(8.28g,60mmol)溶解在DMF(100mL)中，混合物在氮气保护下，加热至40℃搅拌18h。反应混合物加入水(500mL)，二氯甲烷萃取(200mLx3)，合并有机相用水洗(100mLx2)，饱和食盐水洗涤(100x2mL)，无水硫酸钠干燥，抽滤。减压蒸干得红色固体Z-0-13(15.1g,收率:>100％)。ESI-MS(M+H)+:600.1,纯度＝28％(UV254).步骤12：将化合物Z-0-13(12.0g,20mmol)溶解在二氯甲烷(40mL)中，加入三氟乙酸(20mL)。混合物在氮气保护下，室温下搅拌24h。减压蒸干得粗产物为黄色固体，经HPLC制备得类白色固体粉末Z-0(3.04mg,收率:31％)。ESI-MS(M+H)+:499.8,纯度＝100％(UV254)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ11.56(s,2H),8.91(d,J＝2.4Hz,1H),7.90(d,J＝6.8Hz,1H),7.69(s,1H),7.43(s,1H),7.32(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.22(dd,J＝8.4Hz,1H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.73(d,J＝10.8Hz,1H),4.92(s,2H)。电生理学测定测试例1hNav1.7、hNav1.5和hNav1.2通道的手动膜片钳实验膜片电压钳电生理学可以直接测量并定量电压门控钠通道(各种Nav)的电流阻断并可以测定阻断的时间和电压依赖，其已被解释为对钠通道的静息、开放和失活状态的结合差异来反映化合物的抑制或激活效应(Hille,B.,JournalofGeneralPhysiology(1977),69:497-515)。本发明代表性的化合物采用手动膜片钳实验进行，本研究的目的是应用手动膜片钳的方法在转染特定离子通道的稳定细胞株上测试化合物对该离子通道电流的作用。其使用的稳定细胞株CHO-hNav1.7和HEK-hNav1.5分别来自Genionics公司和WuXiApptec(上海)公司。手动膜片钳实验方案如下：(一)溶液及化合物的配制：采用全细胞膜片钳技术记录hNav1.7和hNav1.5电流。实验中，细胞外液的组成成分(mM)：HEPES：5,NaCl：40,KCl：3,CaCl2：1,MgCl2：1,CdCl2：0.1,TEA-Cl：20。用NaOH调节pH值至7.3，同时用蔗糖调节渗透压至310-320mOsm，过滤后4℃保存。细胞内液的组成成分(mM)：HEPES：10,NaCl：10,CsOH：5,CsF：140,EGTA：1。用CsOH调节pH值至7.3，同时用蔗糖调节渗透压至280-290mOsm，过滤后-20℃保存。阳性对照药和待测化合物先溶于100％DMSO(Sigma-Aldrich,D2650，配置成一定浓度(100nM，1000nM)的储备溶液。实验前用DMSO将上述储备溶液进行系列稀释，然后再用细胞外液进一步稀释得到所需浓度的测试溶液。细胞外液中DMSO最终浓度不超过0.30％。(二)手动膜片钳实验：取细胞悬液加于35mm的培养皿中，置于倒置显微镜载物台上。待细胞贴壁后，用细胞外液灌流，流速为1–2mL/min。玻璃微电极由微电极拉制仪两步拉制，其入水电阻值为2-5MΩ。通过Digidata1440(MolecularDevices)和pCLAMP软件(10.2版，MolecularDevices)A/D–D/A数模转换，进行刺激发放及信号采集；膜片钳放大器(Multiclamp700B，MolecularDevices)放大信号，滤波为4KHz。在hNav1.7和hNav1.5手动膜片钳实验中运用两种不同的电压刺激程序。一种是失活刺激程序，钳制电位设置在相对应通道的V1/2，即大约50％的通道处于失活状态。接着给予电压至-120mV，持续50ms。然后去极化至-10mV，持续20ms引出钠电流，最后回到钳制电位。这种刺激程序也可以称之为通道状态依赖的电压刺激程序。