一种检测特发性肺纤维化致病基因的DNA文库及其应用的制作方法

本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断特发性肺纤维化致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据特发性肺纤维化致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确特发性肺纤维化的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术：
：特发性肺纤维化(idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)是一种原因不明、出现在成人、局限于肺、进行性致纤维化的间质性肺炎，其组织病理学和放射学表现为普通型间质性肺炎。特发性肺纤维化在人群中的发病率为(6.8～16.3)/10万，患者预后通常不佳，诊断后中位生存期仅3～5年。患者病程晚期将面临肺移植，由特发性肺纤维化死亡导致死亡率增加的影响甚至高于某些癌症。在特发性肺纤维化患者中，一部分已明确其发病是因为遗传因素所导致，遗传模式通常为常染色体显性遗传，即：这部分特发性肺纤维化病人有50％可能性将疾病遗传给下一代，给家庭和社会带来巨大的精神压力和经济负担。目前，研究已发现数个特发性肺纤维化的致病基因，只要其中任意一种基因发生功能性突变，即可引起疾病表型，即：同一种遗传性特发性肺纤维化可以由多种遗传因素所导致。除此之外，同一患者如果携带了一个以上的致病基因突变，其临床表现和预后与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是遗传性特发性肺纤维化精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。临床上现有的特发性肺纤维化的常规诊断技术，主要包括：经支气管镜肺活检或支气管肺泡灌洗细胞分析，影像学检查和血清学检查三大类。经支气管镜肺活检或支气管肺泡灌洗细胞分析前者均会给患者带来痛苦，基础状态不好的患者甚至不能耐受。影像学检查和血清学检查可以为诊断特发性肺纤维化提供帮助，但是这两种检查缺乏特异性，不能彻底将特发性肺纤维化与其类似的结缔组织病等其他疾病区分开来。同时，传统的基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足多基因检测区域和多样本检测时效性的要求。因此，有必要寻求一种新的检测特发性肺纤维化致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。技术实现要素：为实现上述目的，本发明提供一种特发性肺纤维化的致病基因的DNA文库，其中所述文库包括序号为1-81的至少一个基因。表1：特发性肺纤维化的致病基因1表2：特发性肺纤维化的致病基因2序号基因名OMIM编号关联疾病82ELMOD2610196特发性肺纤维化，家族性肺纤维化83SFTPA1178630特发性肺纤维化，家族性肺纤维化84SFTPA2178642特发性肺纤维化，家族性肺纤维化85SFTPC178620特发性肺纤维化，家族性肺纤维化86ABCA3601615特发性肺纤维化，呼吸窘迫综合症87RTEL1608833特发性肺纤维化，家族性肺纤维化88TERC602322特发性肺纤维化，家族性肺纤维化89TERT187270特发性肺纤维化，家族性肺纤维化90PARN604212特发性肺纤维化，家族性肺纤维化91MUC5B600770特发性肺纤维化92TOLLIP606277特发性肺纤维化注：*标注的号码为pubmed数据库的基因ID，该基因尚未收录与OMIM数据库，暂无OMIM编号。优选的，所述DNA文库包括下列多组基因：序号为1-15的基因。优选的，所述DNA文库包括序号为1-81的基因。更优选的，所述DNA文库还包括序号为82-92的至少一个基因。更优选的，所述DNA文库包括序号为1-15，82-92的基因。最优选的，所述DNA文库包括序号为1-92的基因。本发明还提供一种上述任意DNA文库的检测试剂。优选的，所述检测试剂是能扩增上述DNA文库的引物。更优选的，所述引物为，根据上述DNA文库，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，从而能对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增。优选的，所述毗邻调控区域为每个外显子边缘至少5bp区域。优选的，所述引物池通过软件进行超多重PCR扩增设计，使得每一个反应管中一次扩增即可同步平行扩增数千个扩增子，从而对目标区域进行操作简便的高效率扩增。本发明还提供一种上述DNA文库或者DNA文库的检测试剂在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断特发性肺纤维化。本发明还提供一种上述DNA文库或者DNA文库的检测试剂在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断特发性肺纤维化。优选的，所述诊断装置是基因芯片。进一步，所述应用包括下列步骤：(1)提供受试者样本的基因组DNA；(2)从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖上述致病基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序；(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。更优选的，所述应用进一步用于判断临床预后，例如：通过基因诊断发现ABCA3、SFTPA1、SFTPA2、SFTPC基因受累的患者，发病可能较早，可以在40岁以前就发病。而相应TERC、TERT基因受累的患者，则发病较晚，相应症状较轻。根据基因诊断结果，有助于对不同的患者进行针对性的不同的临床决策，精准医疗。本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述特发性肺纤维化的致病基因的DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂。本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述特发性肺纤维化的致病基因的DNA文库或者上述DNA文库的检测试剂。优选的，所述装置为基因芯片。优选的，所述检测试剂是能扩增上述DNA文库的引物。更优选的，所述引物为，根据上述DNA文库，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，从而能对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增。优选的，所述毗邻调控区域为每个外显子边缘至少5bp区域。优选的，所述引物池通过软件进行超多重PCR扩增设计，使得每一个反应管中一次扩增即可同步平行扩增数千个扩增子，从而对目标区域进行操作简便的高效率扩增。本发明提供一种使用上述DNA文库、检测试剂、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行检测的方法，所述方法包括下列步骤：(1)提供受试者样本的基因组DNA；(2)从IonTorrentTM高通量测序平台自动合成覆盖上述致病基因的扩增引物池，对目标区域进行超多重PCR扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增,该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序；(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。(12)受试者样本中若存在上述致病基因的突变体，可指导临床医生综合临床表现来诊断特发性肺纤维化。优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。更优选的，所述方法进一步用于判断临床预后，例如：通过基因诊断发现ABCA3、SFTPA1、SFTPA2、SFTPC基因受累的患者，发病可能较早，可以在40岁以前就发病。而相应TERC、TERT基因受累的患者，则发病较晚，相应症状较轻。根据基因诊断结果，有助于对不同的患者进行针对性的不同的临床决策，精准医疗。采用本发明的DNA文库对特发性肺纤维化患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：1.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案和针对性随访计划：例如：通过基因诊断发现ABCA3、SFTPA1、SFTPA2、SFTPC基因受累的患者，发病可能较早，可以在40岁以前就发病，症状也较重，预后更差。而相应TERC、TERT基因受累的患者，则发病较晚，相应症状较轻。根据基因诊断结果，有助于对不同的患者进行针对性的不同的临床决策(如：肺移植)。