另一种是非失活刺激程序，保持钳制电位在-120mV,给予电压刺激至-10mV，持续20ms引出钠电流，最后回到钳制电位。也就是说在该种刺激程序条件下，所有的通道都没有经历过失活状态，而是直接从静息状态进行激活。上述两种电压刺激程序的时间间隔均为10s。化合物的抑制效应通过加药前后的电流变化来进行计算，而IC50数值由Hill方程进行拟合所得。如果化合物在上述两种不同的电压刺激下显示出对通道效应有一定倍数的差异，那么该化合物对该通道是具有状态依赖性的。数据分析将每一个药物浓度作用后的电流和空白对照电流标准化(化合物峰拖尾电流/对照物峰拖尾电流)，然后计算每一个药物浓度对应的抑制率(1-(化合物峰拖尾电流/对照物峰拖尾电流))。对每一个浓度计算平均数和标准误差，并用以下的方程计算每种化合物的半抑制浓度：抑制率＝1/(1+(IC50/c)h)用以上方程对剂量依赖效应进行非线性拟合，其中c代表药物浓度，IC50为的半抑制浓度，h代表希尔系数。曲线拟合以及IC50的计算利用IGOR软件完成。结果分别见表1和表2。表1本发明代表性化合物在两种浓度下对Nav1.7的抑制率表2本发明代表性化合物对Nav1.7和Nav1.5的IC50值化合物Nav1.7(IC50/nM)Nav1.5(IC50/nM)Nav1.5/Nav1.7Z-14.220047.6Z-28.4781095.6hNav1.2手动膜片钳实验细胞准备：NaV1.2基因信息：重组HEK293细胞系稳定表达人电压门控钠通道亚型1.2(hNaV1.2).cDNA严格遵循GenBank序列号:NM_001040142.1。稳定表达Nav1.2通道的HEK293细胞系在含有10％胎牛血清及1.2mg/mlG418的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1mlTrypLETMExpress溶液，37℃孵育1分钟。当细胞从皿底脱离，加入5ml37℃预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rmp离心5分钟收集细胞。扩增或维持培养，将细胞接种于10厘米细胞培养皿，每个细胞培养皿，接种细胞量为3.5*105(最终体积：10ml)。为维持细胞的电生理活性，细胞密度必须不能超过80％。膜片钳检测，实验之前细胞用TrypLETMExpress分离，将3*103细胞铺到盖玻片上，在24孔板中培养(最终体积：500μl)，18个小时后，进实验检测。膜片钳实验方法：用微电极拉制仪(P97，SutterInstruments)将毛细玻璃管(BF150-86-10，SutterInstruments)拉制成记录电极。在倒置显微镜(IX71，Olympus)下操纵微电极操纵仪(MP285，SutterInstruments)将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻，并给以串联电阻补偿，不给予漏电补偿。当全细胞记录的电流稳定后开始记录。实验数据由EPC-10放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster(HEKA)软件中。当全细胞记录的电流稳定后开始给药，每个药物浓度作用至5分钟(或者电流至稳定)，每一个测试化合物检测1000nM浓度值。将铺有细胞的盖玻片置于倒置显微中的记录浴槽中，测试化合物以及不含化合物的外液利用重力灌流的方法从低浓度到高浓度依次流经记录小室从而作用于细胞，在记录中利用真空泵进行液体交换。每一个细胞在不含化合物的外液中检测到的电流作为自己的对照组。独立重复检测3个细胞。所有电生理实验在室温下进行。钠离子通道记录所用液体：细胞外液:140mMNaCl、4mMKCl、1mMMgCl2、2mMCaCl2、5mMD-一水葡萄糖、10mMHEPES(pH＝7.4NaOH调节)。细胞内液液:145mMCsCl、0.1mMCaCl2、2mMMgCl2、10mMNaCl、0.5mMNa2-GTP、2mMMg-ATP、1.1mMEGTA、10mMHEPES(pH7.2CsOH调节)。钠离子通道的刺激方案:首先将细胞的膜电位维持在-90mV，然后以5mv的阶跃间隔，将细胞膜电位阶跃至-120mV至100mV。通过上述公式计算抑制率结果如表a所示。表a同种浓度下Nav1.7和Nav1.2的抑制率比较化合物(Z-2)1000nM(％)Nav1.798.20Nav1.235.00从表1、表2和表a可以看出，本发明代表性化合物对Nav1.7具有较高的抑制活性，对Nav1.5和Nav1.2的抑制活性明显较弱，因此本发明代表性化合物不仅对Nav1.5而且对Nav1.2均具有选择性。测试例2冷刺激痛觉超敏法实验动物为雄性Sprague-Dawley大鼠，实验开始时体重140-150g。实验用动物均采购于斯莱g公司，购买后采用自由采食的方式进行食物和水供应，分笼饲养，4只/笼，采用动物尾部标记法l进行动物标记。检测化合物及分组：溶剂对照物(Vehicle)：5％二甲基乙酰胺(国药科技)、5％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(solutol)(Sigma)和90％生理盐水阳性对照物：化合物Z-0；待测药物：化合物Z-2；阳性对照物和待测药物的溶剂成分为5％二甲基乙酰胺,5％聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯和90％生理盐水。口服2小时后，Z-2100mg/kg剂量抑制大鼠脊神经结扎诱导的冷痛觉超敏。Z-075mg/kg和100mg/kg剂量抑制大鼠脊神经结扎诱导的冷痛觉超敏。如表3所示。表3化合物在脊神经结扎大鼠中药效测试分组实验方法：1.1.脊神经结扎模型·手术过程执行无菌操作。·手术器械(剪刀，镊子，手术刀，手术棉，缝合线，撑开器)在手术前已消毒。·使用戊巴比妥那(50mg/kg,腹腔注射)麻醉动物。挤压动物脚趾以确认动物手术前已经完全麻醉。在动物眼部涂抹眼用软膏以防止动物角膜干燥。·剃去动物下半身手术区域毛发，使用碘伏和70％乙醇对手术区域皮肤消毒三遍。待皮肤干燥后开始手术。·使用手术刀在动物腰部荐骨后部开一纵向切口，暴露左侧椎旁肌，使用撑开器分离肌肉组织以暴露脊椎骨。·分离左侧脊神经L5和L6，使用6-0丝线结扎。·缝合伤口。·清洁手术器械，使用热珠灭菌器灭菌。·手术后将动物放置在电热毯上，皮下注射5mL生理盐水以防止脱水。等动物完全苏醒后(可自由活动)将动物放回笼中。1.2.冷痛觉超敏基线测试和分组给药前两天，对大鼠进行冷痛觉超敏基线测试，使用移液器将100μl丙酮涂在动物术侧后足部皮肤。记录动物在一分钟内拍打，缩脚，抬脚，舔舐术侧足部的时间。丙酮测试共进行两次，两次间隔10分钟。两次时间之和记录为大鼠冷痛觉超敏反应时间。根据给药前一天的冷痛觉超敏反应测试结果将动物随机分组。1.3.冷痛觉超敏测试给药两小时后，使用移液器将100μl丙酮涂在动物术侧后脚趾部皮肤。记录动物在一分钟内拍打，缩脚，抬脚，舔舐受影响的脚部的时间。丙酮测试共进行两次，两次间隔10分钟。两次时间之和记录为大鼠冷痛觉超敏反应时间。1.4.给药冷刺激痛觉测试2小时前口服给药。其中给药记录和动物体重如表4所示：表4给药记录和动物体重表5大鼠冷痛觉超敏测试结果1.5.数据收集和分析使用Excel软件收集数据。使用Prism软件分析数据。实验结果如图1和图2所示，结果表明本发明示例化合物Z-2在脊神经结扎大鼠模型中具有抑制冷刺激痛觉超敏效果，在大鼠体内神经痛模型中是有统计学意义的抑制效果。图2中，与溶剂对照物比较，使用单因素方差分析附加Dunnett多重比较检验，***p<0.001，口服化合物Z-2和化合物Z-0(100mg/kg和75mg/kg)两小时后分别抑制大鼠脊神经结扎诱导的冷痛觉超敏。测试例3：大鼠体内试验应用LC/MS/MS法测定了大鼠分别灌胃和静注给予实施例化合物后不同时刻血浆中的药物浓度，研究本发明化合物在大鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。实验方案：试验动物：健康成年雄性SD大鼠(体重215-225g，6只，禁食)，由斯莱克公司提供；给药方式与剂量：给予SD大鼠足背静脉给药(1mg/kg，1mL/kg，5％DMAC(二甲基乙酰胺),5％SolutolHS15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)和90％盐水和灌胃给药(2mg/kg，2mL/kg，0.5％CMC-Na水溶液)血样采集：首先对给药前挑选符合实验要求的动物，称重标记。