本发明可以首次最快捷和全面的一次性检测全部特发性肺纤维化致病基因，能对患者做出最全面的分子诊断，实现精准医疗。2.本申请的DNA文库是申请人从众多的遗传性特发性肺纤维化及其鉴别诊断类似疾病致病基因中选择的92个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测；目前国际上缺乏大规模的中国黄色人群特发性肺纤维化基因诊断相关信息，绝大多数已知特发性肺纤维化致病基因都主要来自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期的临床观察和大规模中国黄色人种特发性肺纤维化的基因诊断研究，总结和发掘了一系列中国黄色人种特发性肺纤维化患者的致病基因，并对国际上已经报道的致病基因在中国患者中的发病频率以及致病性进行了观察和验证。本发明所选的92个基因中的绝大多数基因均为发明人在黄色人种中验证和发现的致病基因。3.本发明的DNA文库能够检测所有目前已知的造成特发性肺纤维化的遗传缺陷，并且覆盖了特发性肺纤维化鉴别诊断的主要疾病，能够准确全面筛查所有致病基因，快速找到致病突变。针对造成类似特发性肺纤维化的综合症性疾病也能快速检测和鉴别诊断，从而指导临床选择不同的治疗策略；4.本发明中采用基于IonTorrentTM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的92个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到50人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到98.42％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；5.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因特发性肺纤维化患者面临未来肺移植的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。特发性肺纤维化多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。6.优选的，本发明的DNA文库及其应用覆盖各种已知病因的遗传性特发肺纤维化的检测，包含92个特发性肺纤维化致病相关基因的DNA文库。这92个基因选择基于基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)、公开发表的文献以及发明者自己的课题研究内容。这92个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序,是目前已知针对特发性肺纤维化基因覆盖最全面的一种靶向测序检测。综合来看，本发明中涉及的DNA文库、DNA文库的检测试剂及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对特发性肺纤维化具有很好的辅助诊断价值。附图说明图1一次IonTorrentTM高通量测序反应的数据采集概要图；图2一次对92个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。实施例11.该方法中所用到的试剂：IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0，IonPITMHi-QTMOT2200Kit，IonPITMHi-QTMSequencing200Kit，IonXpressBarcodeAdaptors1-16Kit，IonPITMChipv32.标本采集和保存(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。3.检测步骤和结果分析：(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的92个基因全外显子为检测区域，基于IonAmpliSeqTMDesigner自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:a.目标区域的扩增：反应条件：b.扩增产物二合一，酶切：反应条件：c.连接接头：反应条件：22℃30min72℃10min10℃Upto1hd.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：反应条件：e.片段选择：片段选择步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit2.0Fluorometer定量后即建库完成。(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照IonPITMHi-QTMOT2200Kit及IonPITMHi-QTMSequencing200Kit操作手册进行：a.油包水PCR反应：将上述反应体系加入IonOneTouch2中进行油包水PCR反应。b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的IonSphereParticles经过IonOnetouchES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序仪进行测序。(4)数据分析：测序数据经过coverageanalysis和variantcaller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过IonReporter在线注释后，得到对遗传性血管疾病诊断有意义的突变位点。(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。结果说明及分析通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对10个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为15G(TotalBase)，能够总共得到95,762,858的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为151bp。10个标本平均能够被测到4,026,437(3,576,013-5,113,131)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variantCaller分析，每个标本平均有387个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过IonReporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4例举的那样，图4箭头所指处显示RTEL1基因c.3631C>T(p.Gln1211Ter)杂合突变,最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床特发性肺纤维化提供诊断依据。也为患者家族中带有该突变尚未有临床症状的下一代提供诊断依据及治疗依据。本发明的临床应用例证利用本发明所提供的方法，对200名患有特发性肺纤维化但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出特发性肺纤维化85例，症状类似的结缔组织病或系统性综合征12例。该方法对特发性肺纤维化检出的总阳性率达到48.5％，结合临床影像学检查，肺组织活检结果，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的91.85％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对特发性肺纤维化的诊断和鉴别诊断有着重要意义和实用价值。实施例2：本发明中引物池里包含发明者新发现的特发性肺纤维化致病基因81个，如上文的表1。新发现的81个特发性肺纤维化致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的特发性肺纤维化致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国黄色人种病人大样本量病例样本库中对候选的致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述81个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中出现完全共分离。实施例3：利用本发明所提供的方法，使用92个基因文库，对200名患有特发性肺纤维化但病因不明确的患者进行了基因检测。在携带有基因突变的特发性肺纤维化85例中进行分析，发现携带有两个或两个以上突变的患者为68例，其平均发病年龄为58.7岁，只携带有1个突变的患者为17例，其平均发病年龄为63.1岁。且只携带有1个突变的患者，其临床症状，肺弥散功能，明显优于携带有2个及以上突变的人群。当前第1页1 2 3