采集血样前，绑定大鼠，每一只给药的大鼠在预定的采血时间点(静脉给药：分别于给药前，给药后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24h采血，共9个时间点；灌胃给药：分别于给药前，给药后的0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24h采血，共9个时间点)，通过尾静脉采血，或经心脏采血(终末采血)约150μL。通过眼眶采血，或经心脏采血(终末采血)约150μL。血液转移至预先加入K2EDTA的1.5mL试管中。采完的血样放在湿冰上，离心5min(2000g,4℃)，取出血浆，整个过程在采血后15min内完成。所有的样品都需要存放于-70℃冰箱直到样品分析。应用LC/MS/MS法测定药物浓度，本发明部分实施例化合物在相同剂量和给药方式下，大鼠体内的药代动力学性质参数如表6所示：表6化合物在大鼠体内药代动力学参数从表6可以看出，本发明示例化合物的药代吸收好，具有明显的药代吸收效果，同时表现出良好的生物利用度。测试例4：代谢稳定性测试1.缓冲液的配制缓冲液A：配制1L含有1mMEDTA(Sigma，V900157-100G)，100mM的磷酸二氢钾溶液。缓冲液B：配制1L含有1mMEDTA，100mM的磷酸氢二钾溶液。缓冲液C：取700mL缓冲液B，用缓冲液A滴定，调至PH为7.4即可。2.待测化合物和阳性对照药(酮色林(SigmaS006-10MG))的配制2.1取10mM待测化合物和10mM酮色林各10uL，再各加190uL的纯乙腈，分别配成500uM待测化合物和酮色林溶液。2.2取20uL(20mg/mL)肝微粒体(CorningLot.452161)和大鼠肝微粒体(CorningLot.452501)储存液分别加入到513.4uL的缓冲液C，在湿冰上操作。配制得到0.75mg/mL肝微粒体溶液。2.3各取1.5uL上述待测化合物和酮色林溶液，分别加入到498.5uL(0.75mg/mL)的肝微粒体溶液中，在湿冰上操作。配制得到1.5uM待测化合物混合液和酮色林混合液。2.4按照时间点0、5、15、30、45、60min，每孔30uL，分别将待测化合物混合液和酮色林混合液分装到反应板上，在湿冰上操作。2.5称取5mg还原型辅酶Ⅱ(Roche，10621706001)，溶于1mL缓冲液C中。配制成6mM还原型辅酶Ⅱ溶液。将还原型辅酶Ⅱ溶液分装到反应板中。2.6将丙米嗪溶成10mM的溶液，取100mL空白乙腈，加入10uL丙米嗪溶液。配成内标。2.7在0min，每孔加入135uL含有内标的冰乙腈(Merck(Lot.1778229518))，再加入15uL缓冲液C。2.8将反应板放入37度水浴恒温箱内预热5min。在反应板中，每孔加15uL还原型辅酶Ⅱ溶液开始反应并计时。在5、15、30、45、60min时间点，每孔加入135uL含有内标的冰乙腈终止反应。2.9将反应板用铝膜封好，放在震荡混合器上，500rpm，5min。再将反应板放在离心机中离心，15min，3750rpm。2.10取样品和纯水按照1:1比例稀释，LC/MS检测。将得到的数值按照以下公式计算得到如表7所示的半衰期和清除率。半衰期：0.693/K(孵化时间与浓度对数值作图出来的斜率)清除率：(0.693/半衰期)*(1/蛋白质浓度(0.5mg\mL))*(比例因子)其中K值和比例因子为本领域技术人员根据现有方法以及肝微粒体产品说明书记载的方法计算得到的。表7大鼠和人肝微粒体代谢稳定性实验结果从表7可以看出，结构的不同对代谢稳定性有较明显的影响，将R2的环丙基换成环己烯基后，大鼠和人的代谢稳定性明显降低，此外与氧直接相连的基团换成吡啶基后，代谢稳定性也明显降低。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 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